细胞培养的设备和操作技术.ppt

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1、细胞培养的设备和操作技术,第二章,主讲内容,实验室的设计和基本操作技术 培养基及其配制,第一部分 实验室的设计,细胞工程实验室它必须满足三个基本的需要，即： 实验准备（培养基配制，洗涤与灭菌）； 无菌操作； 控制培养。,从总体上来分，实验室主要分为两类： 基本实验室： 辅助实验室：,实验室设计,1、基本实验室： 准备室 接种室 培养室, 作用 植物细胞和组织培养所需器具的洗涤、干燥和保存；培养基的配制、分装和灭菌；化学试剂的配制；重蒸馏水的生产等。 设计要求 面积20m2左右。通风透光，地面防滑，墙面防潮。,准备室, 实验台架 大、小水槽 烘箱 冰箱 天平系列 pH计 高压消毒锅 各种玻璃器皿

2、 药品柜 （磁力）搅拌器 电炉 蒸馏水器, 设 备,其中：玻璃器皿包括三角瓶、试管、培养瓶、培养皿、烧杯、量筒、移液管等 移液枪（根据条件需要）由枪和枪头组成 其他：锅、微波炉等,磁力搅拌器,电子天平,万分之一,百分之一,pH计,微量移液器,蒸馏水器,接种室 也叫无菌操作室 无菌操作室并非无菌，但应该保持清洁 作用 供外植体的接种，培养物的转移和原生质体的游离培养操作之用。, 设计要求 墙壁光滑平整，地面平坦无缝，除出入口和通气口外，应当密闭，空气不能对流，或者空气经净化后进入室内。 无菌室旁边应设有缓冲间，缓冲间内应有紫外灯，随时可进行灭菌。,无菌室内的日常灭菌：定期用甲醛和高锰酸钾混合后熏

3、蒸，产生大量蒸汽，杀灭微生物。 使用前处理：用新洁尔灭（1：50）擦净，然后用紫外灯照射灭菌至少20分钟，操作前用70%酒精喷雾。,思考：紫外灯如何杀菌？操作中要注意什么？, 设 备, 紫外光灯 空调 放物架（或医用小平车：推送、放置培养基用；） 无菌操作用的器具：酒精灯、70%酒精消毒棉、解剖刀、弓背镊子、解剖针、剪刀等。, 超净工作台： 内设紫外灯、吹风装置、过滤装置等 每次实验前要用紫外灯灭菌20分钟以上，然后喷酒精灭菌，工作过程中注意一直开着吹风机，并且一定要关掉紫外灯，过滤网应经常清洗。,其它部件： 离心机：分离原生质体用； 点融合仪：细胞融合用。,离体组织和试管苗生长发育的场所，

4、应为培养物创造适宜的温、光、气等条件。 设计要求 培养室内要求内壁保温、光滑、室顶高2.6m左右，易于控制温、湿度，窗上要求装双层密封玻璃窗，室内有足够电源。, 作用, 设 备, 空调机：冷暖型 加热器 定时装置：控制光照时间 培养架：放置培养瓶 摇床和转床：悬浮培养 各种光质灯管：光照培养 温度计：控制温度 遮光帘：供暗培养之用,2、辅助实验室： 细胞学实验室 摄影室及暗室 生化分析室,细胞学实验室, 主要设备 各种显微镜，显微照相设备，切片、制片仪器设备，染色用具，暗房设备等。, 作 用,植物组织和细胞培养过程中，需随时观察记录其细胞学和形态解剖学的变化，故要设置细胞显微观察室。,细胞工程

5、实验室基本设备配制小结,基本设备：冰箱、天平、酸度计 灭菌设备：蒸汽压力灭菌锅、干热消毒柜、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。 无菌操作设备：净化工作台、接种箱, 光温控制设备：时间程序控制器、空调及温度感应器。 细胞培养设备：培养设备根据需要而定，包括培养架、培养箱、摇床、生物反应器等。 细胞学鉴定设备：光学研究显微镜、实体显微镜、倒置显微镜,第二部分 基本操作技术,基本操作技术主要是围绕无菌操作技术展开的一系列操作技能，内容主要包括： 一洗涤技术 二灭菌、消毒技术 三、接种技术,一、 洗涤技术,、洗涤目的：去除杂物，降低带菌量 、根据洗涤对象的不同，主要分为：,器皿洗涤（包括玻璃、塑料、搪

