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1、华中农业大学本科毕业论文（或设计） 1 本科毕业论文本科毕业论文 题题 目：目： 山羊褪黑激素受体山羊褪黑激素受体 1A1A 基因基因HinHinff酶切酶切 多态性及其与产羔数性状的关联分析多态性及其与产羔数性状的关联分析 姓姓 名：名：学学 号号 专专 业：业： 动动 物物 科科 学学 指导教师：指导教师：职职 称称 华中农业大学本科毕业论文（或设计） 2 分类号 密级 华华中中农农业业大大学学本本科科毕毕业业论论文文 山羊褪黑激素受体山羊褪黑激素受体 1A1A 基因基因HinHinff酶切多态性及其与酶切多态性及其与 产羔数性状的关联分析产羔数性状的关联分析 Hinf-RFLP of M
2、elatonin receptor 1 A(MTNR1A) gene and the association with the litter size traits in goat 华中农业大学本科毕业论文（或设计） 3 目 录 摘 要.4 ABSTRACT5 前 言.6 1.材料与方法7 1.1 材料.7 1.1.1 试验动物7 1.1.2 实验材料7 1.1.3 主要试剂的来源 7 1.1.4 主要仪器设备 8 1.1.5 主要试剂的配置 8 1.1.6 主要分子生物学软件 .10 1.2 方法10 1.2.1.山羊基因组 DNA 的提取.10 1.2.2.引物设计及其序列.10 1.2.
3、3.PCR 扩增及其电泳检测 .11 1.2.4. 限制性内切酶消化扩增产物以及电泳检测.13 1.2.5.统计分析.14 2 结果与分析15 2.1 PCR 扩增结果 .15 2.2 酶切结果 .15 2.3 褪黑激素基因频率和基因型频率分析结果.16 2.4 MTNR1A 基因型与波尔山羊头胎产羔数性状的关联分析 17 2.5 MTNR1A 基因型与经产产羔数性状的关联分析 17 3 讨论18 31 不同山羊品种基因型频率及基因频率差异18 32 MTNR1A 不同基因型对波尔山羊头胎和经产羔数的影响 .18 参考文献.19 致 谢20 华中农业大学本科毕业论文（或设计） 4 山羊褪黑激素
4、受体山羊褪黑激素受体 1A1A 基因基因HinHinff酶切多态性及其与产羔数酶切多态性及其与产羔数 性状的关联分析性状的关联分析 摘摘 要要 本研究以褪黑激素受体 1A 基因为候选基因，分析该基因多态性对山羊产 羔数性状的影响。采用限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length polymorphism， PCR-RFLP）方法，检测了 65 只波尔山羊和 51 马头山羊褪黑 激素受体 1A 基因 Hinf酶切多态性及其与产羔数性状的关联分析。结果表明， 褪黑激素受体 1A 基因在波尔山羊中存在 Hinf酶切多态性，而在马头山羊样 本中则无多态性。在波尔山羊中，
5、检测到 AA、GG 两种基因型，未检测到 AG 型；其中 AA 基因型个体在出现频率最高，为 0.554，GG 型为 0.446；A、G 等 位基因频率分别为 0.554 和 0.446。性状关联分析结果表明：波尔山羊的 AA 基 因纯合型头胎平均产羔数比 GG 基因杂合型多 0.07 只，加性效应值为 0.035， 显性效应值为-1.42；经产羔数的 AA 型比 GG 型多 0.09 只；加性效应值为 0.046，显性效应值为-1.84。A 等位基因可能与波尔山羊产羔数呈正相关，该 位点主要以加性方式起作用。 关键词关键词：山羊；繁殖性状；褪黑激素受体；PCRRFLP 华中农业大学本科毕业论
6、文（或设计） 5 Hinf-RFLP of Melatonin receptor 1 A（MTNR1A） gene and the association with the litter size traits in goat Abstract In the present study， Melatonin receptor 1 A gene （MTNR1A） was analysed to find the assocation with litter size in goat as a candidate gene. Hinf- RFLP （Restriction Fragment Len
