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1、课题背景,19世纪中期，关系到法国经济命脉的酿造业曾一 度遭受毁灭性的打击。在生产过程中， 出现了葡萄酒变酸、变味的怪事。经过一番研究，法国科学家巴斯德发现导致生产失败的根源在于发酵物中混入了杂菌。 由此人们意识到保持培养物纯净的重要性。 防止杂菌入侵，获得纯净的培养物， 是研究和应用微生物的前提。一方面需要为培养的微生物提供合适的营养和环境条件，另一方面需要确保无处不在的其他微生物无法混入。,课题1 微生物的实验室培养,专题2 :微生物的培养与应用,.微生物的类群,微生物,原核类:,真核类,非细胞类：,细菌、支原体、放线菌、蓝藻,个体微小、结构简单,酵母菌、霉菌、食用菌,真菌：,原生生物：,
2、显微藻类、原生动物（如：草履虫、变形虫等）,病毒、类病毒、朊病毒,微生物的共同特点：,微生物基础知识,一、基础知识：,（一）培养基,人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。,按物理状态分：液体培养基和固体培养基。,2.培养基的类型,在液体培养基加入凝固剂琼脂后，制成固体培养基（最常用的培养基之一）。,1.培养基的概念,固体培养基,液体培养基,2.不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方。（参考课本P83 附录3）,3.不管哪种培养基，一般都含有水、碳源、氮源、 无机盐等营养物质。,讨论1：回忆有关活细胞中元素组成的知识，想一想为什么大多数培养基都含有这几类物质？,微生
3、物需要的五大类营养要素物质是：,.微生物需要的营养物质及功能,1.碳源 2.氮源 3.水4.无机盐 5.生长因子,：凡是能为微生物提供所需碳元素的 营养物质。,无机碳源：CO2 、 NaHCO3等,有机碳源：糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等,构成细胞物质和一些代谢产物 异养微生物的能源,.概念,.来源：,.作用：,1.微生物的碳源,无机氮源：N2、NH4+、NO3-、NH3等。,有机氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨、 氨基酸等,凡是能够为微生物提供N元素的营养物质。,主要用于合成蛋白质、核酸及含N的代谢产物。,2.微生物的氮源,.概念：,.来源：,.作用：,3.生长因子,.常见的生长因子：,.概念：,
4、.作用：,微生物生长必需，而自身不能合成的微量有机物。,酶和核酸的组成成分。,维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等。,注意：,最常用的碳源是糖类，尤其是葡萄糖 最常用的氮源是铵盐、硝酸盐 对异养生物而言，含C、H、O、N的化合物既是碳源，又是氮源，如蛋白质 之所以补充生长因子，是由于缺少合成这些物质的酶或合成能力有限,不管哪种培养基，一般都含有水、碳源、氮源、无机盐等营养物质，另外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质（例如:生长因子）以及氧气等的要求。,二、无菌技术,（1）对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。 （2）将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。 （3）为避免
5、周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。 （4）实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。,获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵,消毒：指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部部分微生物（不包括芽孢和孢子）。,1.消毒与灭菌,灭菌：使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物（包括芽孢和孢子），从而达到完全无菌的过程。,芽孢,有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。（抗逆性极强） 注：不是繁殖体,孢子,原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖或休眠作用的生殖细胞。能直
6、接发育成新个体。,煮沸消毒法：100煮沸5-6min。 巴氏消毒法：70-75下煮30min或 80下煮15min。 化学药剂消毒法：用75%酒精等进行皮肤消毒；氯气消毒水源。 紫外线消毒,.消毒的方法：,2.常用的消毒与灭菌的方法,灼烧灭菌 干热灭菌：160-170 下加热1-2h。 高压蒸气灭菌：100kPa、121 下维持15-30min.,.灭菌的方法：,接种工具,玻璃器皿,培养皿,1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？,2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。 培养细菌用的培养基与培养皿 玻棒、试管、烧瓶和吸管
7、实验操作者的双手,答：无菌技术还能感染实验操作者。,答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。,P1516旁栏思考,二.实验操作(以培养大肠杆菌为例),.制备牛肉膏蛋白胨培养基,1.计算 2.称量 3.溶化 4.灭菌: 将锥形瓶放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121，灭菌1530min。 5.倒平板: 待培养基冷却到50 左右时，在酒精灯附近倒平板。2d后观察平板，无杂菌污染才可用来接种。,倒平板,约50,防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染,灼烧灭菌， 防止瓶口的微生物污染培养基,答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。,
8、2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？,答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。,问题讨论,1.培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？,3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？,4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。,耐高温需保持干
9、燥的 物品，160170 12小时,接种环、接种针等 金属用具,7075、30min 80、15min,100、56min,较为温和理化方法，,杀死部分微生物,（不包括芽孢、孢子）,强烈的理化方法，,杀死所有微生物,（包括芽孢、孢子）,煮沸消毒法,巴氏消毒法,化学药剂,紫外线,灼烧灭菌,干热灭菌,酒精、氯气、石炭酸等,高压蒸汽灭菌,培养基， 100KPa、 121、1530min,复习,1.消毒与灭菌：,2、大肠杆菌的纯化培养：,制备牛肉膏蛋白胨固体培养基,1.计算：,培养基用量,依配方计算各成分的用量,2.称量：,3.溶化：,牛肉膏黏稠，用称量纸称取,牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖,牛肉膏