6、瓷、 不锈钢器皿）,培养材料洗涤,（一）器皿洗涤,根据洗涤对象的具体情况可分为以下三种：,特殊洗涤,微生物大量污染的洗涤,常规洗涤, 常规洗涤, 自来水洗去油渍、霉菌等脏物； 温肥皂水中浸泡一定时间后用刷子刷净； 自来水冲洗干净，至瓶壁不挂水珠为止； 蒸馏水淋洗内外壁 将玻璃器皿倒置：晾干或烘干（5075） 放入除尘柜中备用, 微生物大量污染的洗涤 微生物污染器皿加压灭菌后再洗涤,特殊洗涤（如沾有蛋白质类物质或其它有机物时) 经过常规洗涤未过蒸馏水的器具，浸泡入洗液（铬酸洗涤液是用重铬酸钾(K2Cr2O7)与硫酸(H2SO4)配制而成）中数分至数小时； 回收洗液，器具先用自来水洗净，蒸馏水淋洗

7、，烘干（75）,（二）、试验材料的清洗 清洗目的：来自自然界的试验材料，包括来自土壤中的幼茎、磷茎，滋生着各种微生物，尤其是细菌的芽孢和真菌的孢子，一旦与培养基接触，就会很快的繁殖起来，造成培养基和培养材料的污染。 清洗方法：先用自来水冲洗5分钟，然后用中性洗涤剂清洗，注意勿损伤试验材料。再用自来水流水冲洗半小时，用于下一步的药剂灭菌。,二、灭菌、消毒技术,（一）关于有菌和无菌的概念 有菌的范畴：,凡是暴露在空气中的物体，至少其表面都是有菌的，如植物的表面、超净工作台的台面，未处理的工具和手等。,高压高温处理（工具、器皿、培养基等） 物理或化学处理； 火烤后的物体； 健康的动植物不与内外部表面

8、接触的组织 内部可能是无菌的（有时也有内生菌，但 不会影响培养，也不会污染）,无菌的范畴：,（二）灭菌、消毒技术作用和意义 植物组培中，凡用于培养和无菌操作的房间、器具、培养瓶、培养基，培养材料和操作者的衣物和手都应随时进行灭菌，以确保不受杂菌污染，否则，由于杂菌的生长繁殖速度一般都比培养的组织快得多，最终将把组织全部杀死，这些污染微生物还可能排泄对植物组织有毒的代谢废物，因此在培养容器内部保持一个完全无菌的环境是绝对必须的。,（三）灭菌、消毒种类,物理方法： 物理灭菌：高温高压灭菌（干热/湿热）、烘烤或灼烧灭菌、射线处理、超声波等 物理除菌：过滤（0.1微米、0.22微米、0.45微米、0.

9、8微米等） 、离心沉淀等； 化学方法：使用灭菌剂，如薰蒸灭菌、消毒液灭菌（酒精、升汞、苯酚、漂白精、新洁尔灭、次氯酸钠、过氧化氢）, 消毒、灭菌的对象： 接种室 材料（外植体）： 完全杀死材料表面的微生物过程： 洗洁精酒精氯化汞等 器皿用具消毒（灭菌） 培养基,（三）、培养基、器具的灭菌 用灭菌锅灭菌：一般121，灭菌20分钟。自动锅：加足水后，调好时间、温度、即可自动运转。 手动锅:加足水后，关好，通电。待压力升到0.5kgc时，打开排气阀排除锅内的冷空气。然后关闭排气阀，升至1.1kg c(121 左右)时计时，用通电、断电来保持20分钟。待降至压力为0时取出。 器具的灭菌：也可用烘箱16

10、0 ，90120分钟,（四）、过滤除菌 培养基的灭菌一般用高压高温处理，但如果培养基中某些成分遇到高温分解（如某些激素GA3、玉米素等），就需要过滤灭菌或者两者结合。另外酶等也需要过滤灭菌； 灭菌方法：将激素或酶配成一定浓度，用注射器过虑，0.20.25微米。配制培养基时，先将培养基高压灭菌，待温度降至50左右时，加入适量的已过虑除菌的激素等，然后分装。,（五）、外植体的选择与消毒：,1、外植体的选择 选择优良的基因型：蔬菜等作物、花卉等观赏植 物等的脱毒快繁选优良种。 取材：从生长旺盛、健壮、无病虫害的植株上取 材。母株代谢旺盛期取的外植体再生能力强， 试验容易成功。 外植体大小选择：如利用

