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1、植物总DNA的提取 及检测,制作人：葛杰,一 、实验目的,学习提取和纯化高等植物总DNA的方法，并进行纯度鉴定，理解其原理。,脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA) ，与蛋白质结合在一起以核蛋白（DNP）的形式存在。在制备核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋白释放出来。 植物总DNA包括细胞核DNA和细胞核外DNA,前者存在于细胞核内，后者存在于细胞质中有半自主性复制活性的细胞器内，例如线粒体DNA(mtDNA)和叶绿体DNA(ctDNA)。,二、实验原理,细胞破碎 抽提去蛋白质 沉淀核酸,基本过程,机械方法： 超声波处理法、研磨法、匀浆法； 化学试剂法：用SDS处理细胞； 酶解法： 加入
2、溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。,细胞破碎,CTAB法（十六烷基三甲基溴化铵）：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液（0.7mol/L NaCl）中是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3mol/L NaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇中。,DNA提取,蛋白质 常用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）或氯仿：异戊醇（24：1）抽提。 RNA 常选用RNase消化 ，或是用LiCl来消除大分子的RNA。 酚类物质 提取液中加
3、少量巯基乙醇，选取幼嫩的材料。,DNA纯化（去杂质）,实验材料 植物叶片(去叶脉) 试剂 2CTAB抽提液（CTAB、Tris-HCL、EDTA、Nacl） TE 缓冲液(pH=8.0) 氯仿：异戊醇(24:1) 异丙醇 70%乙醇,三、材料与试剂,离心机 水浴锅 研钵 微量移液器,仪器用具,1取 0.1g 新鲜的植物幼嫩叶片于研钵中，加 入液氮，迅速研磨。 2、加液氮磨成粉末后迅速转入1.5ml离心管中。 3、加入700ul 2%的CTAB提取液，充分混匀CTAB提取液，置于65水浴中保温 10min，其间颠倒混匀23次。破碎细胞 4、冷至室温后加入等体积氯仿：异戊醇（24:1）混合液，充分
4、颠倒混匀，防止成团。8000r/min，离心 10min，取上清。抽提去蛋白 5、将上清液移入新的1.5mL离心管内，加 等体积异丙醇（预冷-20）。颠倒混匀，可见 DNA 絮状沉淀。除酚类、多糖,四、操作步骤,6、低温放置15分钟，8000r/min，离心 10min，倒掉上清液，1ml 70%乙醇洗涤沉淀，7000rpm，5min，弃上清。沉淀核酸 7、将离心管倒置，沉淀于室温自然干燥。 8、将沉淀加30l 的TE溶解，获得DNA溶液，待测。,1)选取新鲜材料，研磨迅速彻底，研磨好的材料应与 CTAB 抽提液充分混匀； 2)若提取产物有颜色，可能是材料中含有较多的多酚类物质，尽可能选取幼嫩
5、的材料； 3）收集 CTAB 与核酸形成的复合物时不要离心过度，否则沉淀再溶解难； 4）为了获得具有生物活性的天然核酸，在分离制备过程中必须采用温和的条件，避免过酸过碱、剧烈地搅拌，防止热变性，同时还要避免核酸降解酶类的降解。,五、注意事项,DNA 纯度的鉴定紫外分光光度计法检测DNA,一、原理 由于核酸中的碱基都具有共轭双键，所以具有紫外光吸收性质。核酸在紫外光谱区有一条典型的吸收曲线，其吸收高峰在260nm处，蛋白质在紫外区的吸收高峰在280nm处，所以核酸的紫外吸收光谱数据是鉴定核酸的重要依据之一。但紫外法不能区分DNA和RNA，只能用来鉴定核酸的纯度和含量。 纯净的核酸溶液A260/A
6、230的消光值比大于或等于2.0；A260/A280大于或等于1.80。A260/A280值过小，说明蛋白未脱净；A260/A230过小，说明有杂质（一般为多酚类或色素）。,二、实验原理,一、原理 由于核酸中的碱基都具有共轭双键，所以具有紫外光吸收性质。核酸在紫外光谱区有一条典型的吸收曲线，其吸收高峰在260nm处，蛋白质在紫外区的吸收高峰在280nm处，所以核酸的紫外吸收光谱数据是鉴定核酸的重要依据之一。但紫外法不能区分DNA和RNA，只能用来鉴定核酸的纯度和含量。 纯净的核酸溶液A260/A230的消光值比大于或等于2.0；A260/A280大于或等于1.80。A260/A280值过小，说明蛋白未脱净；A260/A230过小，说明有杂质（一般为多酚类或色素）。,三、材料与试剂,1、材料 植物DNA 2、器材：紫外分光光度计、移液管、试管 3、试剂：TE溶液（pH8.0）（见前述）,四、操作步骤,1、将纯化的DNA溶液用TE（pH8.0）稀释至每毫升含5-50g DNA浓度范围，用TE（pH8.0）作空白对照。 2、于紫外分光光度计上测定260nm、280nm吸收值，计算A260/A280的比值，并换算出核酸的含量。,五、实验结果与分析,作业：为了获得高质量的植物总DNA，在分离提取过程中应注意那些问题？,