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1、生化检验指标在慢性肾病早期诊断中的应用,2,关于慢性肾病,慢性肾脏病是世界范围内的公共健康问题。在各国肾衰竭的发生率逐渐增加，而且预后差，花费高。同时早期慢性肾脏病的发生率越来越高。,概述：,3,慢性肾病的发病率（年龄20岁）：,4,肾脏的生理功能：,肾单位是肾的基本功能单位，每个肾单位包括肾小体和肾小管部分。正常情况下 ,肾小球基底膜表面覆盖一些带有负电荷的蛋白 ,如硫酸粘多糖、硫酸乙酰肝素、唾液酸等。它们与基底膜上的 IV型胶原纤维蛋白形成网状多聚基质 ,成为天然的负电荷屏障 ,与这些毛细血管壁上极小的孔筛一起 ,共同阻挠血浆中大分子蛋白质的滤出。,肾脏损伤,5,滤过膜示意图,6,7,人两
2、肾每天生成的肾小球滤过液达180L，而终尿仅为1.5L。这表明滤过液中约99%的水被肾小管和集合管重吸收，只有约1%被排出体外。不仅如此，滤过液中的葡萄糖已全部被肾小管重吸收回血；钠、尿素告示不同程度地重吸收；肌酐、尿酸和K+等还被肾小管分泌入管腔中。肾小管和集合管的转运包括重吸收和分泌。重吸收是指物质从肾小管液中转运至血液中，而分泌是指上皮细胞本身产生的物质或血液中的物质转运至肾小管腔内。,肾脏的生理功能：,8,肾脏损伤,肾损伤是指肾脏结构或功能异常，最初无GFR下降，一定时间后发生GFR下降。肾损伤的指标包括血或尿的成分异常或影像检查异常。,9,肾脏损伤,各种炎症、代谢异常和免疫损伤均可导
3、致滤过膜上负电荷减少，静电排斥力下降，造成.多种小分子蛋白从尿中漏出增多 。,如糖尿病患者由于长期高血糖使肾小球外基质合成增加，基底膜增厚，肾小球系膜扩张，同时内皮细胞释放缩血管物质内皮素以及一氧化碳使肾小球毛细血管张力变化，引起肾血流动力学改变，肾小球处于高滤过状态。此外，DM患者肾小球滤膜上带负电荷的硫酸乙酸肝素、唾液酸合成减少，致使肾小球滤过膜电荷选择性屏障受损 。,10,高血压患者由于Na/Li反转移活性增强，可引起肾脏自身调节功能紊乱，造成肾小球高灌注状态，导致滤过增强，同时由于肾缺血而导致肾小管病变 。,免疫损伤及炎症反应致肾小球毛细血管内皮细胞及系膜细胞的肿胀、增生，毛细血管腔变
4、窄，甚至闭锁，肾血流量减少，肾组织缺血，肾近曲小管缺血缺氧而受累。,肾脏损伤,11,慢性肾病的定义：,肾脏损伤（肾脏结构或功能异常）3个月，可以有或无GFR下降，可表现为下面任何一条： 病理学检查异常 肾损伤的指标：包括血、尿成分异常或影像学检查异常 GFR60ml/min/1.73m23个月，有或无肾脏损伤证据。,标准：,12,分期：,13,慢性肾病的诊治流程：,CKD 死亡,慢性肾病的早期诊断主要就是指前面两个阶段（在上图中为无色底框）而言。,14,慢性肾病早期诊断的意义,目前，全球有100万以上中末期肾病患者，而且肾病患者的数量还在以每年10的速度增长。中国的肾病患者约占全球肾病患者的1
5、10。 而且随着高血压、糖尿病等疾病的发病率逐年上升，所导致的肾病患者也日益增多。早期慢性肾病往往没有症状和体征，给早期诊断带来困难，很多慢性肾病患者就诊时已经到达终末期肾病，失去了治疗机会。因此，对慢性肾病的防治应遵循以下原则：,15,在常规体检中，所有的人都应该接受评估（临床因素和社会地理因素评估），确定是否有发展成为慢性肾脏病的危险。 可能发生慢性肾病的高危人群应该接受肾损伤指标的检查和肾功能的评估。 对有高危因素而未发现慢性肾脏病的人，应进行减少高危因素的治疗，并定期复查。,在这些检查和评估中，早期肾损伤的指标起着重要的作用。,16,慢性肾病的易感因素和始动因素：,高血压,糖尿病,药物
