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1、细胞形态学检查,一、倒置显微镜观察细胞的形态 （一）一般的形态学观察： （二）用相差显微镜观察细胞的形态 （三）荧光显微镜观察细胞的形态和结构,Identification of cultured adult rat RGCs. Cultured cells were co-labeled with anti-Thy-1 antibody (A), anti-NF-L antibody (B), and DAPI (C). (D) A digitally merged image simultaneously represents all three fluorescent labels. (
2、E) The corresponding phase-contrast image.,免疫荧光染色法,用于标记二抗体的荧光素： （1）异硫氰酸荧光素（FITC） 发射的荧光波长为490619（绿色荧光） （2）四乙基罗丹明：荧光波长为540660（橙红色荧光） （3）DAPI或Hoechst33258 : 染核，用紫外激发,免疫荧光的染色步骤,1、用95%乙醇固定细胞10-30 分或用冷丙酮固定510分。 2、用PBS洗3次。 3、用PBS配制的1Triton 10分。用PBS洗3次 4、用2%5%BSA封闭2 小时 5、加入一抗过夜，PBS洗3次 6、加入二抗12小时， PBS洗3次 7、核
3、复染，荧光显微镜观察。,正常细胞和组织的培养,一、上皮细胞培养(epithelial culture) 上皮细胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于上皮组织，故上皮细胞培养特别受到重视。但上皮细胞培养中常混杂有成纤维细胞，培养时生长速度往往超过上皮细胞，并难以纯化，同时上皮细胞难以在体外长期生存，因此纯化和延长生存时间是培养关键。,体内上皮细胞生长在胶原构成的基膜，因此培养在有胶原的底物上可能利于生长，另外人或小鼠表皮细胞培养在以3T3细胞为饲养层（用射线照射后）时，细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。降低PH、Ca2+含量和温度，向培养基中加入表皮生长因子，均有利
4、于表皮细胞生长。,表皮细胞培养 1、取材：外科植皮或手术残余皮肤小块，早产流产儿皮肤更好，取角化层薄者，切成0.51平方厘米小块。 2、置0.02%EDTA中，室温，5分钟。 3、换入0.25%胰蛋白酶中，4过夜。 4、分离：取出皮块，用血管钳或镊子将表皮与真皮层分开。 5、取出表皮，剪成更小的块后，置0.25%胰酶中，37，3060分钟。 6、反复吹打，制成悬液。 7、培养：用80目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸去上清。 8、直接加入培养基（Eagle加20%小牛血清）制成细胞悬液，接种入培养瓶，CO2温箱培养。,Cultured Mouse Mammary Epithelial Cells
5、,神经胶质细胞培养,神经细胞（神经元不易培养，只有在适宜情况下，如接种在胶原底层上，或加入神经生长因子和胶质细胞因子时，可出现一定程度的分化，长出突起等现象，但很难使之增值。而神经胶质细胞是神经组织中比较容易培养的成分。 人、鼠等脑组织即可用于神经胶质细胞培养，不仅能获得生长的胶质细胞，也可形成能传代的二倍体细胞系。一般说来，胶质细胞在培养中生长不稳定，不易自发转化，但对外界因素仍保持很好的敏感性，,获取脑组织后，仔细剥除脑膜、血管和纤维成分，置Hanks液中漂洗一、二次。 2、置于3050倍体积的Hanks液中，此时脑组织比较柔软，反复吹打即制成细胞悬液。 3、把悬液注入离心管室温中直立51
6、0分钟后，细胞或细胞团快自然下沉，脂肪等杂物易漂浮，可吸除上层、反复二、三次，即可排除脂肪成分和其它碎块并获较多细胞成分。 4、在沉降物中加入适量培养液，通过纱网过滤，计数并调整细胞密度。 5、接入培养瓶或皿中，置5%CO2温箱中培养。 该细胞适应环境过程较长，接种后贴壁较慢。贴壁后短期内也可能不见细胞分裂现象，然而一旦生长后即能迅速进入旺盛的增殖状态。细胞传代可以0.25%胰酶消化处理。,Cultured neuron,Cultured microglia,大鼠肝细胞的培养(成年),培养液: Koga 培养液, 最好加入Williams 和Waymouth MB752/1) 消化液:型胶原酶
