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1、许欣,1,细菌学检验,细菌学检验基本技术,许欣,2,第一节 样本的采集与送检,在公共卫生及预防医学领域所涉及的细菌学检验样本种类繁多，包括来自食品、化妆品、涉水产品、消毒及卫生用品、环境及物品（水、土壤、空气，各种物品）、正常人体及临床等的样本。,许欣,3,一、临床样本的采集与送检,（一）血及骨髓样本的采集 1. 采样时间：发热期、用药之前、 病情发展 2. 采样部位及频率：多部位、高频率 3. 样本采集的量：成人血量10ml，婴儿1ml2ml，儿童3ml5ml；当怀疑为真菌感染时，应采集双份量，分别作双相培养(37/28)。骨髓1 ml2 ml。 4. 样本的送检：尽快，室温 5. 注意事项
2、：同时需氧和厌氧培养,许欣,4,一、临床样本的采集与送检,（二）尿液样本的采集 1. 采样时间：晨尿、用药前 2. 采样方法：10ml，中段尿、肾盂尿、导尿 3. 注意事项：无菌操作，用药前 （三）粪便样本的采集 1. 采样时间：急性期、新鲜粪便 2. 采样方法：自然排便、直肠拭子、Cary-Blair运送培养基或pH7.0的甘油PBS 3. 注意事项：无菌操作、可能厌氧培养,许欣,5,一、临床样本的采集与送检,（四）痰及上呼吸道样本的采集 1. 采样时间：晨痰、鼻咽拭子 2. 采样方法：自然咳痰法、支气管镜采集法、胃内采痰法、气管穿刺法等 ；咽拭子 3. 注意事项：先漱口、结核分枝杆菌和真菌
3、可4保存,许欣,6,一、临床样本的采集与送检,（五）其它临床样本 化脓和创伤样本：棉拭子 脑脊液、胆汁、胸水、腹水、心包液、关节液和鞘膜液等：穿刺 生殖道：棉拭子 组织样本：内镜 炎症或组织坏死部位：手术,许欣,7,二、食品卫生细菌学检验样本,（一）样品采集原则 注意代表性，防止样品受污染、变质和细菌生长 大样(一整批 )、中样(混合200g )和小样(检样25g) （二）样品采集方法 无菌用具、包装完好、混合、震摇、冷冻、冷藏 （三）采样的数量 根据食品种类的不同，采样的数量也应不同 （四）注意事项 3h内送实验室，无菌操作,许欣,8,三、化妆品细菌学检验样本,（一）采样数量 每批两个大包装
4、抽取4个包装，10g或10ml （二）样本的处理 1. 液体样品：10倍稀释，油性物用液体石蜡、土温-80 2. 膏霜乳剂样品：亲水性-玻璃珠，疏水性-先行乳化 3. 固体样品的处理：均质后取上清液 （三）样品送检原则及注意事项 1. 维持样品污染原状（出厂污染状态） 2. 去除残留防腐剂及抑菌剂（吐温-80和卵磷脂 ） 3. 注意事项（室温存放，多项目时先做微生物）,许欣,9,四、生活饮用水细菌学检验样本,（一）水样采集 许多水体随时间和空间会发生很大变化，要采集具有代表性的样品，必须定出合理的采样规划。 （二）采样点的选择 注意样品的代表性，河水、湖水、地下水、自来水 （三）采样器具 采样
5、瓶、自动采样器、容器可加硫代硫酸钠 （四）样品送检及注意事项 4h内检验、可冷藏,许欣,10,五、消毒及卫生用品,（一）医疗卫生机构消毒及卫生用品 物表 ：5cm5cm灭菌规格板，100cm2 区域 空气：高度150cm、距墙100cm；面积30m2，设一条对角线上内、中、外3点；面积 30m2，设4角及中央5点，暴皿5min；或用采样器 手/皮肤粘膜：含中和剂棉拭子，5cm5cm规格板 医疗用品：破坏、棉拭子 消毒剂：1ml加至9ml中和剂中,许欣,11,五、消毒及卫生用品,（二）一次性使用的卫生用品 同一批号3个运输包装中至少随机抽取12个最小包装量；1/4用于检测、1/4用于留样、2/4
6、就地封存准备复测。,许欣,12,六、空气样本,平板沉降法和采样器采集法 （一）空气微生物采样器分类 按照采样方式的不同可分为两类(和类)，类是将微生物直接采到固体培养基上(如Andersen采样器)，类是把微生物先采到液体或其它介质上，再转种到培养基或细胞上显示(如Porton采样器)。,许欣,13,六、空气样本,按照流量的有效数字分，3位数以上为大流量(500 L/min)，23位数为中流量(499L/min11 L/min)，1位数为小流量(10L/min)。 按照采样器所用介质性质又可分为固体及液体采样器。 按采样器的工作原理可分为六种：撞击式、沉降式、过滤式、静电吸附式、旋风式和离心撞