7、gth polymorphism， RFLP） of MTNR1A was found in 65 Boer goats and 51 goats Ma Tou. No polymorphism was detected in Ma Tau goats . Two genotypes AA， GG were found in Boer goats. The frequency of AA genotype was higher than GG genotype， which were 0.554 and 0.446， respectively. The allele frequencies f
8、or A and G were 0.554 and 0.446. The results of traits association analysis showed that individuals with AA genotype had additional 0.07 average litter size at first kidding in Boer Goat. The additive effect value was 0.035， while the dominant effects value -1.42. Moreover， AA genotype had additiona
9、l 0.09 average litter size for multiparity， the additive and dominant effects value were 0.046 and -1.84， respectively. Allele A was possiblely positively correlated with litter size in Boer goats. The additive effect was dominant at the site. Key words: Goat； Reproductive traits； MTNR1A； PCR-RFLP C
10、omment PY1: 参考文献中未列出 Comment PY2: 以上迹象表明，这 是直接从网上下载的。 华中农业大学本科毕业论文（或设计） 6 前前 言言 褪黑激素主要是由松果体合成的，其它合成部位还有:视网膜、眼眶腔的副 泪腺、唾液腺、肠的嗜铬细胞及红细胞，松果体把对外界光照形成的神经信息 经下丘脑视交叉上核转变成体液信息MEL。 1.褪黑激素生理功能、作用机制； 褪黑激素对生殖系统作用的机理主要是通过光作用于视网膜，然后通过视 网膜- 下视丘至视交叉上核，再经过一系列复杂的神经交换至颈上神经节，其 节后交感神经作用于松果体。松果体分泌褪黑激素，通过下丘脑垂体性腺轴 影响生殖系统。褪黑激
11、素对生殖系统的作用因动物种类、生理状态不同而表现 出抑制、促进或无作用的多重性（焦传珍，2005） 。多项研究结果表明，褪黑激 素虽然对牛、鼠类、禽等动物和人的生殖系统的发育有抑制作用，但是对绵羊、 山羊、鹿等动物则明显表现出促进作用。 2褪黑激素受体类型、作用机制； 褪黑激素受体属于 G 蛋白耦联受体家族。根据其分子生物学方法又可分为 MTNR1A、MTNR1B、MTNR1C 三种亚型（张凯等，2006）。目前在哺乳动物中还没 有发现MTNR1C 受体，而具有明显季节性繁殖特征的动物仅在垂体结节部发现 MTNR1A 受体，提示垂体结节部可能是褪黑激素繁殖效应的作用位点。 3褪黑激素受体分子标
12、记在其它动物中的研究进展 目前国内外对绵羊 M TNR1A 基因已经有所研究已经很多了。Messer 等 （1997）和 Notter 等（2003）用 M n l和 R sa酶分别对白面杂种羊、萨福克 羊、特克塞尔羊、柯泊华斯羊和合成系绵羊群体M TNR1A 基因外显子 2 的 824 bp 扩增产物进行消化，发现 M n l在 5 个绵羊群体中都存在 286 bp 和 236 bp 多态片段， R sa都存在 295 bp 和 290 bp 多态片段。Pelletier 等 （2000）用 M n l限制性内切酶消化 2 组发情行为有明显差异（常年发情和季 节性发情）的 Merinos d