7、300U/mg, 使用浓度为0.025% 方法: 1 灌流法分离肝细胞：门静脉和下腔插管静脉插管 2、用预灌流液(8.3 mg/ml NaCl,0.5 mg/ml KCl,2.4 mg/ml HEPES,pH 7.4)灌流8分钟,3、用含0.05%胶原酶的灌流液(预灌流液中加入5 mmol/LCaCl2, 0.05%胶原酶)继续灌流10分钟。 4、将肝叶剪下,将消化好的肝细胞轻轻刮下,获得的肝细胞悬液离心(600 r/min)三次,每次2分钟 5、然后重新悬浮于WE培养基中(含10%血清, Insulin 0.2 U/ml, L-Glutamine 0.292 mg/ml，100 nM dex
8、amethasone )。 6、Isolated cells were plated on collagen type I-coated dishes in medium I consisting of Williams medium E 。,Hepatocyte Isolation and Culture Hepatocytes were isolated from the liver of fed male BALB/c mice (22-25 g) by using the two-step collagenase perfusion method. After the inductio
9、n of anesthesia with pentobarbital sodium (400 mg/kg ip), the peritoneal cavity was opened, and the liver was perfused in situ via the portal vein for 4 min at 37C with calcium-free HEPES buffer and for 7 min with HEPES buffer containing 45 mg/100 ml collagenase D (Boehringer-Mannheim, Laval, QC, Ca
10、nada) and 135 mg/100 ml CaCl2. The perfusion rate was set at 5 ml/min for both solutions.,The cells were used only if cell viability, as determined by trypan blue exclusion, was 80%. The cells were seeded onto plastic petri dishes (26,000 cells/cm2) in Williams medium E (GIBCO BRL, Toronto, ON, Cana
11、da) supplemented with 10% fetal bovine serum (GIBCO BRL) and allowed 90 min to attach. The serum-containing medium was then removed, and the cells were subjected to different culture conditions in serum-free medium.,Fig. 5. Morphology of EGF-treated mouse hepatocytes in the presence and absence of P
12、D-168393. Primary mouse hepatocyte cultures were incubated with medium (untreated) or EGF (50 ng/ml) in the presence or absence of 10 M PD-168393. After 24 h in culture, EGF-treated hepatocytes were spread, and their cell surface increased compared with untreated cells. Hepatocytes treated with EGF
