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1、实验八 PCR产品纯化及定向克隆,一、实验目的 学习并掌握基因工程操作技术中最常用的DNA纯化和连接方法；巩固DNA酶切的操作。,二、实验原理 PCR产物一般都含有过量的引物、Taq酶及dNTP等成分，直接影响后续的基因操作，利用苯酚/氯仿、氯仿依次抽提反应体系中的酶，然后在酸性条件下用乙醇沉淀DNA。 根据实验六所用的PCR引物，其产品的5和3末端分别具有EcoR I和Not I酶切位点，而载体pET32的多克隆位点中也有此两个酶切位点。因此，若将PCR产物与载体分别用EcoR I和Not I进行双酶切，所得的产物相应末端正好互补，可用T4 DNA连接酶在体外进行连接。,正向引物（P1） E
2、coRI 5-CGCGAATTCATGGCAGATCAGCTCACCGATGATC-3 反向引物（P2）： Not I 5-AGAGCGGCCGCCTTTGCCATCATAACTTTGACAAA-3,三、实验材料与主要试剂 1、实验材料 实验二提取的质粒载体pET32 实验七的PCR产品以及实验八的RT-PCR产品 2、主要试剂 限制性核酸内切酶：EcoR I和Not I T4 DNA连接酶 苯酚/氯仿/异戊醇、氯仿、醋酸钠（pH5.2）、 无水乙醇、70%乙醇等,四、实验步骤 1、PCR产品的纯化 每组同学的PCR和RT-PCR产品合并，约130l，转入1.5ml离心管中，向PCR产品中加入
3、150l苯酚/氯仿/异戊醇，旋涡混合，14000 rpm离心5 min； 将上层水相转移至新离心管，加入150l氯仿，旋涡混合，14000 rpm离心5 min； 再将上层水相转移至新离心管，加10l醋酸钠和250l无水乙醇，混匀后，离心管插入冰中放置 30 min； 在4下14000 rpm离心10 min，去除上清，观察DNA沉淀。 加20l灭菌水溶解DNA，备用。,四、实验步骤 2、PCR产品与载体pET32的双酶切 分别在两个1.5mL离心管中准备双酶切反应混合液。 A. 10 H buffer 5l B. 10 H buffer 5l 0.1% BSA 5l 0.1% BSA 5l
4、EcoR 2l EcoR 2l Not 2l Not 2l PCR产品 20l pET32载体 约2g 灭菌蒸馏水 16l 加灭菌蒸馏水至总体积50l,将上述两个离心管内的混合物轻轻混匀，37水浴酶切3小时。,四、实验步骤 3、酶切产品的纯化 酶切后的PCR产品和载体合并 (约100l )，加入100l苯酚/氯仿/异戊醇，旋涡混合，14000 rpm离心5 min； 将上层水相转移至新离心管，加入100l氯仿，旋涡混合，14000 rpm离心5 min； 再将上层水相转移至新离心管，加10l醋酸钠和250l无水乙醇，混匀后，离心管插入冰中放置 30 min； 在4下14000 rpm离心10 min，去除上清； 加入500l 70%乙醇洗涤DNA沉淀，在4下14000 rpm离心5min，去除上清，空气干燥； 加8l灭菌水溶解DNA，备用。,四、实验步骤 4、目的基因(CaM5)与载体(pET32)的连接 在灭菌的PCR管中依次加入： 10 T4 DNA Ligase buffer 1l T4 DNA Ligase 1l PCR产品和pET32 8l,将混合物轻轻混匀，16连接过夜。 第二天，从PCR仪中取出连接产物，置于-80保存到下次实验使用。,五、实验结果 本实验结果必须通过观察转化后所得菌落的多少来判断连接的效率。,