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1、实验九 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点,一、目的要求,1.学习和掌握圆盘电泳技术 2.学习和掌握等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点方法,二、原理 聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(Isoelectric Focusing-PAGE，简称IEF-PAGE)：利用各种蛋白质pI不同，以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体(carrier ampholytes)，两性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度。在电场作用下，蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带。,两性电解质载体(carrie
2、r ampholytes) (1)易溶于水，在pI处应有足够的缓冲能力，形成稳定的pH梯度，不致被蛋白质或其它两性电解质改变pH梯度。 (2)在pI处应有良好的电导及相同的电导系数，以保持均匀的电场。 (3)分子量小，可通过透析或分子筛法除去，便于与生物大分子分开。 (4)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，也无变性作用，其化学组成不同于蛋白质。,IEF-PAGE分离蛋白质并测定pI,图3.6聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图 (A为正面,B为剖面) (1)样品胶pH6.7 (2)浓缩胶pH6.7 (3)分离胶pH8.9 (4)电极缓冲液pH8.3,三、试剂与器材,试剂：两性电解质载体pH 3-1
3、0 、10%四甲基乙二胺 、10%过硫酸铵 、5%H3PO4 、2%NaOH 、40%蔗糖 、0.04考马斯亮兰R250 、7%醋酸 器材：圆盘电泳槽 、稳压稳流电泳仪 、脱色摇床,四、操作方法 1. 凝胶柱的制备 （1）玻璃管的一端插在橡皮帽中(与橡皮接触的部分凝胶不易聚合，可在橡皮帽中先加一滴40%的蔗糖) （2）配胶 表 10mL 7.5%凝胶的配制 试 剂 名 称 体积(mL) 凝胶贮液 2.5 两性电解质载体 0.5 10%TEMED 0.1 蛋白质混合样品 0.1 蒸馏水 6.75 混匀后置真空干燥器中抽气10 min 10%过硫酸铵 0.05,（3）将配好的凝胶溶液用细长头滴管加
4、到预先准备好的玻管中，至离上端1 cm处，再用注射器缓缓加水3-5 mm高。 （4）待凝胶聚合 2. 电泳 小心地拔出玻管，并用蒸馏水洗去蔗糖溶液，把管固定到电泳槽上槽的洞中（安装时要保证凝胶管垂直且橡胶塞孔密封不漏）在上槽中加入5%磷酸缓冲液，在下槽中装入2%氢氧化钠溶液。避免管下有气泡。上槽接电泳仪的正极，下槽接负极，打开电源，先调电压至100 V，待电压稳定后再升到300 V，电泳2 h以上至电流降为0，将电压调至0，关闭电源。,3剥胶 电泳结束后，取下凝胶管，用蒸馏水充分洗净两端电极液，在凝胶条的正极端插一铜丝为标记。用灌满水的注射器长针头插入凝胶与玻管管壁之间，边压水边慢慢转动玻管，
5、推针前进，同时注入水，靠水流压力和润滑力将玻璃管内壁与凝胶分开，凝胶条即可流出。 4 .固定染色 取其中一条凝胶条放在一块洁净的玻板上，用尺量出固定前的凝胶条长度。放入染色液中同时进行固定染色1-2 h，用蒸馏水漂洗数次后用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，量出蛋白带距正极端的距离。,5. pH梯度的制作 取另一条凝胶条放在玻板上，从凝胶的正极端开始，每隔0.5 cm切下一段，依次放入已编好号并装有1 mL蒸馏水的试管中，浸泡过夜。次日用酸度计分别测定每管浸提液的pH值。以凝胶长度为横坐标，pH值为纵坐标，绘制标准pH梯度曲线。 6 .蛋白质样品等电点的计算 求出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实
6、际长度为： 固定后的蛋白区带中心距凝胶条正极端的距离 固定染色前凝胶条长度 固定染色后凝胶条长度 计算出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度后，直接从pH梯度曲线上求出该蛋白质等电点。,五、注意事项 盐离子可干扰pH梯度形成并使区带扭曲。为防止上述影响，进行IEF-PAGE时，样品应透析或用SephadexG-25脱盐，也可将样品溶解在水或低盐缓冲液中使其充分溶解，以免不溶小颗粒引起拖尾。 加样量则取决于样品中蛋白质的种类、数目以及检测方法的灵敏度。如用考马斯亮蓝R-250染色，加样量可为50-150 g；如用银染色，加样量可减少到1 g。一般样品浓度以0.5-3 mg/mL为宜，最适当加样体积为10-30 l。,六、思考题 (1)简述聚丙烯酰胺等电聚焦电泳的基本原理。 (2)进行聚丙烯酰胺等电聚焦电泳时的注意事项有哪些？,