13、Arles 母绵羊以及季节性发情明显的 Ile2de2France 母 绵羊M TNR1A基因外显子 2 的 824 bp 扩增产物，发现存在 303 bp 和 236 bp 多态片段。季从亮等（2003）和 Chu 等（2003）用 M n l和 R sa对常年发 情的小尾寒羊和湖羊以及季节性发情的多赛特羊和萨福克羊共 146 只绵羊M TNR1A 基因外显子 2 的 824 bp 扩增产物进行 PCR-RFLP 多态性分析，发现 M n l在 4 个绵羊品种中都存在 303 bp 和 236 bp 多态片段， R sa都存在 290 bp 和 267 bp 多态片段。在绵羊中的研究结果表明
14、，该基因对绵羊繁殖性能存 在影响。但是，对于山羊，只有对产绒或营养调控的研究，目前尚未发现有对 山羊繁殖性能影响的相关报道。 Comment PY3: 与滑国华的区别？ 更确切地说，创新点？或特色？ 华中农业大学本科毕业论文（或设计） 7 4本实验目的意义 本实验室滑国华等（2006）在山羊MTNR1A 中共发现 7 个 SNPs，对其中 4 个 SNPs 分析结果显示：MTNR1A不同基因型对山羊产羔数性状有一定的影响。 为进一步研究该基因对山羊产羔数性状的影响，本试验选取 G493A 突变位点， 采用引入酶切位点方法，即限制性片段长度多态性 Forced PCR- RFLP（Polymer
15、ase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphsim） ， 分析该位点在马头山羊和波尔山羊中的分布情况，并分析该位点对波尔山羊产 羔数影响，为山羊标记辅助选择提供理论依据。 1.1.材料与方法材料与方法 1.11.1 材料材料 1.1.11.1.1 试验动物试验动物 马头山羊 51 头，采自湖北省十堰市；波尔山羊 65 头，采自湖北省宜都市 波尔山羊种羊场。颈静脉采血 10ml/只，EDTA 抗凝，-20保存。 1.1.21.1.2 实验材料实验材料 1.5ml Eppendorf 管、双面板、微量移液枪 （1000l、200l
16、、40l、10l、2.5l）及枪头、 一次性 PE 塑料手套。 1.1.31.1.3 主要试剂的来源主要试剂的来源 TagDNA聚合酶购自上海生工生物工程技术有限公司； DNA限制性内切酶Hinf购自晶美生物工程有限公司； 分子量标准100bp DNA Ladder和PBR322DNA/MspI购自上海生工生物工程技 术有限公司； 三羟甲基氨基甲烷（Tris） 、苯酚、蛋白酶K、十二烷基硫酸钠（SDS） 、甲 酰胺、丙烯酰胺（Acrylamide，Acr） 、NN亚甲基丙烯酰胺 （Bisacrylamide） 、琼脂糖、溴化乙锭（EB） 、琼脂糖、乙二胺乙二酸二钠盐 （EDTANa2）等均购自
17、武汉凌飞科技有限公司。 华中农业大学本科毕业论文（或设计） 8 1.1.41.1.4 主要仪器设备主要仪器设备 表表 1 1 主要仪器设备主要仪器设备 Table 1 Laboratory equipment and instruments 仪器设备名称型号生产厂家 电热恒温水浴锅 GD120 英国 Grant 公司 台式离心机 TGL-16G 上海安亭科学仪器厂 梯度 PCR 仪T1 Thermo cyler德国 Biometra 公司 冷冻离心机 Centrfuge 5810 德国 eppendorf 公司 恒温摇床 HS80 中国科学院武汉科学仪器厂 自动双重纯水蒸馏器 SZ-93 上海
18、亚荣生化仪器厂 紫外分析仪 UV-IV 北京市新科技应用研究所 电泳槽 DYY-III 北京六一仪器厂 稳压稳流电泳议 DYY-2 北京六一仪器厂 手提式高压灭菌锅 YXQ-SG46-280A 上海博讯实业有限公司医疗设备厂 超纯水仪 WaterPro 美国 LABCONCO 公司 移液器 1ml；200l；40l； 10l；2.5l 芬兰 Labsystems 公司 1.1.51.1.5 主要试剂的配置主要试剂的配置 1.1.5.11.1.5.1用于血液样品采集的溶液的配制用于血液样品采集的溶液的配制 1) 1M Tris.cl储备液：称取121.4g Tris碱溶于800ml双蒸水中，加浓
19、盐酸调 至pH=8.0，定容到1000ml。高压灭菌，室温保存； 2) 0.5M EDTA（pH=8.0）：称取186.1g Na2EDTA2H2O溶于800ml双蒸水中，加 入NaOH（约20g）调至pH=8.0，定容到1000ml。高压灭菌，室温保存； 3) 10%SDS：称取50g SDS加热溶于400ml双蒸水中，定容至500ml。高压灭菌， 室温保存； 4) 抗凝剂（0.2MEDTA）：量取200ml 0.5M EDTA加入双蒸水定容至500ml。 1.1.5.21.1.5.2 用于基因组用于基因组DNADNA提取的溶液的配制提取的溶液的配制 1) 蛋白酶K：称取200mg蛋白酶K溶