6、损伤,肺心病,自身免疫病,系统性感染,家族氏,泌尿系感染,泌尿系结石,其它,17,慢性肾脏病的一些不良后果，如肾衰竭、心血管疾病、过早死亡等，可以被 避免或延缓。可通过实验室检查发现慢性肾脏病的早期阶段，在慢性肾脏病的早期给予治疗，可有效延缓肾脏病向肾衰竭的进展速度。在慢性肾脏病早期对心血管疾病的危险因素进行治疗，可减少心血管事件的发生。,慢性肾病早期诊断的意义,18,常用检测手段的局限性,传统的肾病实验室检测多以尿蛋白 ,血尿素 ,肌酐以及肌酐清除率等作为主要指标。然而这些项目难以发现早期肾脏损伤 ,无法满足临床早期诊断的需要。 肾组织学检查虽然比较灵敏 ,但必须做侵害性的肾活检 ,难以普遍
7、推广。,19,新的检测手段的应用：,随着临床检验技术的发展，不断有新的指标被应用到慢性肾病的前期诊断中，如肾小球滤过率（GFR）新的实验方法、多种尿蛋白检测和尿酶测定的应用，都为慢性肾病的合理分期和前期诊断提供了更实用的实验室指标。 下面我们将对这些指标进行简介和分析。,20,目前生化常用的肾早期损伤诊断指标,尿微量蛋白系列：MALB、TRF、2-MG、2-MG、RBP、Ig等。,尿酶系列：NAG、GAL、GGT等。,GFR：CYC S等。,其它指标：乳酸等。,21,GFR：,C=UV/P,C清除率（ml/min） V每分钟尿量（ml/min） U尿中测定物质的浓度（mmol/L） P血中测定
8、物质的浓度（mmol/L）,22,23,24,单独使用血肌酐不能作为评价GFR的准确指标。因为其受GFR以外的多种因素影响，例如年龄、性别、种族、体重、饮食、某些药物、实验室检测技术的影响，尤其在截肢、肌肉营养不良、急性肾衰等情况下，血Cr变的更不可靠。,在日常工作中，我们常用内生肌酐清除率（CCr）评价GFR，但下面的因素限制了它的使用： 肾小管可以分泌肌酐，导致测定的CCr比实际的GFR偏高。随着肾功能 的下降，这种现象变得越来越明显。 测定需要留取24小时尿液，病人对留尿方法的理解错误或操作错误都会会导致不准确。 留尿不方便。,25,K/DOQI发现用包括年龄、性别、SCr和种族等参数在
9、内的MDRD方程计算获得的GFR甚至比CCr更接近真实的GFR，在国际互联网上（WWW.kdoqi.org）只要输入以上参数，即可获GFR的估计值。以下为简化的MDRD方程：,GFR186（SCr）-1.154（年龄）-0.203（0.742女性）（1.210非洲美籍人）,但我国人群和西方人群体格明显不同，方程中的某些系数可能需要根据我国的情况进行修改，甚至需要完全不同的方程。,26,半胱氨酸蛋白酶抑制剂C (Cystatin C, Cys C),Cys C是一个由122个氨基酸组成的小分子量、碱性非糖基化蛋白质，相对分子量为13000，等电点（PI）9.3，具有半胱氨酸蛋白酶抑制物的性质。由
10、于Cys C是一种分泌性蛋白质，故广泛地存在于各种体液中，如脑脊液、血液、唾液、精浆等。Cys C在体液的生理PH值中携带正电荷，可经肾小球自由滤过；不被肾小管上皮细胞分泌，虽然在近曲小管被重吸收但被完全分解代谢，不会再重返血流中；肾脏是清除循环中Cys C的唯一器官；由于Cys C基因属“看家基因”，能在几乎所有的有核细胞表达，无组织学特异性，故机体Cys C的产生速率相当恒定。因此它是一个比较接近理想的内源性标志物，与参考方法的相关性最佳。,27,国外学者研究认为当体重指数(BMI)不正常时或GFR中度受损时，测定CysC评估GFR比酶法SCr测定好得多；但如以结合年龄、体重等因素的公式评
11、估，则两者十分相似（注意此公式在国内应用的局限性）。总结这些研究结果，CysC作为肾功能指标的特点有： CysC与GFR的相关性明显好于SCr； 无论是轻度,中度还是重度肾功能降低时，对应的CysC的灵敏度都比SCr高，但特异性与SCr相当或稍差； ROC分析显示血清CysC对GFR减低的诊断准确性远比SCr好得多 CysC对GFR微小的变化也比SCr更敏感，对GFR的轻度降低比较敏感。,半胱氨酸蛋白酶抑制剂C (Cystatin C, Cys C),28,血清Cys C在诊断的敏感性、特异性和准确性与血浆肌酐的比较,29,尿微量蛋白系列：,30,尿微量蛋白是指常规定性或定量难以检出的一些尿蛋
