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1、实验三,细菌的简单染色和革兰氏染色,一、实验目的及要求,学习微生物涂片、染色的基本技术， 掌握细菌的简单染色法。 学习并掌握革兰氏染色法，了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 巩固油镜的使用和无菌操作技术。,二、实验原理,简单染色法是利用单一染料使细菌着色以显示其形态的染色方法。常用于染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。 碱性染料电离时，其分子染色部分带正电荷，能和带负电荷的物质结合。由于细菌生长于中性环境中一般带负电荷，所以通常采用碱性染料使其着色。 当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染
2、料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。,革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram创立的。作为细菌学上最常用最重要的鉴别染色法，革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G）两大类。 G菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。 G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。,三、实验器材,1.菌种：
3、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）， 大肠杆菌（Escherichia coli）， 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） 2. 染色剂：草酸铵结晶紫染液或齐氏石炭酸复红染 液，革兰氏染色液。 3. 其他：显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，双层瓶 （内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，废液缸等。,四、实验步骤,1、简单染色： （1）涂片：注意取菌不要太多； （2）干燥：室温自然干燥； （3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上， 通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）； （4）染色：涂片加草酸铵结晶紫染液或齐氏石炭酸复 红染液 1min； （5）水洗：自来水冲洗，直至流
4、下的无色； （6）干燥：自然晾干或用电吹风吹干； （7）镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的 视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏 油，油镜观察细菌的形态。,2、革兰氏染色 （1）制片：制片方法与简单染色相同； （2）初染：加适量（以刚好覆盖菌膜为 宜）的结晶紫染色液染色1-2min，水洗； （3）媒染：碘液媒染1min，水洗； （4）脱色：连续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液无色， 立即水洗； （5）复染：滴加番红复染约2min，水洗； （6）镜检：干燥后，油镜镜检观察。 （7）混合涂片法：按上述方法，在同一载玻片上，以大肠 杆菌和枯草芽孢杆菌或大肠杆菌和金黄色葡 萄球菌作混合涂
5、片、染色、镜检进行比较。,Gram Stain,G+,干燥、固定,结晶紫染色,G-,碘液媒染,乙醇脱色,蕃红复染,Figure Mixed culture of large Gram positive rod and small Gram negative rods.,五、注意事项,革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。 染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。 选用幼龄的细菌。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。,六、实验报告,1、结果 给出枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌形态图，并注明其革兰氏染色反应。 2、思考题 （1）简单染色法中各步骤的注意事项是什么？,谢谢！,