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1、专题一 微生物的培养与应用,课题1 微生物的实 验室培养,了解有关培养基的基础知识，进行无菌技术的操作，进行微生物的培养。,一、课题目标：,掌握培养基的制备、高压蒸气灭菌和平板划线法等基本操作技术，熟练、规范地进行无菌操作，成功地培养微生物。,无菌技术的操作。,二、课题重点和难点：,三、技能目标：,一、微生物基础知识,(一)微生物: 1.特点：结构都相当简单,个体多数十分微小.通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构.且体内一般不含有叶绿素.不能进行光合作用.,微生物包括五类：,病毒 细菌 放线菌 真菌 原生动物,原核生物界,原生生物界,真菌界,病毒界,(二)培养基,1.分
2、类(按物理形态分) (1)液体培养基 (2)固体培养基,常用的固体培养基: 琼脂固体培养基. 微生物在固体培养基表面生长,可以形成肉眼可见的菌落.,培养基（培养液）：是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养液。,2.培养基内所含的基本物质(4种),(1)水 (2)碳源 (3)氮源 (4)无机盐,(1)pH值 如:培养霉菌需酸性、培养细菌需中性或微碱性 (2)特殊营养物质- ? 如：培养乳酸杆菌需要在培养基中添加维生素 (3)氧气的含量 如:培养厌氧微生物时需要提供无氧的条件,3.培养基内所需的其他条件,练习,生长因子,小结：不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方 (参考教材附
3、录3内容)。 不管哪种培养基，一般都含有水、碳源、和氮源、 无机盐、等营养物质，另外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质,例如:生长因子(即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧气、二氧化碳、渗透压等的要求。,(三)无菌技术,1、获得纯净培养物的关键: 2、无菌技术包括的四大方面(参看教材15页) 3、消毒与灭菌 (1)消毒： 概念：使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物。不包括芽孢和孢子。 方法: 煮沸消毒法 巴氏消毒法:如牛奶的消毒 化学药剂消毒:酒精、氯气、石碳酸、煤酚皂溶液等 紫外线消毒,防止外来杂菌的入侵,
4、（2）灭菌,概念：使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。 方法：a 灼烧灭菌 b 干热灭菌 c 高压蒸汽灭菌,灼烧灭菌,微生物的接种工具 (接种环、接种针)或其他金属用具直接在火焰的充分燃烧层灼烧,注意适用范围,干热灭菌 160170 ；12h,能耐高温的需要保持干燥的物品( 玻璃器皿),高压蒸汽灭菌 100kPa 121 15-30min,通常用于培养基的灭菌,思考,二、实验操作,（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基 计算称量溶化灭菌倒平板 （二）纯化大肠杆菌 接种方法有： 平板划线法和稀释涂布平板法 （三）将接种后的培养基和一个未接种的培养基放入37恒温箱中培养12h和2
5、4h后，观察并记录,三、课题延伸：菌种的保藏,1、斜面保藏 （临时保存） 2、甘油保藏 （长期保存）,练习,再 见,倒平板,讨论:,(1).培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？ (2).为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？ (3).平板冷凝后，为什么要将平板倒置？ (4).在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,提示：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度 下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。,答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。,答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水
6、珠，凝固后的培养基表面的 湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好 地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生， 因此最好不要用这个平板培养微生物。,1、平板划线法,(1).为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？ (2).在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？ (3).在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,讨论:,答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的 微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了
7、杀死上次划 线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上 的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加， 使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束 后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污 染环境和感染操作者。,答：以免接种环温度太高，杀死菌种。,答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从 上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加 而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,2.稀释涂布法:,(1)系列稀释操作:,涂布平板操作,讨论:涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想