7、击式采样器。,许欣,14,六、空气样本,（二）空气中细菌等微生物采样的介质 采样介质(包括培养基)对细菌等微生物具有支撑、黏附、保护和生长作用。常用有凡士林、聚硅酮，氧化烯二十二烷酮(OED)和SGB(糖、甘油、牛血清白蛋白) （三）空气中细菌等微生物采样方法及送检 1. 平板沉降法：参见医院空气采样规定。 2. 空气采样器采样：常用Andersen采样器,许欣,15,第二节 细菌的形态结构检查法,了解标本中有无细菌及其大致的数量。 验证培养物是否为纯种。 形态检查结果可做初步诊断。 不染色检查法和染色检查法。 借助显微镜对形态、大小、排列、结构的直接观察。,许欣,16,一、显微镜检查,1、普
8、通光学显微镜(light microscope)：分辨率0.2m，用于细菌染色标本的观察。 2、暗视野显微镜(dark-field microscope)：具有暗视野聚光器，用于观察不染色标本活菌的形态、运动方式。 3、相差显微镜(phase contrast microscope)：具有环状光栅聚光器和相差物镜，既可观察活体细胞的外形和运动方式，又能观察其内部细微结构及这些结构的数量。,许欣,17,二、不染色检查,细菌的活体观察，主要用于观察动力 悬滴法凹玻片 压滴法平玻片,许欣,18,三、染色检查,常用碱性染料（美蓝、孔雀绿、碱性复红、结晶紫、沙黄等） 单染色法，复染色法，特殊结构染色法（
9、鞭毛、芽孢、荚膜等），负染色法、荧光染色法，革兰染色法（结晶紫、碘液、95%酒精、碱性复红），抗酸染色法（分枝杆菌、石炭酸复红、美蓝）,许欣,19,大肠杆菌革兰染色阴性,许欣,20,金黄色葡萄球菌革兰染色阳性,许欣,21,变形杆菌周身鞭毛,许欣,22,绿脓杆菌单鞭毛,许欣,23,肺炎链球菌荚膜,许欣,24,钩端螺旋体,许欣,25,霍乱弧菌,许欣,26,破伤风芽胞杆菌,许欣,27,第三节 细菌的分离培养方法,所谓细菌的分离培养就是提供某细菌生长所需的各种条件（营养、温度、湿度、酸碱度和气体），将其从微生物混合物中培养出来的方法。 在细菌的分离培养过程中，必须采用无菌技术或称无菌操作。,许欣,28
10、,许欣,29,一、培养基的制备,（一）培养基的种类： 1. 按用途分类 基础培养基：仅最基本的营养成分。 营养培养基：在基础培养基上加入葡萄糖、血液、血清等。 增菌培养基：多为液体培养基，一般含有抑制剂，且是具有选择性抑制作用的抑制剂。 选择性培养基：多为固体培养基，加有抑制物质，抑制其它非目的菌的生长或使其生长不佳。 鉴别培养基：主要供细菌生化反应试验用。 专用培养基：适用于特定细菌的专门的培养基。,许欣,30,一、培养基的制备,2. 按物理性状分类 液体培养基 半固体培养基（琼脂含量0.30.8%） 固体培养基（琼脂含量1.22.0%） 3. 按成分分类： 合成培养基：由化学物质和成分已知
11、的各种物质所组成，可以是无机盐类，或无机盐类加有机物质。 天然培养基：化学成分不完全清楚，各批物质的成分很难一致，如蛋白胨、牛肉膏、血液、鸡蛋。,许欣,31,一、培养基的制备,（二）培养基的主要成分及其作用 1. 营养物质：碳源、氮源及其它营养物质（蛋白胨、肉浸液、牛肉浸膏、糖类、血液、鸡蛋、动物血清、酵母粉、生长因子、无机盐类）。 2. 水分：常用蒸馏水。 3. 凝固物质：琼脂 4. 抑制剂和指示剂：如胆盐、抗生素、染料等。,许欣,32,一、培养基的制备,3、制备培养基的一般程序 调配、矫正pH、过滤澄清、分装、灭菌、检定、保存七个步骤。 高压蒸汽灭菌（121、115 ）、流动蒸汽灭菌（10
