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1、第三章 细胞形态结构观察技术,一、活体细胞的观察和摄影技术,1.倒置显微镜：P60图3-3（提问光镜使用注意） 适用：观察贴壁生长的培养中细胞 构造特点：因物镜置于观察标本下方而得名 技巧：调弱光亮度，集光器稍远些， 增大光线反差，对正光轴； 摄影时，使观察物稍偏远离焦点，照片 会更清晰。 底片选用正片，反差大,2.相差显微镜 P62图3-4 适用：可增强活细胞同背底反差，帮助看清 细胞的轮廓和细胞内细微结构，如： 核仁、染色质、线粒体等。 构造特点：有两个附加构件： 相差接物镜：其光学系统中有一个光环透镜 相差聚光器：内有数个相位板，使用时与物 镜倍数一致 技巧：细胞培养瓶质地均匀透明较好，
2、最好用塑 料瓶；观察摄影时，瓶壁要擦净；光轴对 正，照明度适宜，摸索试调至最佳,3.荧光显微镜 P67图3-6 适用：观察细胞内天然的荧光物质，如维生 素、脂褐素、核黄素等，也可观察可与 荧光染料结合的细胞组分。 构造特点：与普通光镜比，区别在于用高压汞灯光源，波长可激发荧光物质产生荧光；滤光片不同。 技巧：观察必须是自发荧光或经荧光染色的标本；选用效果最好的滤光片；荧光标本易褪色，不能长期保存，观察操作要迅速，作好记录；仪器的高压汞灯光源启动后15分钟内不得关闭，关闭后，灯冷却后方可再起动，否则寿命大减，长时间观察标本时，需带护目镜。,4.暗视野显微镜 P64图3-5 适用：观察记录活细胞或
3、细胞器的运动轨迹， 提高分辨率 构造特点：只有聚光器不同于普通显微镜，设 有一个中央遮光板使照明光线不能直射。 标本进入目镜，只许标本散射光进入目 镜 技巧：物镜的数值孔径必小于聚光器的数值孔 径；盖玻片，载玻片应清洁无痕；聚光 镜和载玻片之间加香柏油，保证效果。,二.显微摄影技术 p68,1.概念：显微摄影术是利用显微摄影装置拍摄 显微镜视野的物象的技术。 2.技术类型：胶片相机摄像 数码相机摄像 CCD图像采集 三者前期操作一致，但成像和图像存储 原理不同。,3.图像记录原理： 胶片相机摄像：显微摄影时，光线自标本 片的微小物件射入物镜后，造成一个倒立的放大实像，经目镜进一步放大后，投射在
4、照相底片上，使底片感光而记录下显微镜视野下物象。 数码相机摄像：是以数字的形式用电子设备储存图像。拍照后，可通过数据线将所拍摄图像传输到电脑，也可将相机的存储卡取出，通过读卡器将拍摄的图像传输到电脑上。,数码相机摄像原理与CCD图像采集器相同。 CCD图像传感器：即CCD(charge copled Device, 感光耦合组件） CCD的组成结构有三个层次： 上层：聚光镜片（增光镜片） 中层：一个类似马赛克的网络（分色网络） 下层：垫在下层的电子线路矩阵（感应线路 是可记录光线变化的半导体）,CCD工作方式之一： 当数码相机的快门开启，来自影像的光线穿过，这些马赛克会让感光点的=氧化硅材料释
5、放出电子（正电）与电洞（负电）。经由外部加入电压，这些电子和电洞会被转移到不同极性的另一个硅区暂存。电子数的多寡和曝光点所接受的光量成正比。在一个影像最明亮部位，可有十万电子被积存起来。,CCD IMAGE SENSOR外形,彩色CCD的组成结构分图,CCD 的三层结构：上：增光镜片、中：色块网格 下：感应线路 由微型镜头、马赛克分色网格，及垫于最底层的电子线路矩阵所组成,4.拍摄技术步骤： 胶片相机拍摄：p69-74(生物教研室李相伟） 数码相机拍摄：p74-75(同上） CCD图像采集： （病理教研室姚海涛 （实验中心刘君星）,5.缩时显微摄影术 适用：记录细胞或细胞器连续动态变化过程 正
6、常时态连续拍照 缩时逐格拍照 主要装备：倒置显微镜，16mm摄影机，自控 缩时启动拍摄装置。 原理：缩时间隔时间：目标物实际活动时间 X 1/24 影片排成后要求放镜时间 =3600秒 10秒 x 124=15秒 所以，每隔15秒摄取1张照片。,三、光镜下的固定细胞观察法（组胚，病理） 细胞器培养皿内铺盖片单层培养 取盖片 细胞悬液 离心沉淀 涂片 固定 染色 观察 拍照 （固定剂，染色剂知识介绍） 固定剂的作用：穿透，固定，保形，防腐 固定剂的选择：P83,细胞内组分的差异染色。 染色剂的选择： Giemsa染色体桃红色。 本书P84 FeulgenDNA紫红色，细胞质绿色。鄂P141 吖啶