11、茎尖培养，脱毒快繁， 茎尖大小对脱毒效果非常明显。再如幼胚培养， 胚龄也非常重要。 选择外植体的时期,2、外植体的消毒：,取材 将老的组织去掉 自来水冲洗 洗衣粉水洗（简单杀菌） 自来水冲洗 70酒精处理 消毒剂处理 灭菌蒸馏水冲洗35遍。,消毒时间，因材料老嫩程度不同有所不同。一般，较老的材料相对杀菌时间较长，反之，较短。一般杀菌，酒精10秒，升汞512分钟。,外植体在接种之前，须经严格的灭菌，同时又要注意不损伤外植体。不同灭菌药剂杀菌力不同，故在使用不同的药剂时，需要考虑使用浓度和处理时间，对不同植物种类的不同外植体，处理也有不同。 另外，外植体在进入消毒剂之前，应认真取材及清洗，尽可能地

12、减少其带菌量。,外植体除菌注意事项：,消毒剂 使用浓度() 消毒时间(分) 效果 残液去除难易 次氯酸钙 10 530 好 易 次氯酸钠 25 530 好 易 新洁尔灭 1020 530 好 易 氯化汞 0.11 210 最好 最难 过氧化氢 1012 515 较好 最易 抗菌素 450mg/L 3060 较好 较难,几种常用消毒剂的效果比较,附：常用消毒剂的性质,7075酒精： 具有较强的穿透力和杀菌力，常作为表面灭菌的第一步，它具有浸润和灭菌的双重作用，但不能彻底灭菌，必须结合其他药剂灭菌。一般处理时间为530s。为了提高乙醇的杀菌效果，可在乙醇溶液中加入0.1的酸或碱，因为H+和OH-可

13、改变细胞膜带电荷的性质而使透性增加，提高杀菌的效果,升汞（HgCl2）： 剧毒的重金属盐杀菌剂，其杀菌原理是Hg2与带负电荷的蛋白质结合，使菌体酶蛋白变性失活。使用浓度0.10.2，一般浸泡处理612min就可有效地杀死附着在外植体表面的细菌及真菌，灭菌效果极好。但用升汞灭菌的外植体材料须用无菌水反复多次冲洗，才能洗去残留的汞，否则会对外植体产生毒害作用。通常用无菌水冲洗不得少于5次。由于升汞的毒性剧烈，使用中务必注意安全。,升汞废物的处理,升汞为剧毒药品，一则使用时注意别溅到皮肤上；二则使用后要进行处理，不能直接倒入下水道。,升汞处理方法：,升汞Na2S,絮状沉淀（至絮状沉淀不再产生为止）,

14、FeSO4（中和过多的Na2S ）,次氯酸钠（NaClO）： 用市售的“安替福民”配制210的NaClO，灭菌时间530min，无菌水冲洗45次。由于它分解出具杀菌作用的氯气，灭菌处理后易于除去，无残留，既有较强的杀菌力，又对植物无害，是常用的杀菌剂。,过氧化氢（双氧水）： 常用612的溶液处理外植体材料，灭菌效果较好，由于该药剂在外植体表面容易除去，又不会损伤外植体，通常用于叶片材料的灭菌。,新洁尔灭： 一种广谱的表面活性灭菌剂，它对绝大多数植物外植体伤害很小，灭菌效果很好。通常使用1：200稀释液，处理30min或更长。,在用上述药剂进行材料的灭菌处理时，为了使杀菌剂湿润整个组织，有时还需

15、在药液中加入润湿剂。如加入数滴或0.1的吐温（Tween）80或吐温20，或者用磁力搅拌、超声振动等方法使杀菌剂充分接触外植体，以利于彻底灭菌。,三、接种技术,1所有的消毒、接种等无菌操作技术均需在无菌室的超净工作台上进行。 1、超净工作台： 内设紫外灯、吹风装置、过滤装置等，每次实验前要用紫外灯灭菌20分钟以上，然后喷酒精灭菌，工作过程中注意一直开着吹风机，并且一定要关掉紫外灯，过滤网应经常清洗。 2、无菌操作用的器具：刀、镊子、剪刀、酒精灯等事先已灭菌，使用中避免交叉污染； 3、操作人员在操作之前洗手、换工作服、双手消毒再操作。,培养条件 光照:光照强度、光质、光照时间 温度 湿度 pH值

16、：5.56.5 渗透压 通气条件,根据离体培养的营养需求，培养基至少包括： 无机盐； 有机化合物； 生长调节剂,三、 培养基及其配制,培养基的基本成分,Fe、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、B,1 无机营养物质,、大量元素：,C、H、O,N、P、K、Ca、Mg、S、(Na),、微量元素：,无机盐的作用：, 一是组成各种化合物，参与机体的建造，成为结构物质； 二是构成一些特殊的生理活性物质，如植物激素、酶以及酶的活化剂，参与植物的代谢活动； 三是这些元素之间相互协调，以维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平衡等生物电化学方面的作用； 四是在发育过程中，影响组织器官的建成。,浓度：2%-3%,2 有机物

