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1、第六章 核酸类药物,本章主要内容 核酸类物质的分离提取及其发酵生产 主要核酸类药物的生产工艺 本章要求 （1）掌握酶解法制备核苷酸的方法 （2）掌握发酵法生产肌苷酸的基本方法； （3）了解叠氮胸苷、阿糖腺苷等的生产方法； （4）了解核酸类药物的分类以及主要临床用途,第一节 核酸类物质的分离提取及其发酵生产,一、核酸（DNA与RNA)的提取与制备 （了解） 1、工业用RNA的提取 （1）RNA及其工业来源,（2）高RNA含量酵母菌株的筛选 1.从自然界筛选 2.诱变育种 （3）用工业废水培养高含量RNA酵母 菌体在味精废水中（ 还原糖0.7 总糖 1.2 总氮0.2 总磷0.5 无机盐 0.1-
2、0.2 ）驯化培养，发酵24小时，RNA含量8-10,酵母菌主要生长在偏酸性的潮湿的含糖环境中，例如，在水果、蔬菜、蜜饯的内部和表面以及在果园土壤中最为常见。,物理诱变：射线、离子束、微波、超声波 化学 诱变：硫酸二乙酯（DFS）亚硝基胍（NTG）等 生物诱变：病原微生物诱变，转基因诱变,（4）RNA提取实例,碱解,230ml1.3%NaOH,碱解液,100g压榨啤酒酵母,6mol/L HCL， pH7,15min,20 ,30min,清液,沉淀,10 ， Ph2.5 6mol/L HCL,离心,置冷过夜,1.8g RNA （纯度80）,中和，离心,（二）DNA的提取与制备 1工业用DNA的提
3、取,粉碎,新鲜冷冻鱼精,水，100 15min,浆状鱼精,加热去杂蛋白，离心,含热变性DNA溶液,乙醇，丙酮,纤维状DNA,沉淀，离心,95乙醇,洗涤，减压干燥,DNA粗品 （含50-60热变性DNA),2、生物活性DNA的制备,肝、脾、胸腺,4倍生理盐水,捣碎，匀浆,匀浆液,离心,2500r/pm,30min,沉淀1,洗涤3次，悬浮,生理盐水,悬浮液,捣碎，离心,3min, 5SDS,搅拌2-3h, 0,2500r/pm,上清液,冷95乙醇,离心,纤维状DNA,洗涤,冷乙醇、丙酮,减压、低温干燥,DNA粗品,粗品DNA,蒸馏水，5SDS,搅拌1h,离心,5000r/pm,清液,NaCL，95
4、冷乙醇,沉淀,DNA沉淀,洗涤、真空干燥,乙醇、丙酮,活性DNA,二、核苷酸的制备方法（熟悉） 水解法（DNA或RNA经酶或碱水解） 发酵法 半合成法,（一）酶解法及碱水解法制备核苷酸,1.酶解法制备脱氧核苷酸,桔青霉产生核酸酶P1,核酸酶P1 酶法生产5核苷酸的主要工业用酶 来源：桔青霉(Penicillium citrinum)发酵 催化特性： 1）水解单链RNA和DNA中的3-5磷酸二酯键 （磷酸二酯酶活力强） 2）水解单核苷酸和寡核苷酸中的3-磷酸单酯键,2、酶解法制备5单核苷酸,CMP,CMP,CMP,CMP,3、双酶法生产肌苷酸和鸟苷酸（IG） I+G：呈味核苷酸,4菌体自溶法生产
5、核苷酸 原理：磷酸二酯酶在合适的条件下降解细胞内的RNA可产生5-核苷酸。 （1）谷氨酸产生菌体自溶法生产5-核苷酸工艺流程：,5碱水解法生产2，3-混合核苷酸,RNA水溶液,33.5%,碱解,0.3mol/lNaoH,保温,38，16-20h,水解液,中和,6molL盐酸,2，3-核苷酸,2,3环状磷酸酯,分解,RNA,注意：酶法降解RNA得到的是5核苷酸 碱水解法降解RNA生产2，3混合核苷酸,（二）发酵法生产核苷酸 1发酵法生产肌苷酸（IMP） 菌种：产氨短杆菌 对菌种的要求： 1）使用腺嘌呤缺陷型菌株（解除腺嘌呤衍生物的反馈抑制） 2）菌体自身的5核苷酸降解酶活力低 3）选用Mn2+不
