生物化学_第一章_蛋白质.ppt

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1、第二章 蛋白质,第一节 蛋白质的元素组成、分类及生物学功能 第二节 氨基酸 第三节 肽 第四节 蛋白质的分子结构 第五节 蛋白质结构与功能的关系 第六节 蛋白质的理化性质 第七节 蛋白质的分离纯化与鉴定 第八节蛋白质组学简介,1、掌握基本氨基酸的结构、分类、性质以及肽的概念特点，分离纯化的基本方法。 2、重点掌握蛋白质的结构、性质以及结构和功能的相互关系，蛋白质的分离纯化方法、技术。,本章学习重点,第一节 蛋白质的元素组成、分类及生物学功能,一、蛋白质的元素组成 二、蛋白质的分类 三、蛋白质的生物学功能,一、 蛋白质的元素组成,蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、氧外，还有氮和少量的硫。

2、某些蛋白质还含有其他一些元素，主要是磷、铁、碘、钼、锌和铜等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为： 碳 50 氢 7 氧 23 氮 16% 硫 03 其他 微 量,蛋白质的含氮量,蛋白质的平均含氮量为16%，这是蛋白质元素组成的一个特点，也是凯氏（Kjedahl）定氮法测定蛋白质含量的计算基础。所以，可以根据生物样品中的含氮量来计算蛋白质的大概含量： 蛋白质含量=蛋白氮 6.25 6.25为蛋白质系数，即1克氮所代表的蛋白质量（克数）,三聚氰胺粉末,不溶于冷水，溶于热水，微溶于乙二醇、甘油、乙醇，不溶于乙醚、苯、四氯化碳 ,遇强酸或强碱水溶液水解。,三聚氰胺含氮量高达66.6%,其实凯氏定氮法

3、的缺陷并不难弥补，只要多一道步骤即可：先用三氯乙酸处理样品。三氯乙酸能让蛋白质形成沉淀，过滤后，分别测定沉淀和滤液中的氮含量，就可以知道蛋白质的真正含量和冒充蛋白质的氮含量。,蛋白质的分子组成,经酸、碱和酶处理蛋白质，使其彻底水解得到产物为氨基酸，组成蛋白质的常见20种氨基酸中除脯氨酸外，均为-氨基酸：,不变部分,可变部分,二、 蛋白质的分类,1、据分子形状分 2、据分子组成分 3、据溶解度分 4、据生物功能分,球状蛋白质（globular protein） *纤维状蛋白质（fibrous protein）,外形接近球形或椭圆形，溶解性较好，细胞中的大多数可溶性蛋白质如胞质酶类，属于此类。,球

4、状蛋白质（globular protein） ：,分子类似纤维或细棒。大都是结构蛋白，如胶原蛋白，角蛋白等。 可分为可溶性纤维状蛋白质（如肌肉中的肌球蛋白）和不溶性纤维状蛋白质（如胶原蛋白，角蛋白等）。,*纤维状蛋白质（fibrous protein） ：,简单蛋白(simple protein) 结合蛋白(conjugated protein),1、据分子形状分 2、据分子组成分 3、据溶解度分 4、据生物功能分,简单蛋白,又称为单纯蛋白质；这类蛋白质仅由氨基酸组成，不含其它化学成分。 *清蛋白和球蛋白：albumin and globulin广泛存在于动物组织中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶

5、于水，易溶于稀酸中。 *谷蛋白(glutelin)和醇溶谷蛋白(prolamin)：植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀碱中，后者可溶于7080乙醇中。 *精蛋白和组蛋白：碱性蛋白质，存在与细胞核中。 *硬蛋白：存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织中，分为角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。,结合蛋白,除氨基酸外，还含有其它化学成分（辅因子），如： *色蛋白：含色素物质，如血红蛋白、细胞色素等。 *糖蛋白：含糖类物质，如细胞膜中的糖蛋白等。 *脂蛋白：含脂类。，如血清-，-脂蛋白等。 *核蛋白：含核酸结合而成，如核糖体。,1、据分子形状分 2、据分子组成分 3、据溶解度分 4、据生物功能分,清蛋