20、于10ml双蒸水，以1ml分装，-20冷冻保存； 2) 氯仿/异戊醇（24:1）：量取480ml氯仿，加入20ml异戊醇，混匀； 华中农业大学本科毕业论文（或设计） 9 3) 3M NaAc：称取NaAc3H2O溶于400ml双蒸水中，用HAc调至pH=5.2，加水定 容至500ml。高压灭菌，室温保存； 4) TE缓冲液：100mM Triscl（pH8.0） ，1mM EDTA（pH8.0） 。 1.1.5.31.1.5.3 用于琼脂糖凝胶电泳及检测溶液的配制用于琼脂糖凝胶电泳及检测溶液的配制 1) 50TAE储备液： 称取242g Tris碱溶于750ml双蒸水中，加入57.1ml HA
21、c、100ml 0.5M EDTA（pH8.0） ，加水定容至1000ml； 2) 5TBE储备液：称取54g Tris碱和27.5g硼酸溶于750ml双蒸水中，加入 20ml 0.5M EDTA（pH8.0） ，加水定容至1000ml； 3) 6上样缓冲液：0.25%溴酚兰，0.25%二甲苯青，15%Ficoll聚蔗糖； 4) 溴化乙锭（EB，10mg/ml）:100ml双蒸水中加入0.1g EB，搅拌使完全溶解， 转入棕色试剂瓶，锡箔包裹。 1.1.5.41.1.5.4 用于聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染的溶液的配制用于聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染的溶液的配制 1) 30% 丙烯酰胺（丙烯酰胺:甲叉
22、双丙烯酰胺29:1）:700ml双蒸水中加入 290g丙烯酰胺，10g甲叉双丙烯酰胺，搅拌使完全溶解，加水定容至 1000ml，4保存； 2) 10% 过硫酸铵：称取1g过硫酸铵溶于8ml双蒸水，定容至10ml； 3) 10% 乙醇：量取50ml无水乙醇溶于450ml水中，混匀； 4) 1% HNO3：量取15ml浓HNO3溶于985ml双蒸水中，混匀； 5) 0.2% AgNO3：称取1g AgNO3溶于500ml双蒸水中，置于棕色试剂瓶； 6) 3% Na2CO3（0.05%甲醛）：称取30g无水Na2CO3溶于900ml双蒸水中，加入 1.5ml甲醛，定容至1000ml； 7) 3% H
23、Ac：量取30ml冰HAc溶于970ml双蒸水，混匀。 1.21.2 方法方法 1.2.1.1.2.1.山羊基因组山羊基因组 DNADNA 的提取的提取 从山羊颈静脉采血10ml，放入装有抗凝剂（0.5mol/L EDTANa2）的离心管 中，6000r/min离心15min，弃上清，吸取白细胞沉淀（参杂少量红细胞）于另 一离心管中；加入两倍体积双蒸馏水（灭菌） ，摇匀沉淀，静置10min15min， 破碎红细胞；6000r/min离心15min，轻轻弃去上清，留白细胞沉淀；加入 1SET 5ml，蛋白酶K（10mg/ml）0.1ml至终浓度200ng/ml，10% SDS 250l至 终浓度
24、0.5%，55水浴消化过夜；加入等体积饱和平衡酚轻轻摇匀， 12000r/min离心15min，轻轻吸取上层水相于另一离心管中，弃下相苯酚；重复 上步；加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1） ，轻轻摇动10min，12000r/min 离心15min，轻轻吸取上层水相于另一离心管中，弃下层有机相；加入等体积氯 华中农业大学本科毕业论文（或设计） 10 仿/异戊醇（24:1） ，轻轻摇动10min，12000r/min离心15min，轻轻吸取上层水 相于另一离心管中，弃下层有机相；加入两倍体积预冷无水乙醇，轻轻转动管 子，DNA呈絮状析出，用1ml吸头（灭菌）吸出DNA沉淀，放入1.5m