13、in the presence of PD-168393 were spheroid and resembled control cells with or without PD-168393. Magnification, 100.,大鼠心肌细胞的培养,新生大鼠鼠龄的选择 新生大鼠心肌细胞在出生后3d内具有部分的增殖能力,成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞,不再具有分裂增殖能力.因此,大鼠出生时间越短,其心肌细胞分离后成活率越高,越容易贴壁生长.大量观测表明,选择13 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养较为理想.其中尤以半日龄大鼠心肌细胞培养效果最佳.,神经细胞分散培养,（一） 选材 常用胚胎
14、动物或新生鼠神经组织。鸡胚常用胚龄6-8d，新生鼠或胎鼠（12-14d）或人胚胎。不过也有认为与组织相关。如大白鼠胚胎以19d为宜，小鼠以18d为宜，大鼠纹状体以10d为宜；若纹状体与黑质联合培养的大鼠胚，则黑质以13d，纹状体18-21d为宜；小脑以20-21d小鼠胚胎，所获蒲氏细胞成活率高，颗粒细胞正在分化；脊髓与DRG联合培养，常用4-7d鸡胚或12-14d小鼠胚胎，取材易，神经成活率高。,(二） 取材。脑则取出相应组织，在解剖液中先剪碎，以使胰酶消化。脊髓则固定于琼脂板上，用小刀将其要成背腹两侧，分别培养。 （三） 细胞分离与接种。神经组织用0.125-0.25%胰蛋白酶在37孵育30
15、min，移入接种液，停止消化，并洗去胰蛋白酶液，用细口吸管吹打细胞悬液，使其充分分散，如此多次，待沉淀后吸出上层细胞悬液，计数，预置细胞密度，接种于培养皿（1106），做电生理应为5105或更低。,（四） 抑制胶质细胞生长。培养3-5d后，也有人认为培养7d后，用阿糖胞苷，或5-FU抑制神经胶质细胞的生长。 （五） 观察。接种6-12h，开始贴壁，并有集合现象，细胞生长突起明显，5-7d胶质细胞增生明显，7-10d胶质细胞成片于神经细胞下面，形成地毯，2周时神经细胞生长最丰满，四周晕光明显，一个月后，有些神经细胞开始退化，变形，甚至出现空泡，一般培养2-4周最宜。,但神经细胞只能增大，而不能增
16、殖，只能原代，不能传代，不会有细胞周期，而且随培养时间的延长，细胞数量在下降，但胶质细胞可以，神经胶质细胞也可以。在培养过程中，早期9-12d时，有较多的神经细胞死亡，这是第一次死亡阶段，应注意保持条件的恒定。在此之后存活下去的细胞一般突起长而多，且相互形成突触。,Neuronal culture,1. Rat pups aged l-l 5 d, were killed by cervical dislocation. 2. Cortex placed in Earles balanced salt solution (BSS) at 37C. and cut into 500 urn sl
17、ices 3. Slices of visual cortex were incubated at 37C with gentle stirring in 10 ml of enzyme solution 4. After 1.5 hr. the slices were rinsed briefly with Earles BSS containing BSA, 1 mg/ml. 5. The slices were gently triturated with a fire-polished Pasteur pipet in 2- 3 ml of this solution.,Freshly
18、 dissociated cells that excluded the dve Erythrosin B (Phillips, 1973) were considered to be viable. Dissociated cells were harvested by low-speed centrifugation (10 min, 70 x g) through 5 ml of Earles BSS containing BSA (10 mg/ml) . Cells were resuspended in growth medium and plated in modified pet