6、敏感性变异株（培养基中添加限量Mn2+，以增加细胞膜的通透性，使肌苷酸在胞外大量合成）,（三）半合成法制备核苷酸 工业生产的呈味核苷酸约有40-50是由半合成法而制得 半合成法制备核苷酸的基本路线： 发酵法生产核苷提取、精制 磷酸化 5-核苷酸,肌苷,氯化氧磷,磷酸三乙酯，水,磷酸化反应，2h,5-IMP(产率91）,发酵,三、核苷的制备 化学法 发酵法 （）RNA化学水解法制备核苷 1核苷生产工艺流程（图148）,图14.8 RNA经甲酰胺化学水解制备核苷生产工艺流程图,1.水解,2.离子交换分离,3.浓缩,4.结晶,（鸟苷腺苷尿苷胞苷）磷酸,（腺苷尿苷胞苷）,（阳离子交换）,阴离子交换,阴
7、离子交换,（二）发酵法生产核苷 规模： 千吨/年 优点：产量大，周期短，易控制。 产核苷菌株的共同特点： 选用磷酸单酯酶活力强的枯草芽孢杆菌或短小芽抱杆菌的诱变出发菌株； 用物理或化学法筛选出诱变菌 发酵培养时必须提供限量的生长因素，并且好氧，在某一特定的范围内累积大量核苷。,1发酵法生产肌苷 菌种：枯草杆菌,保藏斜面菌种,32 活化,20h,生产斜面种,32 ,15h,一级种子液,1 %接种量32 ,8h,二级种子液,1 0%接种量,1.2L 发酵罐,发酵液,过滤，除菌体,发酵清液,阳离子交换树脂,洗脱液,活性炭吸附,洗脱液,减压浓缩、冷冻结晶,肌苷粗品,其它产肌苷菌种：产氨短杆菌,第二节
8、核酸类药物,核酸类药物的分类： 第一类：天然核酸类物质 （与代谢障碍疾病有关） 第二类：自然结构碱基、核苷、核苷酸结构的类似物或聚合物 （抗病毒、肿瘤、艾滋病药物，产生干扰素、免疫抑制）,一、叠氮胸苷（Azidothymidine，AZT） （一）结构与性质 AZT是1987美国FDA批准的治疗艾滋病药 （二）生产工艺 以胸苷为起始原料进行化学合成,工艺特点：原料来源少，合成路线复杂，成本高。,叠氮胸苷的合成工艺路线,起始原料胸苷的制备方法： DNA水解法 （主要方法）,2-脱氧胞苷,2-脱氧鸟苷,2-脱氧腺苷,+,胸腺嘧啶,大肠杆菌磷酸化酶,胸苷,鸟苷,胸腺嘧啶,嘌呤核苷磷酸化酶,嘧啶核苷磷
9、酸化酶,5-甲基尿苷,胸苷,化学法,二、阿糖腺苷Adenine arabinoside （一）结构与性质 化学名：9-D-阿拉伯呋喃糖腺嘌呤，或称腺嘌呤阿拉伯糖苷。 已有合成方法： 发酵法 酶转化法,阿糖脲苷,尿嘧啶磷酸化酶,嘌呤核苷磷酸化酶,阿糖腺苷,（二）生产工艺 1、酶-化学合成法 原料：尿苷 过程：氧氯化磷和二甲基甲酰胺反应、水解反应、酶法转化。,氧氯化磷,二甲基甲酰胺,氧桥化合物,（水解）,（原料1）,原料2,酶-化学合成法制备阿糖尿苷工艺路线,化学催化,酶催化,酶催化,（三）作用与用途 作用：广谱DNA病毒抑制剂，对单纯疱疹、型，带状疱疹，巨细，牛痘等DNA病毒，在体内外都有明显抑
10、制作用 用途：治疗单纯疱疹脑炎最好的抗病毒药物。,三、三氮唑核苷（熟悉） （一）结构与性质 商品名病毒唑，对DNA病毒、RNA病毒均有广泛作用。 性质：白色结晶，熔点174176，易溶于水。 特点：毒副作用小于AZT（叠氮胸苷），价格低廉， 不易产生抗药性,（二）生产工艺 1.酶合成法 微生物：产气肠杆菌 底物：肌苷（尿苷、鸟苷）和三叠氮羧基酰胺（TCA）,N,尿苷,核糖1-磷酸,（嘧啶核苷磷酸化酶）,嘌呤核苷磷酸化酶,尿苷,酶促法直接生产三氮唑核苷的方法： 1. 双酶法： 采用前段与后段由两个不同的酶催化，即前段使用嘧啶核苷磷酸化酶（urose)，后段使用嘌呤核苷磷酸化酶（pynpase）（
11、两种酶可同时由产气肠杆菌培养获得） 2.单酶法： 前段及后段反应都利用嘌呤核苷磷酸化酶（由乙酰短杆菌培养获得）,2. 化学合成法（目前国内工业生产多采用） （肌苷法） 三步： 1.乙酰化（醋酐冰醋酸） 2. 融熔缩合（160-165，减压） 3.氨解（甲醇溶液） 三废处理： 催化剂、氨气、甲醇和副产物,肌苷,四乙酰核糖,TCA,双磷酸酯催化,三氮唑核苷,（鸟苷法）：,三氮唑核苷（收率50%）,3-3.5kg,1kg,3.发酵法（日本报导） 培养基：1，2，4-三唑-3-羧酰胺（TCA）、D-葡萄糖菌种：短杆菌、棒状杆菌、节核杆菌、微球菌或杆菌培养条件：室温培养2-8天 转化率为40-60%。