25、l离心管中， 加入预冷无水乙醇洗涤一次，离心弃去无水乙醇，再用75%乙醇漂洗2次，小心 吸去乙醇，待DNA沉淀自然干燥后，加入适量TE（100l300l）溶解。 1.2.2.1.2.2.引物设计及其序列引物设计及其序列 引物参考滑国华等（2008）进行设计，序列如下： 上游引物: 5ACGACCCGAGGATCTATTCC 3 下游引物: 5ATATAAGTCCTGGGGCTTCAGA ATT 3 ， 在下游引物中引入错配碱基 A，当突变位点为 G（即反义链为 C）时，可形 成Hinf（GATTC）酶切位点；当突变位点为 A（即反义链为 T）时，该酶切位 点缺失，由此可进行基因型判定。 1.2
26、.3.PCR1.2.3.PCR 扩增及其电泳检测扩增及其电泳检测 1.2.3.11.2.3.1 PCRPCR 扩增反应体系（表扩增反应体系（表 2 2） 表表 2 2 PCRPCR 扩增反应体系（扩增反应体系（20l20l） Table 2 PCR amplification of the response system （20l20l） 反应体系反应体系 responseresponse systemsystem 反应体积反应体积 V V（ll） responseresponse volumevolume（ll） 灭菌蒸馏水 14.6 10Buffer2 Mg2+1.2 dNTP0.2 上游
27、引物 0.4 下游引物 0.4 Taq DNA 聚合酶（5 U/ml） 0.2 模板 DNA 1 Total20 1.2.3.21.2.3.2 退火温度的优化退火温度的优化 利用 PCR 机器上都有一个 Gradient 功能，在一次 PCR 过程中，对机器中不 华中农业大学本科毕业论文（或设计） 11 同位点的反应采用不同的退火温度，一般在第一次实验中，采用引物溶点上下 10 度设置退火温度梯度。每个温度梯度一个反应，最后电泳检测并比较各个退 火温度的条带效果，得到最好结果。本试验中退火温度设定为 5565，结果 表明，退火温度 60时，无非特异性带，目的条带最为清晰。 1.2.3.31.2
28、.3.3PCRPCR 反应程序（表反应程序（表 3 3） 表表 3 3 PCRPCR 反应程序反应程序 Table 3 PCR amplification of the response term 步骤 steps PCR 反应条件 PCR reaction conditions 温度 temperature 时间 time 1 预变性 955min 2C 变性 9530sec 3C 退火 6030sec 4C 延伸 7230sec 5 延伸 727min 6 保温 1610min 第二步至第四步循环 35 次。 1.2.3.41.2.3.4 琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增
29、产物用 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测， EB 染色，利用 BIORAD 凝胶成 相系统凝胶成像系统进行成像分析，记录结果并拍照。 1.2.3.4.1 琼脂糖凝胶电泳方法 （1） 灌胶 将透明胶带粘于灌胶模槽的两端，制成灌胶模。放入梳子。将模放于水平 台上。取一烧杯，放入：琼脂糖 0.75 g； 1TAE 50 ml。混匀，加热，至琼 脂糖彻底溶解。待稍冷后，加入 5ul 饱和的溴乙锭，轻晃混匀，然后轻轻倒入 模子。用吸头吸去表面小泡。待冷却成胶。 （2）上样电泳 轻轻拔出梳子，将胶两头的透明胶带揭去，移入电泳槽，点样孔一侧靠近 操作者，注入 1TAE 缓冲液，浸没凝胶。使用微量可调采样器取 3l
30、 DNA 充 分混匀于适量溴酚兰，点样于 1.5琼脂糖凝胶孔内，并点 3l 600bp Marker作为参照。点样时，加样头尖端插入上样孔内 1/3 高度，轻轻将样品 华中农业大学本科毕业论文（或设计） 12 推入，避免刺入前后凝胶和刺穿凝胶底部。使比重较大的样品自然沉入上样孔 底。接上电源：阳极远离上样孔，阴极靠近上样孔（DNA 向阳极移动） 。开启电 源，电压调至 100V。2030min 后检查。 1.2.3.4.2 成像分析 利用 BIORAD 凝胶成相系统凝胶成像系统进行成像分析，记录结果并拍照。 1.2.4.1.2.4. 限制性内切酶消化扩增产物以及电泳检测限制性内切酶消化扩增产物
31、以及电泳检测 1.2.4.11.2.4.1 酶切反应体系（表酶切反应体系（表 4 4） 表表 4 4 酶切反应体系酶切反应体系 Table 4 PCR and the amount of the components 反应体系反应体系 responseresponse systemsystem 反应体积反应体积 V V（ll） responseresponse volumevolume（ll） 灭菌蒸馏水 4.7 10Buffer1 Hinf限制性内切酶 0.3 PCR 产物 4 Total10 将上述酶切体系置 37水浴锅或恒温箱中酶切过夜。 1.2.4.21.2.4.2 非变性聚丙烯酰胺凝