10、、称量纸 、少量水加热溶解,取纸,蛋白胨、NaCl,琼脂,补水定容,4.调pH、分装、封口：,5.灭菌：,6.倒平板 7.无菌检查： 37培养24-48h,培养基、培养皿,分散成单个细胞,形成单个菌落,纯化大肠杆菌,接种方法有： 平板划线法和稀释涂布平板法,二.大肠杆菌的纯化培养：,纯化大肠杆菌：,平板划线法：,菌种,划3个平板,1个不划线,1.接种：,接种环,防止划破培养基,（重复实验）,（空白对照）,平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操作,将聚集的菌钟逐步稀释分散到培养基的表面. 在数次画线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落.,平板划线法注
11、意事项:,1.接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次. 2.划线首尾不能相接 3.划线后,培养皿倒置培养,几种菌落及其形态,菌种鉴定的重要依据：菌落的大小、形态、颜色,答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,问题讨论P18,1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环
12、？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,答：以免接种环温度太高，杀死菌种。,3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次
13、划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,问题讨论,1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,答：以免接种环温度太高，杀死菌种。,3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,6支试管，分别加入9ml无菌水,10
14、1,102,103,104,105,106,稀释涂布平板法：,a.梯度稀释菌液：,菌液,微量 移液器,稀释涂布平板法：,a.梯度稀释菌液：,b.涂布平板：,不超过0.1ml,各梯度分别涂布3个平板,1个不涂布作空白对照,滴,灼,冷,涂,稀释涂布平板法:是指将菌液进行一系列的梯度稀释,然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。 在稀释度足够的菌液里，聚集在一起的微生物将分散成单个的细胞，从而能在培养基表面形成单个菌落。,答：应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。,问题讨论P19,涂布平板的所
15、有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？,3.菌种的保存,接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4冰箱保存。,2.微生物的恒温培养,.长期保存：,甘油冷冻管藏法,.临时保藏：,三.结果分析与评价,.培养基的制作是否合格 如果未接种的培养基在恒温箱中保温12d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。 .接种操作是否符合无菌要求 如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。
16、.是否进行了及时细致的观察与记录 培养12h与24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。,本课题知识小结:,稀,平板法,培养基的种类,不加凝固剂,加凝固剂，如琼脂,工业生产,观察微生物的运动、分类鉴定,微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种,含化学成分不明确的天然物质,工业生产,培养基成分明确,分类、鉴定,在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长,培养、分离出特定微生物,在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物,鉴别不同种类微生物,选择培养基,液体培养基,半固体培养基,固体培
17、养基,液体培养基：,表面生长,均匀混浊生长,沉淀生长,back,半固体培养基：,(是否运动),无动力,有动力(弥散),固体培养基：菌落,选择培养基,加入青霉素的培养基 加入高浓度食盐的培养基 不加氮源的无氮培养基 不加含碳有机物的无碳培养基,分离酵母菌、霉菌等真菌 （抑制细菌、放线菌的生长）,分离金黄色葡萄球菌,分离固氮菌,分离自养型微生物,,伊红美蓝培养基是鉴别培养基，可以用来检测自来水中的大肠杆菌是否超标，因为的代谢产物与伊红美蓝结合，使菌落呈黑色并带有金属光泽，使大肠杆菌的菌落显示出来，并没有促进大肠杆菌的生长和抑制其他微生物的生长。,鉴别培养基,大肠杆菌呈黑色中心 ,有或无金属光泽,代
18、谢类型,光能无机营养(光能自养型),光能有机营养(光能异养型),化能无机营养(化能自养型),化能有机营养(化能异养型),光,光,无机物,有机物,无机物,有机物,无机物,有机物,二氧化碳,二氧化碳及简单有机物,二氧化碳,有机物,大多数已知细菌和全部真核微生物,硝化细菌 氢细菌,紫色非硫细菌,蓝细菌 绿色硫细菌 藻类,N2,NH3等,有机物中的氮（还有尿素）,无机氮,牛肉膏、蛋白胨,分析氮源：,【典例解析】,例:关于微生物营养物质的叙述中，正确的是( ) A.是碳源的物质不可能同时是氮源 B.凡碳源都提供能量 C.除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量,解析：不同的微生物，所需营养
19、物质有较大差别，要针对微生物的具体情况分析。对于A、B选项，它的表达是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同时是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同时是能源，如葡萄糖；有的碳源同时是氮源，也是能源，如蛋白胨。对于C选项，除水以外的无机物种类繁多，功能也多样。如二氧化碳，可作为自养型微生物的碳源；NaHCO3，可作为自养型微生物的碳源和无机盐；而NaCl则只能提供无机盐。对于D选项，无机氮源提供能量的情况还是存在的，如NH3可为硝化细菌提供能量和氮源。,D,例2：下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是( ) A.防止杂菌污染 B.消灭杂菌 C.培养基和发酵设备都必须灭菌 D.灭菌必须在接种前,解析：灭菌是微生物发酵过程的一个重要环节。A说的是灭菌的目的，因为发酵所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程不能混入其他微生物（杂菌），所以是正确的；B是错误的，因为灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。C是正确的，因为与发酵有关的所有设备和物质都要灭菌；发酵所用的微生物是灭菌后专门接种的，灭菌必须在接种前，如果接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。,B,自养型微生物与异养型微生物的培养基的主要差别是( ) A碳源 B氮源 C无机盐 D特殊营养物质,A,涂布器,接种环,接种针,