6、白、球蛋白、 谷蛋白、醇溶蛋白等,根据溶解度： 清蛋白：又称白蛋白。溶于水。如乳清蛋白、血清清蛋白 球蛋白：微溶于水，溶于稀中性盐溶液。如大豆球蛋白 谷蛋白：不溶于水、醇及中性盐溶液。但溶于稀酸、稀碱。如米、麦蛋白 醇溶蛋白：不溶于水、溶于70-80%的乙醇。如玉米蛋白 另外还有精蛋白、组蛋白、硬蛋白等,酶、结构蛋白、运输蛋白、营养和储存蛋白、收缩蛋白和运动蛋白、防御蛋白、调节蛋白,1、据分子形状分 2、据分子组成分 3、据溶解度分 4、据生物功能分,三、蛋白质的生物学功能,1、催化功能 酶类 2、结构功能（胶原蛋白；韧带中的弹性蛋白；头发、指甲 和皮肤中的不溶性角蛋白；蚕丝、蛛网） 3、营养

7、和储存功能（卵清蛋白和牛奶中的酪蛋白） 4、运输功能（血红蛋白、肌红蛋白） 5、收缩或运动功能（骨骼肌收缩肌动蛋白和肌球蛋白相对滑动的结果） 6、激素功能（胰岛素） 7、保护和防御功能（蛋白质抗体和免疫球蛋白） 8、接受和传递信息功能（受体蛋白） 9、调节或控制细胞的生长、分化和遗传信息的表达功能（组蛋白、阻遏蛋白）,蛋白质是生命活动的物质基础，它参与了几乎所有的生命活动过程。,小结,第一节 蛋白质的元素组成、分类及生物学功能,一、蛋白质的元素组成 二、蛋白质的分类 三、蛋白质的生物学功能,第二节 氨 基 酸（amino acid）,一、氨基酸的分类 二、氨基酸的理化性质 三、氨基酸的分离分析

8、,蛋白质的水解,根据水解程度 完全水解 氨基酸混合物 不完全水解 大小不等的肽和氨基酸,根据水解方法 酸水解：多数氨基酸稳定，不引起消旋作用；Trp完全被破坏，羟基氨基酸部分分解，Gln和Asn的酰胺基被水解下来。 碱水解： Trp稳定；多数氨基酸被不同程度破坏，且产生消旋现象，Arg脱氨。 酶水解：不产生消旋作用，也不破坏氨基酸，但需多种酶协同作用。,蛋白质的氨基酸组成,目前已发现的氨基酸有250多种。但是组成蛋白质的常见的氨基酸只有20种，称为基本氨基酸。 各种蛋白质所含的20种常见氨基酸的种类和数目各不相同。或者说，20种常见氨基酸不同的排列顺序组成了特定的蛋白质。 蛋白质分子中的氨基酸

9、组成与其性质相关。此外蛋白质分子中氨基酸组成及比例与其结构也有一定的关系。,一、氨基酸的分类,根据是否组成蛋白质分为： 1.蛋白质中常见氨基酸 2.蛋白质中稀有氨基酸 3.非蛋白氨基酸,1.常见蛋白质氨基酸（20种）,有对应的遗传密码。 近年发现谷胱甘肽过氧化物酶中存在硒代半胱氨酸，有证据表明此氨基酸由终止密码UGA编码，可能是第21种蛋白质氨基酸。,结构通式（脯氨酸除外） 共同特点：L-型，羧基相连的-碳上连接-NH2，所以都是L-氨基酸。,不变部分,可变部分,根据R基团极性20种常见氨基酸又分为,(1)非极性R基团氨基酸：8种Ala Val Leu Ile Phe Pro Trp Met

10、(2)极性不带电荷R基团氨基酸：7种Gly Ser Thr Tyr Asn Gln Cys (3)带负电荷R基团氨基酸：2种Asp Glu (4)带正电荷R基团氨基酸：3种Lys Arg His,1、蛋白质中常见氨基酸的结构,(1)非极性R基团氨基酸,-氨基丙酸,丙氨酸 Alanine,(1)非极性R基团氨基酸,-氨基异戊酸,丙氨酸 Alanine 缬氨酸 Valine,(1)非极性R基团氨基酸,-氨基异己酸,丙氨酸 Alanine 缬氨酸 Valine 亮氨酸 Leucine,-氨基-甲基戊酸,丙氨酸 Alanine 缬氨酸 Valine 亮氨酸 Leucine 异亮氨酸 Ileucine,