12、0） 、血清凝固器灭菌（80） 、水浴低温灭菌（56）,许欣,33,二、细菌接种方法,（二）细菌的接种方法 1. 平板划线接种法（分离、鉴别 ） 2. 斜面接种法（纯培养、转种 ） 3. 半固体培养基接种法（观察动力和保存菌种 ） 4. 液体培养基接种法 （富集培养、生化反应等 ） 5. 平板涂布、倾注接种法（药敏、活菌计数等）,许欣,34,三、细菌的培养方法,1. 需氧培养法（常规培养） 2. CO2培养法 CO2孵箱法（CO2钢瓶 ） 烛缸法（CO2含量约为510，氧气约16% ） 化学法（如碳酸氢钠-盐酸法）,许欣,35,三、细菌的培养方法,3. 厌氧培养法 液体培养基的培养（凡士林、疱
13、肉、还原剂等） 固体培养基的培养（厌氧罐培养法，厌氧气袋法，厌氧培养箱法 ，气体喷射培养法（或称转管法）,许欣,36,四、细菌的生长现象,（一） 细菌在固体培养基上的生长现象 菌落形状、大小、表面性状、边缘情况、颜色、透明度、质地、粘度、乳化性。 血平板(溶血、溶血、双环) 卵黄琼脂(卵磷脂酶和脂酶：沉淀环和“珍珠包膜” ) 蛋白水解(清晰的环) 色素(水溶性，如绿脓色素、荧光色素等，脂溶性色素，如金黄色葡萄球菌的金黄色菌落),许欣,37,四、细菌的生长现象,气味（假单胞菌属：葡萄汁气味；变形杆菌：巧克力烧焦的臭味；链球菌：霉臭；梭菌：粪臭、腐败味；产黑色素类杆菌属细菌：辛辣味） （二） 细菌
14、在液体培养基中的生长现象 18h24h，包括：发育程度、浑浊度、沉淀、液体表面性状、其它（色素、气味、产酸、气体） （三） 细菌在半固体培养基中的生长现象 动力观察,许欣,38,第四节 细菌的生化反应检查法,一、糖类代谢试验 1. 糖(醇)发酵试验 糖类是作为碳源和能量来源提供细菌合成菌体成分必需的原料，由于细菌各自具有不同的酶系统，故对糖(醇)类的分解能力不尽相同。 酚红、溴麝香草酚蓝、溴甲酚紫和酸性复红等指示剂 液体、半固体、固体培养基 双糖(或三糖)高层斜面,许欣,39,一、糖类代谢试验,2. 甲基红（MR）试验 分解葡萄糖丙酮酸乳酸、乙酸、甲酸 pH4.5以下加入甲基红指示剂红色。 3
15、. 伏普(Voges-Proskauer)试验(V-P试验) 葡萄糖代谢中性最终产物乙酰甲基甲醇。葡萄糖丙酮酸乙酰甲基甲醇碱性溶液空气氧化二乙酰（丁二酮） 加入胍基（如肌酸或肌酐、-萘酚等） 红色化合物。,许欣,40,一、糖类代谢试验,4. -半乳糖苷酶试验 结构酶和适应酶（诱导酶） 迅速，延迟，不发酵乳糖 发酵乳糖的大肠菌能产生乳糖渗透酶和-半乳糖苷酶 邻-硝基苯-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)证明有无-半乳糖苷酶活性，可预测细菌发酵乳糖的能力。 菌悬液+ ONPG，无色的ONPG被水解，释放出黄色化合物邻-硝基苯酚(ONP),许欣,41,二、氨基酸和蛋白质代谢试验,1. 靛基质(吲哚)试验
16、细菌分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚，吲哚可与试剂中的二甲氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚，为红色化合物。 2. 硫化氢试验 某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸生成H2S，H2S可与加入培养基中的铅或铁离子生成黑色硫化物。,许欣,42,二、氨基酸和蛋白质代谢试验,3. 尿素酶试验 有些细菌(如某些变形杆菌)具有尿素分解酶，能分解尿素形成大量的氨，使培养基pH上升，而变成碱性，使含有酚红指示剂的培养基变成红色。 4. 明胶液化试验 某些细菌产生明胶酶可使明胶分解，失去凝固力，使其由半固体转化为液体状态。,许欣,43,三、有机酸盐和铵盐利用试验,1. 柠檬酸盐利用试验 有些细菌能利用柠檬酸盐作为唯一的碳