17、质,糖：,作用：,维持培养基合适的渗透压 为细胞提供合成新物质的碳骨架 为细胞的呼吸代谢提供底物和能量,种类：蔗糖、葡萄糖 麦芽糖、果糖等 多糖：可溶性淀粉,维生素： 硫胺素(VB1)、烟酸（VB3又称VBPP ） 、泛酸(VB5)、吡哆醇(VB6)、酸铵、钴胺素(VB12)、叶酸(VM又称VB11)、抗坏血酸(VC)等等.,作用：利于细胞代谢和器官分化。 B1是植物组培必须加入的维生素，其用量在0.1-30 mg/L之间，当组培中细胞分裂素特别少时，B1更为需要；烟酸和B6可促进细胞生长,氨基酸：甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、 天冬酰胺、丙氨酸等等。因培养基的种类不同，其添加种

18、类和 浓度不同。 肌醇：又称环己六醇，促进糖类的相互转化，维生素、 激素的利用作用，使培养物快速生长 。 腺嘌呤、硫酸盐等激素：加入培养基时，可促进芽、根的形成和生长。根 据培养基的植物不同，决定是否添加。,琼脂:是从海藻中提取的一种高分子碳 水化合物，其主要作用是使培养基在常温下凝固，但不参与代谢。 活性炭:主要目的是利用其吸附能力，减少一些有害物质的影响，如可以防止酚类物质污染而引起组织褐化死亡。,3、附加物,这类物质为非植物细胞生长所必须，但对细胞 生长有利,主要包括琼脂和活性炭。, 作用：提供一些必要的微量营养成分、 生理活性物质和生长激素等。 这类物质常指天然提取物 ： 麦芽提取物、

19、 椰乳、 鲜果汁、 酵母提取物,4、 其它有益有机添加物或未知复合成分,5、pH值： 即酸碱度，培养的植物材料大多数要求弱酸性的环境，一般将培养基调整至pH5.65.8。常用0.1mol/l氢氧化钠或盐酸来调节培养基的pH。 注意： 第一、经高温高压灭菌后，培养基的pH会下降0.2-0.8,故调整后的pH应该高于目标pH 0.5个单位； 第二、 pH的大小会直接影响到琼脂的凝固能力，一般pH 大于6.0时，培养基就会变硬，低于5.0时琼脂就不能很好地凝固。,6、激素,在培养基中，其各种成分对培养物影响最大的最显著的就是激素。激素的种类、浓度、以及配比都会显著的影响愈伤组织的形成、不定根、不定芽

20、的分化，胚状体的形成等； 组织培养中使用的激素有的是天然的，如脱落酸（ABA）等，有的是合成的，如二氯苯氧乙酸（2，4D）。,（一）、激素的种类,1、生长素,2、细胞分裂素,3、赤霉素,4、脱落酸,1、生长素类, 生长素是指能引起完整组织中的细胞扩展的化合物。 在自然界中，即内生生长素影响茎和茎节的伸长、向性、顶端优势、叶片脱落和生根等现象 在组织培养中的主要作用是：诱导愈伤组织的产生，促进细胞脱分化，促进细胞的伸长，促进生根。, 组织培养中常用的生长素有： 二氯苯氧乙酸（2，4D） ； 萘乙酸（NAA） 吲哚乙酸（ IAA ） ； 吲哚3丁酸（IBA） 萘氧乙酸（NOA） ； 对氯苯氧乙酸（

21、P-CPA） 三氯苯氧乙酸（2，4，5 T）； 生根粉（ABT） NAA 、IAA、 IBA易引起生根， 2，4D 、2，4，5 T有利于愈伤组织的诱导和生长。,主要作用：是诱导愈伤组织的形成、胚状体的产生以及试管苗的生根，更重要的是配合一定比例的细胞分裂素诱导腋芽及不定芽的产生； 作用的强弱顺序为： 2，4-DNAAIBAIAA,溶解方法： 0.1M NaOH或95酒精，以前者为好 保存： 配成一定浓度后，冰箱冷藏保存,2、细胞分裂素 自然界中，细胞分裂素影响细胞分裂，顶端优势的变化和茎的分化等； 组织培养中，细胞分类素主要促进细胞分裂和愈伤组织上或器官上分化不定芽，叶片扩大和茎长高，抑制根