19、ri dishes. Typically, cells from a single rat pup were used to prepare 40-50 culture dishes. Optimal viability and morphological preservation of the dissociated cells were obtained using the enzyme papain.,血管内皮细胞的培养,取材 人和动脉不同部位、不同血管如大动脉与小动脉、毛细血管，以及静脉血管之间存在差异，在处理这些细胞时应分别对待。 血管内皮细胞形态较小，近似圆形，呈均匀排列，一般取材
20、于人和动物的脐带。,人大动脉内皮细胞培养,人大动脉内皮细胞可来自手术、病理活检组织，也可来自尸体（需在死后24h内取材) 方法: (1)小心剥除已游离的大血管外膜，置于盛有冷的磷酸盐平衡盐溶液平皿中反复漂洗，洗净血管内、外面的血液和脂质。 （2）剪开血管，放入37消化液中，60 min，消化结合后，用23号针头注射器吸取消化液冲洗血管内腔， （3）收集消化液置无菌试管中，离心（1000rpm 7min）弃上清，加入含血清培养基中，使细胞重新悬并调整细胞数。 （4）接种于相应大小培养瓶或培养皿中，37恒温温箱培养，一周后内皮细胞可长成单层，呈多角形铺成石状排列。,注意事项,：如果小于23号针头则
21、回收内皮细胞效果差，若针头过大则注射器内压大会吸入紧贴内皮细胞的平滑肌细胞，因此注意使用恰当的针头；人血管内皮细胞对营养条件要求高，是依赖于生长因子的一种细胞。常用的培养基为RPMI 1640，培养时添加15% FBS，15%Nu-Serum，520g/ml的内皮细胞生长因子（ECGF）以及100g/ml的肝素。改进的培养基有MCDB109培养基，市场上也有内皮细胞商品培养基，可根据需要选择购买；培养基中必须加入相应抗生素，最终浓度：庆大霉素为15g/ml，氨苄青霉素为50g/ml，二性霉素B12g/ml，二甲胺四环素1g/ml。在48h内可以防止细胞感染，3日后还应添加庆大毒素。,脐带静脉内
22、皮细胞培养,在婴儿出生时立即将脐带放置于无菌的500ml磷酸盐溶液（PBS）中低温保存。次日分离细胞。脐带有一根静脉两根动脉，通常用内腔大静脉。将洗净的静脉一端用夹子夹紧，一端注入消化液，静置孵育片刻。然后PBS或培养液反复抽吸内腔，收集后与消化液一并离心、沉淀内皮细胞。所用培养基与大动脉内皮细胞培养基相同，脐带静脉内皮细胞、大动脉内皮细胞易于培养，既使不加生长因子在最初几代细胞也会增殖良好。,血管内皮细胞重要标志,（1）第因子关连抗原（von willebrand factor,VWF），可以由全身所有血管内皮细胞产生，检测这一因子主要用相应抗体。VWF有其特异性，人的VWF抗体对牛的内皮细
23、胞没有交叉反应。兔疫荧光间接法测定该因子，阳性细胞出现细长的荧光颗粒，在核周围的颗粒较密，细胞边缘颗粒较少。 （2）Weibel-Palade小体，该小体是血管内皮细胞又一特异性的标志。电子显微镜下，呈现0.10.3m,长0.55m的椭圆形棒状结构。上述的VWF就是该小体产生的。,血管平滑肌细胞的培养,血管平滑肌细胞培养常用的方法有贴块法（explant）和酶解离法（enzyme disperse）。贴块法具有获得平滑肌细胞纯度高，量多，操作简便的优点。但用贴块法易使平滑肌细胞胞质内肌丝丧失，亚细胞器增加。相反，酶解离法，由于酶的作用使细胞间失去连接，细胞内肌丝含量丰富，保持收缩型状态。培养平
24、滑肌细胞常取材于兔、猪、鼠、猴的胸腹主动脉段。,1贴块法,方法：动物经颈动脉放血后，在无菌操作下迅速取出胸腹主动脉段，置于含Hanks液的平皿中漂洗3次，将凝块洗干净后剥除外膜的纤维脂肪层，然后纵行切开血管，刮除内膜即内皮细胞迅速撕下中膜内、中层，切成约1mm宽的小条，浸泡在含血清的Hanks液中，并将撕下小组织块种植于培养瓶壁。置于37恒温箱，2h左右，取出培养瓶加入20%胎牛血清的培养液，再放回培养箱内静止培养4天。4天后可见细胞从组织中迁移游出。,培养时注意事项,为了保证培养的成功，应注意：种植组织块的数目，如75cm2的长颈瓶组织块不得少于30个；根据培养细胞的种属加入适量的不同血清，
25、一般可加入牛血清，若小牛血清增殖效果差，应加胎牛血清（FBS），通常浓度为10%20%；培养基的选择：常用的有DMEM（Dulbeccos modified Eaglesmedium），M199培养基。培养兔的平滑肌细胞用DMEM效果较好。,2酶解离法,沿动脉纵轴切开后，刮除内皮细胞撕下中膜的内2/3，注意不要混入内皮细胞，将组织块切成1-2 mm2，放入加有3mg/ml胶原酶的无血清M199培养基中，37，0.51.5h。离心去上清，重复上述消化步骤，然后再离心（9000r,4min），收集细胞，在5%10%同种血清或胎牛血清的M199培养基中调整细胞数，然后转入3090mm培养皿中培养，对