12、白，其理化性质、合成部位、生理功能都各不相同。正常情况下，尿中这些蛋白质总含量仅为微克至毫微克水平。肾小球滤过膜通透性增加和滤膜的静电屏障受损，使肾小球滤液中的蛋白质增加，若超过肾小管重吸收的阈值，尿中出现高分子蛋白，构成肾小球性蛋白。肾小管性蛋白尿包括Alb、IgG、IgA、IgM、C3、Tf、2-MG等出现或增多，对各类肾小球病变具有特异性鉴别诊断价值。相对分子量大小反映肾小球滤膜通透性的改变程度，尿Ig检测有助于肾脏疾病分期及预后判断，但已不能作为肾损伤的早期诊断指标。,尿微量蛋白系列：,31,尿微量白蛋白（Microalbuminuria,mAlb）：,mALB测定的应用被称为80年代
13、对糖尿病学的两大贡献之一。mAlb测定不仅对糖尿病肾病的早期诊断和改善预后具有划时代的意义，而且对高血压肾病、子痫及各种毒性物质所致的肾损伤都具有重要的诊断价值。 Alb是一种带负电荷的大分子，分子量为69kD，半径为3.6nm。正常肾小球基底膜具有滤过功能，平均孔径为5.5nm，表面均匀地带一层负电荷。因此，正常情况下可由少量Alb滤过，但95的Alb又在近曲小管被重吸收，故尿中mAlb含量很低，通常在几个mg/L以下，当1530 mg/L、30300mg/24h或尿Alb分泌率（UAER）20g/min时，一般认为不正常，称之为白蛋白尿。,32,尿微量白蛋白（Microalbuminuri
14、a,mAlb）：,研究资料表明，尿mAlb排出率较高者，糖 尿病肾病发病率及死亡率明显高于尿mAlb排出较低者。根据mAlb值不同，对糖 尿病人应采用不同的措施，尿白蛋白分泌率30g/min者，表明已发生了糖尿病肾病，应进行干预治疗；在1230g/min者，每隔36个月重测1次；12 g/min者应每年复查一次，及早发现肾病性损害，及时治疗。,测定方法,目前mAlb的测定方法主要有RIA、IT、FIA、ELISA、间接胶乳凝集试验法、试带法（Micral Test）等。以IT、ELISA应用最广。白蛋白试纸带法可用于初筛。,33,尿微量白蛋白（Microalbuminuria,mAlb）：,测
15、定中的注意事项： 多数情况下，可用随机尿来检测和监测成人和儿童的尿蛋白。 对于成人和儿童，通常不必要收集一夜或24小时尿液标本来检测尿蛋白。 用试纸条检测出尿蛋白阳性的病人，需在3个月内进行尿蛋白的定量测定。 两次或两次以上（间隔12周）尿蛋白阳性的病人则诊断为持续性蛋白尿，需要进行进一步的诊治。 慢性肾脏病病人监测蛋白尿应使用定量方法。 如果白蛋白-肌酐比值大于5001000mg/g，也可以使用总蛋白-肌酐比值。 定量测定前先作尿蛋白定性检查，若尿蛋白，用稀释液作110稀释，若23作150稀释，再作定量检测。,34,2-微球蛋白（2-microglobulin，2-m）：,测定方法,目前2m
16、的测定方法主要有RIA、IT、ELISA等。其中有的测定方法灵敏度低，只能用于血清标本中2m的测定，不能用于尿液或其它体液的测定。,35,标本的收集,肝素抗凝血浆或柠檬酸钠抗凝血浆2m浓度明显低于血清，故通常均用血清标本。 由于尿液中2m在pH5.5时很不稳定（可能因尿中酸性蛋白酶的分解作用），故尿液标本不宜采集清晨第一次尿，因其在膀胱内潴留，可造成破坏。通常是在清晨排尿后弃之，饮水300500ml，收集1h的全部尿液或采集随时标本。取得尿液标本后，应立即测试pH，如pH6.0，应加NaOH溶液纠正pH至中性。如收集24h尿液标本，宜在采集尿标本的前一天，给患者服用碳酸氢钠等碱性药物。,2-微
17、球蛋白（2-microglobulin，2-m）：,36,2-微球蛋白（2-microglobulin，2-m）：,37,2-微球蛋白（2-microglobulin，2-m）：,尿液中2m的意义,38,1-微球蛋白（1-microglobulin，1-m）：,血清中1m的意义,39,尿液中1m的意义,1-微球蛋白（1-microglobulin，1-m）：,40,视黄醇结合蛋白（Retinol binding protein；RBP）：,41,视黄醇结合蛋白（Retinol binding protein；RBP）：,42,转铁蛋白（Transferrin，TRF）：,的分子量为 76000