7、橙RNA红色，DNA亮绿色。本书P86 苏木精-伊红（HE)细胞核蓝色，细胞质红色 本书P85 过碘酸席夫细胞内含糖原区紫红色。章P58 苏丹红III细胞内含脂肪区橘红色。章P59 鬼笔环肽溦丝染色。章P59 免疫荧光法溦管染色。章P60 联苯胺+H2O2过氧化氢体染色。小章P37 詹纳斯绿B活体细胞线粒体。小章P43,四、激光扫描共聚焦显微镜技术（实验中心） 1.概念和原理 P76 laster scanning confocal microscope LSCM 激光共聚焦显微镜是20世纪80年代以来发展起来的 一项细胞生物学和高分子材料科学领域的高科技分 析仪器。,其在传统光学显微镜基础上
8、，利用激光作 为光源，经照明针孔可形成点光源照射荧光样品， 所产生的激发光斑被探测器针孔以共轭的形式接收 于同一焦平面上，可通过计算机控制显微镜移动， 以实现在同一焦平面（x-y)上的逐点扫描。计算机以像点的方式在计算机屏幕上形成图像。 同时，也可沿z轴方向逐渐改变焦平面，完 成对样品厚片不同层面的扫描，进行类似CT断 层扫描的无损伤连续光学切片，经计算机三维重 建处理，可形成观察标本的三维结构图形。,2.LSCM的主要组成部分及工作原理 激光光源:氢离子激光,能同时 / 顺序 / 分别输出紫外光和可见光 照明针孔:使激光通过照明针孔后形成点光源,点光源具有方向性强,发散小、亮度高等优点 光束
9、分离器：可将样品经点光源照射所激发的荧光与其它非信号光线分开，排除非信号光线干扰，提高分辨率和清晰度。 物镜 焦平面：激光点光源照射标本样品，激发样品发射荧光，形成焦点光斑，在焦平面处聚焦成像。,探测器针孔：起到空间滤波器作用。阻断非聚焦平面散色光和焦平面上非焦点光斑散色光。保证样品所衍射的聚焦光斑和探测器针孔的成像光斑，包含相同信息。（两点共扼聚焦） 光电倍增器：接受通过探测器针孔的光信号，转换成电信号后转输至计算机，在屏幕上形成焦平面图形 多荧光通道:可以同时对样品进行多种荧光标记的信号检测 计算机控制系统：控制步动电动机带动显微镜移动，实现在同一焦面(x-y轴)上逐点扫描；控制共聚焦系统
10、；控制沿z轴改变焦平面，进行对样品厚度的连续光学切片和对样品结构的三维重建；控制信号的采集、转输、分析。,3.LSCM相对光学显微镜的优点 LSCM的图像是以电信号形式记录下来的，可用电子计算机技术模拟数字化处理 利用共聚焦系统有效排除了焦点外信号干扰，不仅提高了x-y轴焦平面分辨率和清晰度，而且可对观察样品进行z轴无损伤光切片，实现三维结构的定位成像 可广泛应用于活细胞的形态、结构，定量、定性、定位分析。与荧光探针技术结合，可进行单细胞分选和多种细胞分子生物学研究及细胞机能学研究,4.LSCM的应用 贴壁细胞的分选 数量较多细胞群的分选:在特别培养皿上一类细胞群经荧光染色，另一类细胞群未经染
11、色，可用高能激光把荧光染色的细胞群杀死，而另一类保存，可继续培养。 少量或单克隆细胞的分选：对于选中的突变细胞、杂交细胞或肿瘤转移细胞，可利用铺有特制膜的培养皿上，在选中的细胞克隆周围切割成八角带，再用高能激光杀伤八角带之外的细胞。,细胞形态学研究：可行X-Y焦平面形态研究，尤其是可行工z轴三维形态结构研究。可对细胞形状，周长，面积，平均荧光强度，也可对细胞内溶酶体，线粒体，内质网，细胞骨架，结构性蛋白形态、数量、位置的描述。 细胞内某些大分子组分分析：与免疫荧光技术和荧光探针技术相结合，可对细胞内蛋白、DNA、RNA、酶、受体等组份进行定性定量定时定位分析，以及细胞内PH和细胞内某些离子进行
12、分析。用于细胞机能学研究。细胞通讯研究。 细胞机能学研究及细胞通讯研究 细胞显微外科手术：在LSCM镜下可将激光作光子刀使用进行细胞穿孔、染色体精切，细胞器烧灼，神经元突触切除，细胞器转移等手术。,五、电镜观察法 P78,分辨率：肉眼0.1mm 光镜（油镜）0.2um 电镜可达0.08nm 培养细胞的电镜观察途径 透射电镜观察 内部结构 原位切片 组织消化分离后切 扫描电镜观察 c表面结构 原位扫描观察 消化分离观察 锇酸固定剂的发现：锇酸用量很少，但代价昂贵，事先同电镜室商量。 （研究生课程专设有电镜课）,用途： 观察细胞的亚微结构，进行生理、药理、病理学研究。 如：核糖体分布与脱粒 线粒体变形 溶酶体异常 细胞膜表面结构和吞饮作用，微绒毛变异 细胞骨架紊乱 精子结构异常 （见P82电镜照片）,