26、于兔子应加入高浓度的谷氨酰胺（0.2g/L）较佳。不同研究者在培养基、酶浓度以及消化时间等的选择都有很大的差异。,动脉平滑肌的特性,由于贴块法和解离法处理方式不同，在细胞培养的最初阶段细胞形态和性质存在差异。随着培养时间的延长，培养环境趋于一致，细胞特性上也趋于近似。 光学倒置显微镜下观察：原代平滑肌细胞形状多样，一般常为梭形、带形、三角形或星形。贴块法培养，细胞可于2周后长成单层；而酶解离只需67天，镜下可见明显“峰-谷”样生长。,牙髓细胞的培养,培养用液： PBSA； 胶原酶：I型，用DHanks液配制，625U/ml； 培养液：DMEM10FBS； Protocol： 取拔除的正畸牙或阻
27、生牙（年龄小者较佳），尽量完整的取出牙髓，置于培养皿中，用PBS冲洗； 将牙髓放入离心管，加入胶原酶23ml/牙，37，23小时（原则是将牙髓消化彻底）； 加入等量培养液，吹打至单细胞，离心，重悬，接种，牙/6well；,牙周细胞的培养,培养用液： PBSA； 胶原酶：I型，用DHanks液配制，625U/ml； 培养液：DMEM10FBS； Protocol： 取拔除的正畸牙或阻生牙（年龄小者较佳），置于培养皿中，用手术刀仔细刮除附着在牙根上的牙龈组织，然后用PBS反复冲洗，以去除残余组织以及牙根表面的血细胞； 将牙放入离心管，加入胶原酶23ml/牙，37，1小时； 加入等量培养液，仔细吹打
28、牙根表面，收集细胞，离心，重悬，接种，牙/6well； *培养获得的细胞是牙周膜细胞和成牙骨质细胞的混合体!,年龄对细胞产量以及活力影响较大，最好选用年龄在1014岁之间的正畸牙或阻生牙； 如果选用大鼠牙齿作为培养目标，培养液应稍作调整，基本原则是抑制细胞的衰老，具体做法是：适当降低血清浓度（选用进口血清最佳），如果降低血清浓度后，细胞增殖减慢，可加入促进细胞增殖的因子（例如BPE 25ug/ml等）。,巨噬细胞培养,巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活23周，多用做原代培养，难以长期生存。 培养巨噬细胞可用
29、各样方法和各种来源来获取细胞，以小鼠腹腔取材法最为实用，其法如下： 1、实验前三天，向小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤lml（勿注入肠内！）， 2、引颈处死小鼠。 3、手提鼠尾将其全浸入70%乙醇中35秒。 4、置动物于解剖台，用针头固定四肢，持镊撕开腹部皮肤，但勿伤及腹膜壁，把皮肤拉向上下两侧，暴露出腹膜壁。,5、用70%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中，同时用手指从两侧压揉腹膜壁，使液体在腹腔内流动。 6、用针头轻挑起腹壁并微倾向一侧使腹腔中液体集中于针头下吸取入针管内。 7、小心拔出针头，把液体注入离心管。 8、4下250g离心10分钟后，去上清，加10ml Eag
30、le培养基。 9、计数细胞。每只鼠可产生20一30106细胞，其中90%为巨噬细胞。 10、以3105个贴附细胞/平方厘米接种。 11、接种数小时后，除去培养液，可去除其它白细胞，纯化培养细胞，用Eagle液冲洗1一2次，再加新Eagle培养液置CO2温箱中。,干细胞（stem cells)的培养,概念：来自胚胎、胎儿或成体未分化的具有无限或长期自我维持和自我更新能力的细胞 性质：能自我更新 能产生许多分化的后裔 分类：根据组织来源： （1）胚胎干细胞（embryonic stem cell, ES) （2）成体干细胞（adult stem cell, AS),胚胎干细胞的培养,胚胎干细胞（E
31、S）是指来自胚胎期桑椹胚的卵裂球或胚泡的内细胞团. 胚胎干细胞培养的主要问题是保持干细胞于为分化状态。通常是将胚胎干细胞种植在铺有一层经丝裂霉素C处理的成纤维细胞（饲细胞）上或在细胞培养液中加入白血病细胞生长抑制因子（LIF）以防止ES细胞分化。,ES的生物学特性,ES细胞在体外分化抑制培养基中呈克隆状生长，细胞紧密地聚集在一起，形式鸟巢，细胞界限不清，克隆周围可见有单个的ES细胞和分化的扁平状上皮细胞。 ES细胞为正常的二倍体细胞，胞体体积大，胞质结构简单。能检测到早期胚胎细胞中表达的阶段特异性胚胎抗原。,小鼠胚胎干细胞的培养,（一）材料 1、将配种后3.5天小鼠断颈后处死, 剪开腹腔取出子