18、,属小分子量蛋白。在糖尿病肾脏病变早期 ,转铁蛋白受非酶促糖基化作用的影响较小 ,故其电荷改变不大 ,因而较白蛋白更易滤过。文献结果显示 :被检测的糖尿病患者的标本中转铁蛋白的阳性率为 59.1% ,与尿及1 阳性率相近 。说明尿亦是糖尿病早期损伤的敏感指标。,43,Tamm-Horsfall蛋白（THP）：,44,尿酶系列：,45,N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶（NAG）：,46,半乳糖苷酶（GAL）:,尿中半乳糖苷酶（GAL）是一种广泛存在于人体组织细胞中的酶，属溶酶体酶。以近曲肾小管含量较多，正常人尿中含量很低，当肾组织尤其是肾小管损害时，尿中含量明显上升。由于它富含于新生态溶酶体中，肾损伤后
19、修复时，它又可升高，所以它又是肾损伤修复的标志。如果GAL持续升高，则表明肾损伤处在修复过程中，说明愈后较好。以NAGGAL比值评价肾损伤的程度和愈后，优于单测NAG和GAL。GALNAG比值越小，说明肾损伤越严重，愈后越差，反之，比值越大则提示肾损伤轻微或恢复。一般GALNAG比值：尿毒症慢性肾炎肾病综合征和急性肾炎肾炎恢复期。 动态观察NAG和GAL两者变化对肾疾患的诊断、鉴别诊断、治疗监测和预后评估有重要价值。,47,正常参考值 尿液标本以GAL肌酐比值：2.622.4UgCr GALNAG：0.51.3 注意事项 应取新鲜中段尿离心取上清，或立即冷藏（勿冷冻）。 男性患者避免混入精液。
20、 菌尿症标本应随时离心分离上清后，立即测定或冷藏后当日测定，不可久留。,半乳糖苷酶（GAL）:,48,乳酸脱氢酶（LDH） :,49,溶菌酶（LYS） :,50,丙氨酸氨基肽酶（AAP） :,51,-谷氨酰转肽酶（-GT） :,52,亮氨酸氨基肽酶（LAP） :,53,碱性磷酸酶（ALP ):,54,55,尿酶测试中应注意的事项:,56,57,58,59,尿蛋白定性阴性患者尿微量蛋白 ,及阳性率例 ( % ),通过以上资料我们可以看出，多个项目的联合应用，无疑可以大提高肾早期损伤的检出率。,60,目前生化常用的肾早期损伤诊断指标 的可行性分析,由于这些指标在体液中的含量相当低，以往的测定方法多
21、为RIA、FIA、ELISA等，这些方法操作繁琐，灵敏度低，精密度差，所以在使用方面受到了诸多的限制，随着生化检验技术的不断发展，这些指标都有了相应的商品试剂盒，方法学多为IT法或颗粒增强免疫测浊法，测定结果已比较准确可靠，成本也完全可以接收，所以应当重视和推广生化肾早期损伤指标在临床的应用。,61,以下为某厂商部分指标的试剂报价：,（ 以上每测试价格以Olympus AU640为标准）,由上表可以看出，这些指标的测试价格已降到病人能够接受的程度，这些项目的使用可以提高慢性肾病早期检出率，对提高这类病人的生存质量提供有效的帮助。,参考文献：,慢性肾脏病及透析的临床实践指南 原著：美国NKF-K
22、/DOQI 工作组 王海燕、王梅主译 人民卫生出版社 2003.4,现代临床生化检验学 张秀明 李健斋等 人民军医出版社 2001.1,临床生物化学 康格非等 人民卫生出版社 2002.2,参考文献：,尿微量蛋白联合尿酶检测诊断早期肾损伤 廖经忠等 中国现代医学杂志 2003.5,尿微量白蛋白及尿酶谱测定对早期肾损伤的诊断价值 王际亮等 滨州医学院学报 2001.2,尿微量白蛋白与NAG测定对糖尿病早期肾损伤的价值 段贞 医学临床研究 2003.12,参考文献：,尿微量白蛋白、脉压及肾小球滤过率在高血压早期肾损伤中的应用 李梦等 中国医科大学学报 2004.4,尿微量蛋白系列测定对肝硬化早期肾损伤诊断意义的探讨 顾春刚等 中国基层医药 2001.4,谢 谢 ！,2005年2月13日,