11、(1)非极性R基团氨基酸,(1)非极性R基团氨基酸, -氨基-苯基丙酸,丙氨酸 Alanine 缬氨酸 Valine 亮氨酸 Leucine 异亮氨酸 Ileucine 苯丙氨酸 Phenylalanine,(1)非极性R基团氨基酸,-吡咯烷基-羧酸,丙氨酸 Alanine 缬氨酸 Valine 亮氨酸 Leucine 异亮氨酸 Ileucine 苯丙氨酸 Phenylalanine 脯氨酸 Proline,(1)非极性R基团氨基酸, -氨基-吲哚基丙酸,丙氨酸 Alanine 缬氨酸 Valine 亮氨酸 Leucine 异亮氨酸 Ileucine 苯丙氨酸 Phenylalanine 脯氨

12、酸 Proline 色氨酸 Tryptophan,(1)非极性R基团氨基酸, -氨基-甲硫基丁酸,丙氨酸 Alanine 缬氨酸 Valine 亮氨酸 Leucine 异亮氨酸 Ileucine 苯丙氨酸 Phenylalanine (F) 脯氨酸 Proline 色氨酸 Tryptophan(W) 甲硫氨酸 Methionine,R基疏水性大小 AlaMetProValLeuIlePheTrp 这类氨基酸R基的疏水性在维持蛋白质的三维结构中起着重要作用。,特点：不易溶于水,Pro是唯一的一种-亚氨基酸，它在蛋白质空间结构中具有极重要的作用，一般出现在两段-螺旋之间的拐角处。,(2) 极性不带

13、电荷R基团氨基酸,氨基乙酸,甘氨酸 Glycine,(2) 极性不带电荷R基团氨基酸, -氨基-羟基丙酸,甘氨酸 Glycine 丝氨酸 Serine,(2) 极性不带电荷R基团氨基酸, -氨基-羟基丁酸,甘氨酸 Glycine 丝氨酸 Serine 苏氨酸 Threonine,(2) 极性不带电荷R基团氨基酸, -氨基-对羟苯基丙酸,甘氨酸 Glycine 丝氨酸 Serine 苏氨酸 Threonine 酪氨酸 Tyrosine,(2) 极性不带电荷R基团氨基酸,甘氨酸 Glycine 丝氨酸 Serine 苏氨酸 Threonine 酪氨酸 Tyrosine 天冬酰胺 Asparagin

14、e,(2) 极性不带电荷R基团氨基酸,甘氨酸 Glycine 丝氨酸 Serine 苏氨酸 Threonine 酪氨酸 Tyrosine 天冬酰胺 Asparagine 谷氨酰胺 Glutamine,(2) 极性不带电荷R基团氨基酸,甘氨酸 Glycine 丝氨酸 Serine 苏氨酸 Threonine 酪氨酸 Tyrosine 天冬酰胺 Asparagine 谷氨酰胺 Glutamine(Q) 半胱氨酸 Cysteine, -氨基-巯基丙酸,特点：这类氨基酸侧链含极性基团，但在生理条件下不解离，易溶于水，R侧链能与水形成氢键。,Cys中R含巯基（-SH），两个Cys的巯基 氧化生成二硫键，

15、生成胱氨酸。 二硫键在蛋白质的结构中具有重要意义。,(3)带负电荷R基团氨基酸, -氨基丁二酸,天冬氨酸 Aspartate,(3)带负电荷R基团氨基酸, -氨基戊二酸,天冬氨酸 Aspartate(D) 谷氨酸 Glutamate (E),在生理条件下,侧链羧基完全解离，带负电荷。 为酸性氨基酸。,(4)带正电荷R基团氨基酸,，-二氨基己酸,赖氨酸 Lysine,(4)带正电荷R基团氨基酸, -氨基-胍基戊酸,赖氨酸 Lysine 精氨酸 Arginine,(4)带正电荷R基团氨基酸, -氨基-咪唑基丙酸,赖氨酸 Lysine(K) 精氨酸 Arginine 组氨酸 Histidine,在生