32、宫角,冲胚液冲洗后,收集胚胎. 2 培养液：ES培养液 DMEM培养液（高糖） 3 饲养层细胞 （二）方法 1、将小鼠囊胚随机放入铺有饲养层细胞 的4孔培养板上，每孔一枚，加入5 ml ES培养液 培养,2、培养24、48、72小时分别记录胚胎贴壁细胞的生长行为， 48小时后可见ICM迅速生长。 3、45天后， ICM长成一簇簇的细胞团且未有分化现象，形似鸟巢状的小鼠细胞团衍生物。用无菌玻璃针拨动，使其与滋养层细胞分开，将细胞用胰酶消化成单个细胞。 4、将细胞重新接种在铺有饲养层细胞 的培养板。,干细胞系的培养 步骤： 1从液氮中取出一管细胞； 2将冻存管置于37水浴中2分钟（或放到管内溶液恰
33、好完全溶解）； 3将细胞转移到一15ml Falcon管中； 4加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）； 5离心3分钟； 6弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次； 7接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿； 8孵育。,细胞传代 建议每2天传代细胞一次，过度生长的细胞会降低细胞的自然分化率，我们建立了一种纯化方法来去除分化细胞，在将细胞接种在明胶包被的培养板上之前，通过将分化细胞黏附在没有包被的组织培养板上去除分化细胞。纯化步骤包含在下面的方法中。 1去除培养液； 2无钙镁PBS（Gibco）洗涤； 3加入胰酶EDTA（Gibco）。37孵育5分钟。 4加入ES培
34、养基使胰酶失活； 5将细胞转入15 ml离心管中离心3min； 6去除上清，将细胞重悬于2 ml ES培养基，至少吹打1020次。,如果加入培养基的量较少会比较容易将细胞团弄散分开。ES细胞有聚集成团的倾向，传代过程中仔细将细胞弄散分开很重要。这样可能会减少细胞的自然分化。 7将细胞接种在没有包被的组织培养皿中（使用和一开始同样规格的培养皿）放入温箱2小时（分化细胞在该时间内将黏附，而ES细胞仍将保持悬浮）； 8将含有细胞的培养基转入geltin包被的组织培养皿。吹打以确保细胞被分散开（前面已经提到-ES细胞有聚集成团的倾向） 9建议按1：41：10的比率传代 (ATCC) 保持细胞的传代比率
35、很重要，以我们的经验，1：8的比率是好的，可以使细胞的自然分化降到最低。当你使用不同规格的培养板进行细胞传代可以使用表1来计算传代比率。,成体干细胞培养,原代细胞的培养: 将刚出生的SD大鼠用75%酒精消毒后,颈椎脱臼 处死,放入高压灭菌的培养皿中,于解剖显微镜下 分离出全脑,剥离脑膜和血管,收集脑室下区的组 织,放入D-Hanks液中漂洗两次。 将分离的脑室下区组织放入4基础培养液中,剪切成0.5 mm3的小块,加入0.25%的trysine在37下震荡消化2030min。离心、弃上清,再用基础培养液清洗两次。然后,经高压消毒的40m不锈钢网过滤,用滴管轻轻地吹打制成单细胞悬液,计数并调整细
36、胞的密度。以,接种于预先置有Poly-L-lysine的24孔和6孔培养板(costar)中。培养液为含有10%FCS的DMEM/F12(11)。培养24 h以后,将培养液换成无血清的完全培养液(DMEM/F12加N2、bFGF 10g/L、EGF 20g/L、heparin 4104U/L、青霉素1105U/L及链霉素1106U/L),于37、5% CO2条件下静置培养7 d,每隔2 d半量换液1次。 传代培养:将 原代培养7 d后的贴壁细胞及在贴壁细胞上形成的 细胞球,经吹打收集于离心管中。离心、弃上清,以 滴管轻轻吹打后,用完全培养液制成单细胞悬液,进 行台盼蓝染色并计数。以2105个细
37、胞接种于75 mL (NUNC)和6孔培养板中,在37、5% CO2条件下静 置培养7 d,每隔2 d半量换液1次。此后,每隔7 d 传代1次,在显微镜下用滴管将形成的克隆球轻轻打 成45瓣进行传代。,传代培养: 将原代培养7 d后的贴壁细胞及在贴壁细胞上形成的 细胞球,经吹打收集于离心管中。离心、弃上清,以 滴管轻轻吹打后,用完全培养液制成单细胞悬液,进 行台盼蓝染色并计数。以2105个细胞接种于75 mL (NUNC)和6孔培养板中,在37、5% CO2条件下静 置培养7 d,每隔2 d半量换液1次。此后,每隔7 d 传代1次,在显微镜下用滴管将形成的克隆球轻轻打 成45瓣进行传代。,传代
