实验17-重组体筛选与鉴定.ppt

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1、重组体筛选与鉴定,转化（transformation)： 是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。,重组质粒的转化,转化方法,1、化学的方法(热击法)；使用化学试剂（如CaCl）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA分子导入受体细胞； 2、电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。,重组质粒的转化（热激法）,1、冰上融化感受态细胞； 2、将10ul连接产物加入到100ul感受态细胞，冰浴40min； 3、42热激90s，勿摇动！ 4、热激后立马放置冰上1-2min； 5

2、、加400ulLB液体培养基，置摇床，37，70-100rpm 1h； 6、涂平板。,大肠杆菌感受态细胞的制备、 重组质粒的转化及克隆的筛选与鉴定,感受态细胞(competent cells): 受体细胞经过一些特殊的方法（如Cacl2、Rucl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell)。,原理,目前，感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2处理细菌的方法制 备，即用低渗CaCl2溶液在低温（0）时处理快速生长的细菌， 从而获得感受态细菌。此时细菌膨胀成球形，外源DNA分子在此 条件下易形成抗DNA酶的羟基钙

3、磷酸复合物粘附在细菌表面， 通过热激作用促进细胞对DNA的吸收。 在一定条件下，经过连接后的片段与感受态细胞混合保 温，可以进入感受态细胞。进入感受态细胞的分子通过复 制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性 状。将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，即可筛选出转 化体，即带有异源分子的受体细胞。,试剂： 1.LB固体和液体培养基。 2.含特定抗生素的LB固体培养基。 3.100mM CaCl2溶液。 4.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。 5. 待转化

4、质粒。,实验步骤,1.挑取一DH5单菌落于5ml LB培养液中37过夜培养,2.取其中500ul菌液于一含50mlLB培养液的锥形瓶中，37振摇培养至OD600值达到0.5-0.6之间,3. 取50ml菌液置于离心管内，4 4500g离心5分钟,4. 加入30ml ,100mM的冰冷CaCl2溶液，摇荡重悬细胞，冰浴30分钟,5. 4 4500g离心5分钟收集细胞后，加2 ml ,100mM的冰冷CaCl2溶液轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。,6.感受态细胞分装成200l的小份,暂且不用的贮存于-70可保存半年。 取其中一份进行转化。,7. 向转化管中加入DNA（不超过10u

5、l）,轻度摇晃混合后于冰上放置30分钟。,8. 将上述混合物转移到预热到42的水浴锅中，热休克90秒 (不要摇动试管)，然后将试管迅速转移到冰浴，冷却12分钟。,9. 向管内加入800ul的LB培养液。然后37 培养45分钟。,10. 取适量体积的转化细胞转移到含有适当抗生素的LB固体平板上，用灭过菌的玻璃棒涂布均匀。室温放置几分钟,11. 倒置平板于37 培养1216个小时。,四、实验注意事项,为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素： 1. 细胞生长状态和密度: 细胞生长密度以刚进入对数生长期时 为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。 2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒

6、DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5。 3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。 4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行。,克隆的筛选与鉴定,不同抗生素基因筛选 常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等；将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，才能较容易地筛选出转化体，即带有异源DNA分子的受体细胞。否则，如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养基平板上，会出现成千上万的细菌菌落，将难以确认哪一

7、个克隆含有转化的质粒。虽然只有那些含有被转化质粒的细菌才能在含有抗生素的平板上生长和繁殖，但对于连接混合物而言，此时并不能确定哪个克隆含有插入片段。,一、抗药性标记及其插入失活选择法,pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。,一 载体表型选择法,1. 原理：,（1）四环素：,（2）氨苄青霉素抗性基因：,产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。,抑制细菌生长，但不杀死细菌。,杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。,（

8、3）环丝氨酸：,3. 选择过程：,如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。,Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。,（1）四环素抗性插入失活,无环丝氨酸培养基,（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程,如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。,利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。（只在特定条件下）。,转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。,一、原理：,二 根据插入基因的表型选择,1.弥补