12、优点：直接从D-葡萄糖制备，三废易于治理。 缺点：原材料单耗较大，葡萄糖用量为1:560，TCA为1:19。,（三）作用与用途 广谱抗病毒（DNA和RNA病毒）和抗肿瘤作用 临床用于治疗流感、疱疹、肿瘤和肝炎,四、阿糖胞苷 （一）结构与性质 别名：胞嘧啶阿拉伯糖苷，糖的组成部分是阿拉伯糖。 白色或类自色结晶性粉末，无臭，易溶于水，略溶于甲醇、乙醇中，乙醚中极微溶。,（二）生产工艺 1以5CMP为原料的合成法 （1）工艺路线：,2、工艺过程： 水解：加入处理好的6.5L 氢氧化镧凝胶，总体积为7.5L，升温至90，在不断搅拌下，于pH9下进行水解。 氧桥化：冰盐浴中进行 氨解：使氧桥断裂3，5-
13、乙酰基脱落 。 成盐： 2盐酸-甲醇 2、以葡萄糖酸钙为原料的合成路线 （略）,五、聚肌胞苷酸（聚肌胞）（Poyinosinic，Polycytidylic Acid，Poly1：C） （一）结构与性质 干扰素诱导剂，由多聚肌苷酸和多聚胞苷酸组成的双股多聚核苷酸。具有广谱抗病毒作用 可溶于0.85氯化钠溶液。,（二）生产工艺 1、底物5-核苷二磷酸吡啶盐的制备 5核苷酸（ 5肌苷酸或5胞苷酸）吗啡啉双环己基碳二亚胺 5核苷酸吗啡啉盐三正丁胺磷酸盐无水吡啶 5核苷酸二磷酸吡啶盐（即CDP吡啶盐，IDP吡啶盐）,乙醇 83回流,2.固定化多核苷酸磷酸化酶的制备,（3） 将分离纯化的酶液滴加入冰浴中
14、的载体，得到共价结合的 固定化多核苷酸磷酸化。,3、Poly I：C制备 （1）底物预处理：CDP吡啶盐转成锂盐，IDP转成钠盐。 （2）酶促反应： （每毫升反应液含molL数） IDP或CDP 15；Tris 150；MgC126； EDTA 1；聚合酶5单位，pH9.0，37，34小时。 用盐酸调pH1.52.0，使PolyI（或Poly C）沉淀，立即离心。此后在磷酸液冲液中溶解，等摩尔Poly I与Poly C混合，生成产品 。,六、胞二磷胆碱（CDP-胆碱） （Citico line，CDPcholine，Cytidine diphosphocholine） （一）结构与性质 化学名
15、：胞嘧啶核苷-5-二磷酸胆碱钠盐 性质：白色无定形粉末，易吸湿，易溶于水，几不溶于乙醇、氯仿、丙酮等多数有机溶剂。,（二）生产工艺 1、酶合成法 反应体系为： 产酶菌体：酵母泥 550mgm1 底物：CMP 20molml， 磷酰胆碱 30molml， KH2PO4NaOH缓冲液（pH8.0）200molml， 葡萄糖 1000molml，MgSO4.7H2O 20molml， 上述反应体系于28保温20小时，胞二磷胆碱对胞苷酸的收率为80。,2粘性红酵母发酵法 国外发现一株粘性红酵母可高产胞二磷胆碱。 菌体培养基（gL）： 葡萄糖50；蛋白胨5；酵母膏2；KH2PO4 2；（NH4）2HPO
16、4 2；MgSO4.7H2O 1；pH6.0，经28，22h培养，收集菌体，菌体经0.2molL磷酸缓冲液pH7.0洗涤，备用。,产生胞二磷胆碱的反应体系（gL）： 葡萄糖140；MgSO4.7H2O 6；5CMPNa2 20；磷酸胆碱 20；析干菌体50；磷酸缓冲缓pH7.0、0.2molL，30，28小时产胞二磷胆碱9.8gL，对5-CMP收率92.5。,提取工艺：,反应液,离心,除菌体,清液,阳离子交换树脂,调PH8.5，水洗， 梯度洗脱,甲酸洗脱液,活性炭柱,丙酮-氨水洗脱,洗脱液,减压浓缩,浓缩液,乙醇,结晶,胞二磷胆碱,（三）作用与用途 临床用于减轻严重脑外伤和脑手术伴随的意识障碍，治疗帕金森氏症，抑郁症等精神疾患。 用于脑外伤，脑出血患者可合用止血剂和防水肿药； 用于震颤麻痹可合用L-多巴； 用于精神病可合用镇静药。,