38、培养7天的克隆细胞球,肿瘤细胞的培养,肿瘤细胞在组织培养中占有核心的位置，首先癌细胞是比较容易培养的细胞。当前建立的细胞系中癌细胞系是最多的。另外肿瘤对人类是威胁最大的疾病。肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药检测、癌分子生物学极其重要的手段。肿瘤细胞培养对阐明和解决癌症将起着不可估量的作用,组织培养肿瘤细胞生物学特性,肿瘤细胞与体内正常细胞相比，不论在体内或在体外，在形态、生长增值、遗传性状等方面都有显著的不同。生长在体内的肿瘤细胞和在体外培养的肿瘤细胞，其差异较小，但也并非完全相同。培养中的肿瘤细胞具以下突出特点：,（）形态和性状,培养中癌细胞无光学显微镜下特异形态，大多数肿瘤细胞镜下观察比
39、二倍体细胞清晰，核膜、核仁轮廓明显，核糖体颗粒丰富。电镜观察癌细胞表面的微绒毛多而细密，微丝走行不如正常细胞规则，可能与肿瘤细胞具有不定向运动和锚着不依赖性有关,（二）生长增殖,肿瘤细胞在体内具有不受控增殖性，在体外培养中仍如此。正常二倍体细胞在体外培养中不加血清不能增殖，是因血清中含有很细胞增殖生长的因子，而癌细胞在低血清中（25）仍能生长。已证明肿瘤细胞有自泌或内泌性产生促增殖因子能力。正常细胞发生转化后，出现能在低血清培养基中生长的现象，已成为检测细胞恶变的一个指标。癌细胞或培养中发生恶性转化后的单个细胞培养时，形成集落（克隆）的能力比正常细胞强。另外癌细胞增殖数量增多扩展时，接触抑制消
40、除，细胞能相互重叠向三维空间发展，形成堆积物。,（三）永生性,永生性也称不死性。在体外培养中表现为细胞可无限传代而不凋亡（Apoptosis）。体外培养中的肿瘤细胞系或细胞株都表现有这种性状，从近年建立细胞系或株的过程说明，如果永生性是体内肿瘤细胞所固有的，肿瘤细胞应易于培养。事实上，多数肿瘤细胞初代培养时并不那么容易。生长增殖并不旺盛；经过纯化成单一化瘤细胞后，也大多增殖若干代后，便出现类似二倍体细胞培养中的停滞期。过此阶段后才获得永生性，顺利传代生长下去。从而说明体外肿瘤细胞的永生性有可能是体外培养后获得的。从一些具有永生性而无恶性性的细胞系，如NIH3T3、Rat1、10T1/2等细胞证
41、明，永生性和恶性（包括浸润性）是两种性状，受不同基因调控，但却有相关性。可能永生性是细胞恶变的阶段。至少在体外是如此。,（四）浸润性,浸润性是肿瘤细胞扩张性增殖行为，培养癌细胞仍持有这种性状。在与正常组织混合培养时，能浸润入其它组织细胞中，并有穿透人工隔膜生长的能力。,（五）异质性,所有肿瘤都是由有增殖能力、遗传性、起源、周期状态等性状不同的细胞组成。异质性构成同一肿瘤内细胞的活力有差别的瘤组织；处于瘤体周边区的细胞获得血液供应多，增殖旺盛，中心区有的细胞衰老退化，有的处于周期阻滞状态，那些呈活跃增殖状态的细胞称干细胞（Stem Cells）、只有这些干细胞才是支持肿瘤生长的成分。肿瘤干细胞培
42、养时易于生长增殖；把干细胞分离出来的培养方法称干细胞培养。,（六）细胞遗传,大多数肿瘤细胞有遗传学改变，如失去二倍体核型、呈异倍体或多倍体等。肿瘤细胞群常由多个细胞群组成，有干细胞系和数个亚系，并不断进行着适应性演变。,肿瘤细胞在体外不易生长的原因可能由于：,依赖性：肿瘤细胞虽有较强克隆生长力，但仍有一定的群体性或与其它细胞相依存关系。一是肿瘤细胞与肿瘤细胞的相互依存，二是肿瘤细胞与基质成纤维细胞的依赖。体外分散培养和排除成纤维细胞后也会同时消除或减弱这些依存关系，可能影响癌细胞增殖生长的活性；,肿瘤细胞的自泌也会因分散培养而被稀释，达不到肿瘤生长的需求，降低肿瘤细胞的生长增殖力； 并非所有肿
43、瘤细胞都有强的生长活力和长的Life Span，只有干细胞才有强的增殖生长能力，但这些细胞数量很少； 离体培养肿瘤细胞可能需求与体内相似的特殊生存条件。,二、培养方法,肿瘤细胞培养成功关键在于：取材、成纤维细胞的排除、选用适宜的培养液和培养底物等几个方面。在具体培养方法方面，肿瘤细胞培养与正常组织细胞培养并无原则差别，初代培养应用组织块和消化培养法均可。,肿瘤细胞培养,1取材： 人来自外科手术或活检瘤组织。取材部位非常重要，体积较大的肿瘤组织中有退变或坏死区，取材时尽量避免用退变组织，要挑选活力较好的部位。癌性转移淋巴结或胸腹水是好的培养材料。取材后宜尽快进行培养，如因故不能立即，可贮存于4中