9、缺陷,his-,his+,受体菌：,外源基因：,在不含组氨酸的培养基中生长,小鼠的二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二氨嘧啶有抗性。,DHFR,载体,连接,转化受体菌,三甲氧苄二氨嘧啶培养基平板,含DHFR的克隆才能生长,例：,使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。,2. 增加新性状,利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。,一、直接电泳检测法,从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。,三 DNA电泳检测法,分子量 Marker,载体,重组克隆,二、酶切电泳筛选法,1. 原理：,根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（D

10、NA带数和长度）。,或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的结果。,A,B,A或B,筛选过程,三、PCR扩增检测法,1. 原理,PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。,2. 过程,（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。,（2）用外源DNA插入片断引物作PCR。,（3）电泳PCR产物。,（4）检查是否有PCR产物。,（5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。,1. 核酸杂交,四 核酸杂交检测法,一、原理：,重组克隆与探针杂交。,3. 识别标记,32P 或 125I 。,（1）放射性同位素,2. 检测用的探针,与外源DNA插入片断互补的序列。,（2）非

11、放射性标记,荧光素,二、核酸杂交检测方法,用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。,1. Southern blotting,从宿主细胞中提取DNA（或质粒载体），再用探针杂交。,只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交，在底片上曝光显示。,酶切前,酶切后,插入片断,载体,Southern blot 筛选结果,（1）原位杂交筛选,特点：,对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。,（2）R-环检测法,DNA-RNA杂交。,1）原理：,2）选择过程,在70%甲酰胺中，把DNA双链变性，复性的时候，DNA-RNA杂交分子比DNA-DNA双链更稳定。电镜下可见一种R-环形结构。,用外源基因的

12、mRNA与重组载体杂交。,缺点：需要电镜！,2. Northern blotting,用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。,主要检测插入片断是否被转录。,从宿主细胞中提取RNA，再用探针杂交。,利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。,根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式：,一、放射性抗体检测法,五 免疫化学检测法,1. 抗体与产物的结合方式,对表达产物的检测。蛋白蛋白“杂交”,待测基因 产物蛋白,一抗,二抗,125I 标记的二 抗结合蛋白,固相支持滤膜,待测基因 产物蛋白,一抗,125I标记的二抗,固相支持滤膜,待测基因 产物蛋白,

13、一抗,固相支持滤膜,固相支持滤膜,待测基因 产物蛋白,一抗,二抗,125I 标记的二抗 结合蛋白,125I标记的二抗,2. 放射性抗体检测法过程,3. Broome-Gilbert双位点检测法,质粒基因A,插入基因B,表达,质粒蛋白A,外源蛋白B,融合蛋白,检测融合蛋白。,既检测外源基因产物又检测载体基因产物。,固相支 持滤膜,抗A抗体,125I标记的 抗B抗体,质粒蛋白A,外源蛋白B,质粒蛋白A,外源蛋白B,固相支 持滤膜,抗A抗体,发光，底片曝光,二、免疫沉淀检测法,把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈”。,1. 原理,抗原

14、抗体凝集反应。,检测分泌型产物。,2. 方法,对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。,三、酶联免疫吸附测定（ELISA）,Enzyme-linked immunosorbant assay,1. 原理：,一抗（primary antibody）: 与目标分子的特异结合。 二抗（secondary antibody）： 与一抗的特异性结合。 酶连（enzyme-linke）： 二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。,四、免疫印迹（western blotting

15、）法,1.原理：,在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测胶上的蛋白质泳带。,（1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷。, SDS:,（SDS-PAGE）：, 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：,（Polyacrylamide gel electrophoresis）,在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中向正极移动，移动的速率主要取决于其分子量大小（链的长短），从而把不同分子量的肽链分开。,电泳buffer,电泳buffer,点样,电泳方向,蛋白质电泳的分子量标准,已知分子量的蛋白质混合液，与待测样品一起