8、，第2步应如何进行无菌操作？,提示：应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯 与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、 吸管要在酒精灯火焰周围；等等。,返回,菌落：,单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。 不同的细菌的菌落特征不同 菌落是鉴定菌种的重要依据。,(2)碳源,可作为碳源的物质有: 含碳无机物: 、 、 含碳有机物：,蛋白质,脂肪酸,返回,不同微生物所利用的碳源不同 异养型微生物的碳源为 自养型微生物的碳源为,碳酸盐,碳酸氢盐,二氧化碳,糖类（主要）,含碳有机物（有机碳）,含碳无机物（无机碳）,(3)氮源
9、,可作为氮源的物质有: 含氮无机物： 、 、 、 含氮有机物：,蛋白胨,牛肉膏,尿素,返回,固氮微生物所利用的氮源是,氮气,氨气,硝酸盐,氨盐,氮气,练习1（多项选择）,1、下列细菌中，能利用含碳无机物作碳源的是 A 光合细菌 B 根瘤菌 C 硝化细菌 D 乳酸菌 2、培养大肠杆菌的培养基中，必需含有的碳源和氮源是 A 糖、有机酸等 B 二氧化碳、碳酸盐 C 蛋白质 D 无机氮化物 3、下列叙述不正确的是 A 培养基是为微生物的生长繁殖提供营养的基质 B 液体培养基和固体培养基所含的最基本物质不相同 C 微生物在固体培养基上生长时，可以形成肉眼可见的单个细菌,A.C,A.C,B.C.,思考:,
10、1)无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？ 2)消毒和灭菌有何不同？ 3)为什么消毒牛奶要用巴氏消毒法? 4)请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。 培养细菌用的培养基与培养皿 玻棒、试管、烧瓶和吸管 实验操作者的双手,无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。,灭菌,灭菌,消毒,营养成分不被破坏,?,思考1,溶化时为什么要将牛肉膏连同称量纸一起加热? 答: 加琼脂的目的是什么? 答:,可保证粘附在称量纸上的牛肉膏也能 溶于水中,减少误差,作为凝固剂,思考2,在灭菌前, 用牛皮纸、旧报纸包紧盛有 培养基的锥形瓶的目的是什么？
11、答: 培养皿能否用高压蒸汽灭菌？ 答:,?,在灭菌时能避免水蒸汽凝结时浸湿棉塞,在 取出培养基锥形瓶时也起到隔绝空气中 杂菌污染的作用,不能,因为培养皿要保持干燥,应该用干热灭菌.,练习2:,1.获得纯净培养物的关键是 A 将用于微生物培养的器皿.接种用具和培养基等器具进行灭菌 B 接种纯种细菌 C 适宜环境条件下培养 D 防止外来杂菌的入侵 2.下列操作与无菌技术无关的是 A 接种前用肥皂洗双手,再用酒精擦拭双手 B 接种前用火焰烧灼接种针 C 培养在50左右时搁置斜面 D 在酒精灯的火焰旁完成 3.外科手术器械和罐头食品的处理,要以能够杀死什么为标准 A 球菌 B 杆菌 C 螺旋菌 D 芽
12、孢,D,C,D,4.某学校打算开辟一块食用菌栽培基地,以丰富学生的劳动技术课内容,首先对食用菌实验室进行清扫和消毒处理,准备食用菌栽培所需的各种原料和用具,然后从菌种站购来各种食用菌菌种.请回答以下问题:,(1)对买回来的菌进行扩大培养,首先制备试管培养基,写出制备固体牛肉膏蛋白胨培养基所需的原料 。其中提供氮源的主要 是 ；提供能源的主要物质是 ；琼脂的作用是 ，它不提供营养。 (2)微生物在生长过程中对各种成分所需量不同,故制备培养基时各成分要有合适的 ,在烧杯加入琼脂后要不停地 ,防止 .,牛肉膏、蛋白胨、水、无机盐、琼脂,牛肉膏,蛋白胨,凝固剂,比例,搅拌,琼脂糊底引起烧杯破裂,(3)
13、将配制好的培养基转移到锥形瓶中,加棉塞后包上牛皮纸并用皮筋勒紧放入 中灭菌,压力为 ,温度为 ,时间 ,灭菌完毕拔掉电源,待锅内压力 ,将试管取出. (4)使用高压蒸汽灭菌锅时注意,先向锅内倒入 ,把锅内水加热煮沸并将基中原有冷空气彻底排除后将锅密闭. (5) 从一支试管向另一支试管接种时注意,接种环要在酒精灯 焰灭菌.并且待接种环 后沾取菌种,试管口不能离开酒精灯火焰附近,将接种的试管放入 冰箱中保藏.,高压灭菌锅,100KPa,121 ,自然降至零后,适量水,外,冷却,4,15-30min,（1）按物理状态来分：培养基可分为固体培养基和液体培养基。其中固体培养基用于菌种分离、鉴定菌落等。
14、（2）按功能来分，可分为选择培养基和鉴别培养基。 （3）按成分来分，可分为天然培养基和合成培养基。,培养基的类型和用途,属于选择培养基有：,加入青霉素的培养基: 分离酵母菌、霉菌等真菌 加入高浓度食盐的培养基: 分离金黄色葡萄球菌 不加氮源的无氮培养基: 分离固氮菌 不加含碳有机物的无碳培养基: 分离自养型微生物,根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。 合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。 优点：标准化生产，组分和含量相对固定;成本低 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。,合成培养基:,天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：来源受限;成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析;易发生支原体污染;,天然培养基：,血清中含有： 多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） 多种金属离子； 激素； 促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。 各种生长因子 转移蛋白 不明成分,人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。,液体培养基：(增菌),表面生长,均匀混浊生长,沉淀生长,固体培养基：（纯化，增菌, 形成菌落，菌苔）,