32、胶电泳检测非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 1.2.4.2.11.2.4.2.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤 不同的实验需要优化聚丙烯酞胺凝胶的交联度和浓度，才能达到最好的实 验效果，本实验采取一下方法： 1. 在小烧杯中加入 18.43m1 双蒸水，9.33ml 30%丙烯酞胺（29:1） ，7ml 的 5TBE 混匀； 2. 清洗制胶用玻璃板，烘干后用透明胶封好底边和侧边，固定在制胶用的有 机玻璃板上； 3. 向小烧杯中加入 245ul 的 10%AP，13ul TEMED 混匀后迅速灌胶； 4. 当胶灌至离玻璃板上边缘 0.5cm 时停止灌胶，插入梳子，注意梳齿下不
33、要 有气泡，室温聚合 1 小时； 5. 凝胶聚合好后，拔出梳子，注射器吸出梳齿孔中未聚合的液体； 6. 取下玻璃板，撕下胶线，固定在电泳槽上，倒入电泳缓冲液 1TBE； 7. 在 PCR 产物中加入 1/6 体积上样缓冲液，用微量进样器取 5u1 酶切样点样， 华中农业大学本科毕业论文（或设计） 13 同时点分子量标记物 PBR322/Mspl； 8.8. 上样完毕后，打开电泳议以 80V 电泳 20min，再调到 120V 电泳 45h。 1.2.4.2.21.2.4.2.2 聚丙烯酰胺凝胶染色步骤聚丙烯酰胺凝胶染色步骤 1. 拆下电泳装置，剥下聚丙烯酰胺凝胶，放到一个塑料盘内，用双蒸水冲漂
34、 洗 2 次； 2. 加入 500ml 10乙醇固定液，在摇床上固定 810 min，弃去反应液； 3. 加入 500ml 1HNO3 氧化，在摇床上轻摇 810 min，弃去反应液，用双蒸 水漂洗 2 次； 4. 倒入 500ml 0.2AgNO3银染液，染色 1530 min，弃去反应液，用双蒸水 漂洗 2 次； 5. 加入 500ml 3Na2CO3显色液，手摇显色至出现清晰的银染带，迅速弃去 反应液； 6. 用 500ml 3HAC 停止显色； 7. 将已经染好的聚丙烯酰胺凝胶置于透射白光板上，观察酶切反应结果、记 录并拍照。 1.2.5.1.2.5.统计分析统计分析 基因频率与基因型
35、频率使用软件 SPSS10.0 进行统计分析，不同基因型对产 羔数的最小二乘均值分析使用 SAS（8.0 版）GLM（General Linear Model）软 件包进行，模型如下： Yijkl=+Gi+Pi+eijk Yijkl为产羔数， 为群体均值，Gi为基因型效应，Pi为胎次效应，eijk为 随机效应。 基因效应分析： 加性效应=（GG-AA）/2 显性效应=AG-（AA+GG）/2 2 2 结果与分析结果与分析 2.12.1 PCRPCR 扩增结果扩增结果 扩增波尔山羊和马头山羊基因组，产物用 2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，得到 的片段与预期片断大小一致（197bp） ，条带清晰（图
36、1） ，特异性高，满足后续 分析要求。 华中农业大学本科毕业论文（或设计） 14 图图 1 1 PCRPCR 扩增结果扩增结果 注：注：M M， MarherMarher 100bp100bp DNADNA LadderLadder；1 1、2 2、3 3 为波尔山羊为波尔山羊 DNADNA 扩增产物；扩增产物； 4 4、5 5、6 6 为马头山羊为马头山羊 DNADNA 扩增产物扩增产物 Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of PCR product. M，1-3，4-6: 100bp100bp DNADNA LadderLadder， PCR produ