17、源，能在除柠檬酸盐外不含其它碳源的培养基上生长，分解柠檬酸盐，生成碳酸钠，使培养基变成碱性。 2. 马尿酸钠水解试验 B群链球菌具有马尿酸水解酶，可使马尿酸水解为苯甲酸和甘氨酸。苯甲酸与三氯化铁结合而沉淀或甘氨酸与茚三酮作用生成紫色化合物。,许欣,44,三、有机酸盐和铵盐利用试验,3. 丙二酸盐利用试验 某些细菌利用丙二酸盐作为唯一碳源时，丙二酸钠可被分解生成碳酸钠，使培养基变碱性。,许欣,45,四、酶类试验,1. 氧化酶试验（Kovacs试验） 氧化酶（又称细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，能使还原型的细胞色素C氧化成氧化型的细胞色素C，氧化型细胞色素C又使对苯二胺氧化，生成
18、红色的醌类化合物。 2. 过氧化氢酶试验（触酶试验） 过氧化氢酶又称触酶，可使细菌代谢过程中的过氧化氢分解为水和氧。,许欣,46,四、酶类试验,3. 硝酸盐还原试验 某些革兰氏阴性杆菌在代谢过程中，硝酸盐还原为亚硝酸盐亚硝酸盐+醋酸亚硝酸+对氨基苯磺酸重氮苯磺酸+-萘胺红色的N-萘胺偶氮苯磺酸。 4. 过氧化物酶试验 过氧化物酶的作用是将过氧化氢中氧转移给可被氧化的物质。以联苯胺作为被氧化的物质，如为过氧化物酶阳性细菌，加入过氧化氢可使联苯胺氧化成为蓝色。,许欣,47,第五节 细菌的血清学检验,血清学鉴定（serological identity） 已知诊断血清鉴定分离的细菌 血清学诊断（Se
19、rological diagnosis） 已知标准菌株测抗体，4倍上升 （一）凝集试验（Agglutination test） 玻片法和试管法 （二）沉淀试验（precipitation test） 环状沉淀试验，絮状沉淀试验，凝胶中沉淀试验,许欣,48,第六节 细菌毒素的检测,一、外毒素 主要来自G+菌，蛋白质，不耐热，抗原性强，选择毒性 抗体与滤液反应；已知细菌外毒素与患者血清反应；动物试验(如破伤风痉挛毒素) 1. 白喉外毒素(diphtheria exotoxin) ：Elek平板、动物实验 2. 肉毒毒素(botulinic toxin)：动物实验、中和试验,许欣,49,二、内毒素,
20、主要来自G-菌，LPS，耐热，抗原性弱，普遍毒性 1. 家兔热原试验（rabbit pyrogen test，RT） 2. 鲎试验（limulus test，LT） 3. 其它试验（免疫学、生物学、化学发光、流式细胞术、高效液相等）,许欣,50,第七节 细菌数量的测定,一、物理计数法 1. Breed计数法：100mm2区域，0.01ml涂片，亚甲兰染色，油镜视野（0.02mm2） 2. 比浊管计数法：BaSO4系列标准管 3. 分光光度计测定法：标准曲线,许欣,51,二、生物计数法,1. 半定量计数法(接种环0.01ml或0.001ml，平皿划线) 2. 倾注平板法：最常用 3. 旋管计数法
21、：加样后试管液态琼脂水平旋转，低倍镜计数 4. 滴液计数法：0.02ml样液直接滴加平板,许欣,52,二、生物计数法,5. 琼脂表面计数法：0.1ml样液，L-型玻棒涂抹 6. 膜滤过计数法：适合于含菌量低的水等样品 7. 微菌落快速计数法：醋酸纤维素薄膜及透明固定液(乙醇80ml与冰醋酸20ml) ，5小时培养，染色后低倍镜观察。 8. 最可能数(MPN)的估计,许欣,53,第八节 L-型细菌检查法,L-型细菌是一种细菌通过变异而产生的细胞壁缺陷型。 已知几乎所有的细菌都可形成L-型。 真菌、放线菌、螺旋体、立克次氏体和衣原体等也可出现细胞壁的缺陷。 L-型细菌亦有致病作用，并与许多慢性反复
22、发作的感染有关。,许欣,54,第八节 L-型细菌检查法,营养要求较高，培养基的成分应在脑心浸液或牛肉浸汤的基础上，另需加入1020%血浆(或血清)。 标本先用高渗/等渗肉汤增菌再转种血平板和L型平板。 低倍显微镜下：油煎蛋样菌落；颗粒型菌落，易回复；丝状型菌落，不易从培养基上刮下，制片时也不易分散乳化。 革兰染色为多形性，细胞壁染色(鞣酸，甲紫)可分辨细胞壁缺失情况。,许欣,55,第八节 L-型细菌检查法,一般从样本中分离到的L-型细菌，大多不稳定，可以通过在培养基上转种，回复成普通细菌后进行鉴定。 L-平板上的L型菌落转种于等渗内汤。 较稳定的L型细菌不易回复，可用免疫荧光(测抗原)、PAP系统染色(测抗原) 、SDS-PAGE(蛋白质图谱)、DNA同源性测定。,