44、，但不宜栽过24小时。,2培养基：,肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格，一般常用的 RPMIl640、 DMEM、Mc-Coy5A等培养基等皆可用于肿瘤细胞培养。肿瘤细胞对血清的需求比正常细胞低，正常细胞培养不加血清不能生长，肿瘤细胞在低血清培养基中也能生长。肿瘤细胞对培养环境适应性较大，是因肿瘤细胞有自泌（Autocrine）性产生促生长物质之故。但这并不说明肿瘤细胞完全不需要这些成分。按不同细胞需要不同的生长因子；肿瘤细胞与正常细胞之间、肿瘤细胞与肿瘤细胞之间对生长因子的需求都存在着差异。但大多数肿瘤细胞培养中仍需要生长因子。有的还需特异性生长因子如乳腺癌细胞等）。总之培养肿瘤细胞仍需
45、加血清和相关生长因子培养更易成功。,3成纤维细胞的排除：,成纤维细胞常与肿瘤细胞同时混杂生长，致难以纯化肿瘤细胞。而且成纤维细胞常比肿瘤细胞生长得快，最终能压制肿瘤细胞的生长。因此排除成纤维细胞成为肿瘤细胞培养中的关键。排除成纤维细胞有多种方法（表21）。,（二）成纤维细胞排除法,1机械刮除法： 是用不锈钢丝末端插有橡胶刮头（用胶塞剪成三角形插以不锈钢丝）、或裹少许脱脂棉制成，装入试管中高压灭菌后备用（也可用特制电热烧灼器刮除）。刮除程序为： （1）标记：镜下观察，用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位； （2）刮除：弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶皿中，肉眼或显微镜窥视下，刮除无标记空
46、间； （3）用Hanks液冲洗一两次，洗除被刮掉的细胞； （4）注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至完全除掉为止,2反复贴壁法：,根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点，并结合使用不加血清的营养液，把含有两类细胞的细胞悬液反复贴壁，使两类细胞相互分离，操作方法与传代相同。 （1）待细胞生长达一定数量后，倒出旧培养液，用胰酶消化后，Hanks 冲洗2次，加入不含血清的培养液，吹打制成细胞悬液； （2）取编号为此A、B、C三个培养瓶；首先把悬液接种入A培养瓶中。置温箱中静止培养520分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后慢慢吸出全部培养液，再接种入B培养瓶中后；向A瓶中补
47、充少许完全培养液置温箱中继续培养； （4）培养B瓶中细胞520分钟后，接处理A的方法，把培养液注入C培养瓶中；再向B瓶中补加完全培养基。 当三个瓶内都含有培养液后，均在温箱中继续培养。如操作成功，次日观察可见A瓶主要为成纤维细胞，B瓶两类细胞相杂，C瓶可能主要为癌细胞。必要时可反复处理多次，直至癌细胞纯化为止。,（三）提高肿瘤细胞培养存活率和生长率措施,根据人们的经验，肿瘤细胞在体外不易培养，建立能传代的肿瘤细胞系更为困难。当肿瘤组织或细胞初代接种培养后，常出现以下几种情况： 完全无细胞游出或移动； 有细胞移动和游出，但无细胞增殖，细胞长时间处于停滞状态以致难以传代； 有细胞增殖，传若干代后停
48、止生长或衰退死亡； 传数代后细胞增殖缓慢，经过一段停滞期后，才又呈旺盛生长状态，形成稳定生长的肿瘤传代细胞系。 以上现象说明肿瘤细胞对体外生存条件有较高的要求，并需经过对新环境的适应才能生长，因此欲获得好的培养效果，不能局限于一般培养法,采用一些特殊的措施,1适宜底物： 把经过纯化的细胞接种在不同的底物上，如鼠尾胶原底层、饲细胞层等。 2生长因子： 应用促细胞生长因子，向培养液中增加一种或几种促细胞生长因子。根据细胞种类不同选用不同的促生长物，常用有胰岛素、氢化可的松、雌激素以及其它生长因子。 为提高肿瘤细胞对体外培养环境的适应力和增加有活力癌细胞（干细胞）的数量，。,3.动物体媒介培养方法： （1）瘤块接种：取新鲜瘤组织，用Hanks液洗净血污，切成13毫米小块，用穿刺针头吸一小瘤块，用酒精棉球擦拭动物腹部后，直接刺入皮下，注入瘤块； （2）饲养观察，待肿瘤生长达较大体积后，剥取出瘤组织； （3）进行体外培养。 （4）为防止失败，仍取部分瘤组织继续在裸鼠体内传代。通过裸鼠媒介接种，有活力的肿瘤细胞数量增多，细胞培养易于成功,