37、ct of ?goat， PCR product of ?goat 2.22.2 酶切结果酶切结果 利用限制性内切酶Hinf对 PCR 扩增产物进行酶切，使用 8%的聚丙烯酰胺 凝胶（29：1）电泳检测酶切产物。 在 197 bp 的扩增片段在 118bp 处存在另一Hinf酶切位点，酶切后产生 118 bp 和 79bp 片段，其中波尔山羊在 118 处的酶切位点存在多态性，酶切位 点的存在与缺失产生 2 种基因型，分别命名为 AA 和 GG:AA （ 118bp /118 bp ） 、GG（118bp /79bp ） ，酶切图谱见图 2 ；而马头山羊在 118 处的酶切位 点则无多态性，基
38、因型均为 AA 型。酶切图谱见图 3 。 图图 2 2 波尔山羊酶切图谱波尔山羊酶切图谱 注：注：M M， pBR322/MsppBR322/Msp 1 1 MarherMarher；1 11313 为酶切产物条带为酶切产物条带 华中农业大学本科毕业论文（或设计） 15 Fig.2 genotypes of the M TNR1A fragment defined by PCR-RFLP 图图 3 3 马头山羊酶切图谱马头山羊酶切图谱 注：注：M M， pBR322/MsppBR322/Msp 1 1 Marher1Marher18 8 为酶切产物条带为酶切产物条带 Fig.3 genotyp
39、es of the M TNR1A fragment defined by PCR-RFLP 2.32.3 褪黑激素基因频率和基因型频率分析结果褪黑激素基因频率和基因型频率分析结果 分析两种山羊品种的褪黑激素基因型频率发现，在该酶切位点，马头山羊 只出现 AA 基因型，波尔山羊虽然出现两种基因型，但 AA 型频率高于 GG 型。在 所检测的两个群体中，A 等位基因是优势等位基因。 表表 6 6 山羊山羊MTNRMTNR1A1A 基因基因HinHinff酶切基因型和基因频率分布表酶切基因型和基因频率分布表 Table 6 Genotype and allele frequencies of Hi
40、nf-RFLP for the Goat M TNR1A gene 2.42.4 MTNR1AMTNR1A 基因型与波尔山羊头胎产羔数性状的关联分析基因型与波尔山羊头胎产羔数性状的关联分析 品种品种 BreedBreed 数量数量 N N 基因型基因型 GenetypeGenetype 基因型频率基因型频率 GenetypeGenetype frequencyfrequency 等位基因频率等位基因频率 AlleleAllele frequencyfrequency AA0.554A 0.554 波尔山羊 65 GG0.446G 0.446 马头山羊 51AA1A 1 华中农业大学本科毕业论文
41、（或设计） 16 由表 7 可知，波尔山羊的 AA 基因纯合型头胎平均产羔数比 GG 基因杂合型 多 0.07 只，加性效应值为 0.035，显性效应值为-1.42。研究表明：波尔山羊 的 A 等位基因可能与山羊头胎产羔数呈正相关，该位点主要以加性方式起作用。 表表 7 7 波尔山羊波尔山羊MTNRMTNR1A1A基因型对头胎产羔数性状的最小二乘均值及基因效应分析基因型对头胎产羔数性状的最小二乘均值及基因效应分析 Table 7 Least squares means and allele substitution effects for litter size at first kiddin
42、g in boar goat 2.52.5 MTNRMTNR1A1A 基因型与经产产羔数性状的关联分析基因型与经产产羔数性状的关联分析 由表 8 可知，波尔山羊的 AA 型经产羔数比 GG 型多 0.09 只；加性效应值为 0.046，显性效应值为-1.84。结果表明：A 等位基因可能与波尔山羊产羔数呈 正相关，该位点主要以加性方式起作用。 表表 8 8 波尔山羊波尔山羊MTNR1A基因型对经产产羔数性状的最小二乘均值及基因效应分析基因型对经产产羔数性状的最小二乘均值及基因效应分析 Table 8 Least squares means and allele substitution effe
43、cts for litter size in multiparous boar goat 3 3 讨论讨论 3 31 1 不同山羊品种基因型频率及基因频率差异不同山羊品种基因型频率及基因频率差异 品种品种 BreedBreed 数量数量 N N 基因型基因型 GenetypeGenetype 最小二乘均值最小二乘均值标准误标准误 LeastLeast squaressquares meansstandardmeansstandard errorerror 加性效应加性效应 additiveadditive effeceffec 显性效应显性效应 dominantdominant effects