16、电泳，为样品蛋白质提供分子量估计。,商品化供应,Da,道尔顿(质量单位, 等于一氧原子质量的十六分之一。 一克约为61023道尔顿,Dalton,SDS PAGE,凝胶中的蛋白质染色：,考马斯亮蓝： 灵敏度底、只能检出0.3-1g/带，但可褪色回收。,硝酸银： 灵敏度高、可检出2-5ng/带。,2）转到膜上进行染色。,1）直接染色,直接染色电泳结果,（2）Western blotting,电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、中性尼龙膜等）。, Western（转膜）,胶里的蛋白质带在电场的作用下横向转移到正极一侧的膜上。,膜,胶,蛋白,Western装置,

17、Blotting,原理与ELISA相同。,待测蛋白,硝酸纤 维素膜,一抗,二抗,辣根过氧 化物酶,底物,产物， 并发出光,PAGE胶,待测蛋白,底片曝光,辣根过氧化物酶：HRPO,1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与 膜上的蛋白结合。,2）洗去未结合的一抗。,3）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。,4）清洗掉未结合的二抗。,5）用HRPO的底物浸泡膜。,6）暗室里曝光，冲洗胶片。, Blotting过程,Immuno Blotting,结果,多克隆抗体Blotting的结果,单抗blotting结果,一、无细胞翻译系统,第六节 转译筛选法,能把外源的mRNA翻译成蛋白质的细胞提取物。

18、如：麦胚提取物系统、网织红细胞提取物系统。,借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选择的克隆载体上的外源基因的转录，来筛选其产物是否符合预期。,适用于mRNA转录丰度高的外源基因。,二、转译筛选,mRNA,无细胞翻译系统,35S标记的 甲硫氨酸,翻译,35S标记的肽链,PAGE电泳,放射自显影,比较放射性 带纹的位置,载体+外源DNA,转录,与预期的产物分子量相符？,三、杂交抑制转译法,mRNA一旦与DNA杂交成RNA-DNA双链后就不能被核糖体翻译出蛋白质（转译被抑制）。,1. 原理,2. 过程,专门设计检测能同DNA特异结合的蛋白质因子。,待测蛋白质,硝 酸 纤 维 素 滤 膜,能与蛋白质结

19、 合的DNA序列,放射性标记,待测蛋白质,硝 酸 纤 维 素 滤 膜,能与蛋白质结 合的DNA序列,放射性标记,五、DNA-蛋白质相互作用筛选法,一般克隆与筛选策略,二、植物转化体报道基因筛选法,（1）大肠杆菌的-D-葡萄糖醛酸糖苷酶 （-D-glucuronidase，GUS）； （2）细菌和萤火虫的荧光素酶 （luciferase）； （3）水母绿色荧光蛋白（GFP）基因 （Green Fluorescent Protein）。,1. 报道基因（reporter gene),（4）其它,2. 几种报道基因的作用原理,4-甲-D-葡糖醛酸,荧光产物,GUS,GFP,紫外光照,发绿色荧光,5-

20、溴-4-氯-3-吲哚-D-葡糖醛酸,蓝色水解产物,GUS,Fireflies emit light catalyzed by luciferase with ATP,转入萤火虫的luciferase的烟草,半乳糖苷酶系统筛选（蓝/白斑筛选）,-互补现象： 因为许多载体都带有一个半乳糖苷酶（LacZ）基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型-半乳糖苷酶实现基因内互补（ -互补）。当这种载体转入可编码半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基-D硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形

21、成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为-互补现象。,由互补产生的半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5溴4氯3吲哚D半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会造成LacZ()基因的失活，破坏-互补作用，就不能产生具有活性的酶。所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。,-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。,其他鉴定方法,鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有-互补、小规模制备质粒DNA进行酶切分析、插入失活、PCR以及杂交筛选的方法。最常用的方法是小规模制备质粒DNA进行酶切分析，对于带有LacZ基因的载体还可以结合-互补现象来筛选。,The end!,