22、的生长。细胞分裂素常常与生长素相互配合，用以调节细胞分裂，细胞伸长，细胞分化和器官形成。,常用的细胞分裂素有：, 6苄基嘌呤（BAP） ； 6苄基腺嘌呤（6BA）； 激动素（呋喃氨基嘌呤、Kinetin、KT）； 玉米素（ZT）； 异戊烯氨基嘌呤（2IP） 噻二唑苯基脲（ thidiazuron、 TDZ ）； 溶解方法：0.1MHCL 保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存,主要作用：促进细胞的分裂和器官的分化、延缓组织的衰老、增强蛋白质的合成、抑制顶端优势、促进侧芽的生长及显著改变其他的激素作用； 作用的强弱顺序为：ZT2-iP6-BAKT。,3、赤霉素,赤霉素能够打破休眠、促进果实成长等效果

23、； 赤霉素有20多种，其中在组织培养中最常用的是GA3； 已经用于顶端分生组织的培养和维管分化的研究；能刺激不定胚发育成正常小植株；在培养基中很少添加，因为它的作用往往是负面的。,溶解方法：95酒精 保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存； 赤霉素易溶于水，但溶于水后不稳定，容易分解； 灭菌：高温分解，过滤灭菌。,4、脱落酸,脱落酸能阻碍发育、促进老化、形成休眠芽等作用； 加上脱落酸能抑制生长，使继代培养时间延长； 溶解方法：95酒精； 保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存。,（二）、常见培养基中植物激素配方类型,（三）、常见生长调节剂及主要性能一览表,（四）、常见生长调节剂的微摩尔/升浓度与毫克/

24、升的转换,三、常用培养基的种类、配方及其特点 （一）、培养基的种类 1、培养基，根据其态相不同分为固体培养基与液体培养基。固体培养基是指加凝固剂的培养基；液体培养基是指不加凝固剂的培养基，培养基加入一定量的凝固剂，加热溶解后，分别装入常用的培养基中冷却后即得到固体培养基。 2、根据培养物的培养过程，培养基分为初代培养基和继代培养基。初代培养基是指用来第一次接种外植体的培养基。继代培养基是指用来接种继初代培养基之后的培养物的培养物。,3、根据其作用不同，培养基分为诱导培养基、增殖培养基和生根培养基。 4、根据其营养水平不同，培养基可分为基本培养基和完全培养基。基本培养基（就是通常称呼的培养基）主

25、要有MS、White、 N6、B5 、改良MS、Heller、Nitsh、SH、 Miller等。完全培养基就是基本培养基的基础上，根据试验的不同需要，附加一些物质，如生长调节物质和其他复杂有机物质等。,（二）几种常见培养基： MS、N6、B5、LS、RM-1964、H、T、B5、DBM、米勒、改良怀特、尼特、努森C等。 MS培养基是目前应用最多最普遍的培养基。无机盐的浓度较高，能保证组织培生长所需的矿物质营养。并且因为离子浓度高，在配制、贮存、消毒过程中，即使有些成分略有出入，也不致影响培养基中的离子平衡,四、培养基的配制 （一）、贮备液（母液）的配制 为什么要配制母液？ 1）、方便 2）、

26、准确（有些成分量太小） 3）、母液要分类配， 否则有些成分混合一起会产生沉淀 以MS培养基为例：,表11MS培养基母液的配制,贮备液（大量元素） 10倍 贮备液（微量元素） 1001000倍 贮备液 （铁盐） 1001000倍 贮备液 （有机成分） 100倍 母液、按表称量药品溶解定容冰箱冷藏 母液，FeSO4.7H2O和Na2.EDTA称量后，分别溶于水中 ，加热，然后混合一起；或者混合一起后加热，颜色黄色变深，生成Fe.EDTA ,冷却后，冰箱冷藏。,（二）、培养基的配制 1、向烧杯加入适量的水，按量加入4种贮备液（母液） 2、按所需浓度加激素，或其他成分，如AgNO3等 3、加蔗糖，一般

27、30g/L 4、pH值测定 pH值测定仪，NaOH、HCl，1M、0.1M调整 5、加琼脂 ，一般68g/L，溶化（电炉、微波炉等） 6、分注、封口（铝箔纸，牛皮纸、塑料纸等） 7、灭菌 121，2025分钟（并不是灭菌时间越长越好，灭菌时间过长会导致培养基内的某些成分变性失效）,灭菌后，应尽快地转移培养瓶使其冷却，一般应将灭菌后的培养基储藏于30以下的室内，最好储藏在410的条件下。 应当注意的是，某些生长调节物质如IAA、ZT、ABA等以及某些维生素是不稳定的，不能和其他的培养基一起高压灭菌，而要进行过滤灭菌。,小结 实验室设计要合理、科学，同时要配备必要的仪器设备； 培养基在配置时要参考常规的细胞培养营养要求，同时要考虑特定细胞的特殊营养要求。,