44、effects AA1.45450.5222 波尔山羊 65 GG1.38460.5064 0.035-1.42 基因型基因型 GenetypeGenetype 最小二乘均值最小二乘均值标准误标准误 LeastLeast squaressquares meansstandardmeansstandard errorerror 加性效应加性效应 additiveadditive effectseffects 显性效应显性效应 dominantdominant effectseffects AA1.88270.5871 GG1.79050.5988 0.046-1.84 华中农业大学本科毕业论文（
45、或设计） 17 利用荧光原位杂交方法和遗传连锁分析方法，褪黑激素受体 1A 已经在绵羊 等多种动物中得到精细定位。并有多个研究结果表明，褪黑激素受体 1A 基因与 绵羊的繁殖性状有着紧密的关联。在本研究所检测的两个山羊群体中，基因型 频率及基因频率存在较大差异。本研究结果显示：马头山羊是 AA 基因型纯合群 体，而波尔山羊中存在 AA 和 GG 两种基因型。这可能与两个品种的育成史有关。 马头山羊是湖北省本地品种，长期闭锁选育，湖北马头山羊具有个体大、生长 快、繁殖率高等特点，其全年均可发情，母羊一年产 2 胎，年产羔率 428%，平 均窝产羔数 2.14 头，马头山羊繁殖力远远高于全国其它地
46、方良种山羊品种（杨 利国，2004） 。波尔山羊是引入品种，平均窝产羔数为 1.93 头，低于马头山羊。 这也与本研究结果符合，本研究结果显示 AA 基因型头胎和经产羔数均大于 GG 型，而马头山羊群体均为 AA 基因型。 3 32 2 MTNRMTNR1A1A 不同基因型对波尔山羊产羔数的影响不同基因型对波尔山羊产羔数的影响 本研究结果显示：在山羊样本中，无论是头胎还是经产山羊，褪黑激素受 体 1A 不同的基因型对性状的影响表现都为 AAGG，由于受到样本含量限制， 该差异并未达到显著水平，但是该结果初步揭示褪黑激素受体 1A 基因可能与山 羊繁殖性状相关，而该基因是否能够作为分子标记应用于
47、山羊繁殖性状标记辅 助选择，则需进一步扩大样本含量，增加品种个数进行验证。 参考文献参考文献 1 滑国华山羊繁殖性状五个候选基因多态性及其与产羔数性状关联分 析硕士学位论文武汉：华中农业大学图书馆，2006 2 吴伟生抑制素基因作为山羊多胎性侯选基因的研究硕士学位论文 武汉：华中农业大学图书馆，2006 3 周文然，储明星，孙少华等小尾寒羊高繁殖力候选基因 INHA 的研 究农业生物技术学报,2007,15(1)：32-36 4 陈桂芳，李齐发，强巴央宗等西藏牦牛和黑白花奶牛生长激素基因 Alu多态性的比较研究畜牧与兽医，2002，35：11 5 储明星，程笃学，刘文忠褪黑激素受体 1A 基因
48、外显子 2 与小尾寒羊高 繁殖力的关联安徽农业大学学报， 2008，35 (1) ：124 6 王林枫光照和埋植褪黑激素对内蒙古白绒山羊含氮物质分配和产绒性能 的影响及调控的研究硕士学位论文内蒙古：内蒙古农业大学图书 馆，2004 7 闫守庆 ,王慧芳 ,祝万菊蓝狐与银狐褪黑激素受体 1A 基因的克隆及序 华中农业大学本科毕业论文（或设计） 18 列分析中国畜牧兽医， 2008，35：3 8 季从亮，储明星，陈国宏4 个绵羊品种褪黑激素受体 1a 基因第二外显 子 PCRRFLP 分析华中农业大学学报，2003，4（22）：2 9 郭玉强 ,蔡国宝 ,刘艳婷等褪黑激素对绵羊季节性繁殖的调控机理甘 肃畜牧兽医，2008，1：198 10张凯，文勇立，李学伟等褪黑激素受体基因表达的研究进展四川生理 科学杂志，2006;28（2）77-79 11焦传珍褪黑激素及其生理功能研究进展生物学教学，2005，30（2） 2-3 12杨利国湖北马头山羊20032004 年全国养羊生产与学术研讨会议论 文集，111-113 13 6 季从亮，储明星，陈国宏等. 4 个绵羊品种褪黑激素受体 1a 基因 第二外显子 PCR-RFLP 分析 J . 华中农业大学学报 ,2003,22（2）: 105-109 14 Barrett P, Conway S, Jockers R,