16、理条件下，侧链解离，带正电荷。 为碱性氨基酸。,另外，根据R侧链的化学结构，20种常见氨基酸 可以分为： 脂肪族氨基酸 （15种） 芳香族氨基酸（Phe, Tyr） 杂环族氨基酸 （Trp, His, Pro）,从营养学角度分类：必需氨基酸和非必需氨基酸 必需氨基酸：人和哺乳动物不可缺少但又不能自身合成的氨基酸，只能从食物中补充。包括8种 （Ile 、 Met、 Val、 Leu、 Trp、 Phe、 Thr 、 Lys）“一家写两三本书来”还有2种：Arg、His，人和哺乳动物虽然能够合成，但数量远远达不到机体的需求，尤其是在胚胎发育以及婴幼儿期间，基本上也是由食物中补充，称为半必需氨基酸。

17、 注：植物和微生物能合成自己全部的氨基酸。,2.蛋白质中几种重要的稀有氨基酸,在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸，通常称为稀有的蛋白质氨基酸。 这些氨基酸都是由相应的基本氨基酸衍生而来的。在 遗传上，不具有遗传密码。 其中重要的有4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、N-甲基赖氨酸、和3,5-二碘酪氨酸等。这些不常见蛋白质氨基酸的结构如下。,3.非蛋白氨基酸（200多种）,广泛存在于各种细胞和组织中，呈游离或结合态，但并不存在于蛋白质中的一类氨基酸，大部分也是蛋白质氨基酸的衍生物。 H2N-CH2-CH2-COOH H2N-CH2-CH2-CH2-COOH,-丙氨酸,-氨基丁酸,非蛋白氨基酸存在

18、的意义：,(1)作为细菌细胞壁中肽聚糖的组分：D-Glu D-Ala (2)作为一些重要代谢物的前体或中间体:-丙氨酸、鸟氨酸（Orn）、胍氨酸（Cit） (3)作为神经传导的化学物质：-氨基丁酸 (4)有些氨基酸只作为一种N素的转运和贮藏载体 (5)杀虫防御作用:如种子中高浓度的刀豆氨酸和5-羟色氨酸能防止毛虫的危害，高精氨酸能抑制细菌的生长。 绝大部分非蛋白氨基酸的功能不清楚。,1.高熔点 2.一般均溶于水，溶于强酸、强碱；不溶于乙醚。 3.氨基酸一般有味：如大米的香味（Cys)、啤酒的苦味（Val、Leu、Ile） 氨基酸的两个重要性质：氨基酸晶体的熔点高（200C）；氨基酸使水的介电常

19、数增高。,二、 氨基酸的理化性质,（一）氨基酸的一般物理性质,二、 氨基酸的理化性质,除甘氨酸外，其他氨基酸含有一个手性-碳原子，因此都具有旋光性。,（二）氨基酸的光学性质 1.氨基酸的旋光性,旋光性：旋光物质使平面偏振光的偏振面发生旋转的能力。使偏振面向右旋的，称右旋光物质，记为“+”，使偏振面向左旋的，称左旋光物质，记为“-”。 氨基酸的旋光性是由它们的结构决定的。 除甘氨酸外，其它氨基酸的-C原子都与四个不同的原子和基团连接，因而是不对称C原子。 手性中心（chiral center）：当一个C原子有四个不同的取代基同它连接形成一个不对称碳原子时，这个碳原子就是一个不对称中心或称做手性中

20、心。,2.氨基酸的光吸收,构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(220nm)均有光吸收。 在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有光吸收的能力。 酪氨酸的max275nm; 苯丙氨酸的max257nm; 色氨酸的max280nm;,（三）氨基酸的两性解离性质和等电点,1.氨基酸的兼性离子形式（两性离子） H H3N-C-COO- R,+,两性离子：在同一个氨基酸分子上带有能给出质子的-NH3+正离子；可以接受外界质子的-COO-负离子。即在同一氨基酸分子上含有等量的正负两种电荷。,二、 氨基酸的理化性质,在反应中它可以提供质子，起酸的作用： N+H

21、3 NH2 R C COO- R C COO- + H+ H H 也可以接受质子，起碱的作用： N+H3 N+H3 R C COO- + H+ R C COOH H H 因此氨基酸是两性电解质,2.氨基酸的两性解离 在不同的pH条件下，两性离子的状态也随之发生变化。,pH 1 7 10 净电荷 +1 0 -1 正离子 两性离子 负离子 等电点pI,（三）氨基酸的两性解离性质和等电点,3. 氨基酸的等电点及其计算,氨基酸的等电点:当溶液pH为某一值时，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-数目正好相等，净电荷为0。这一pH值即为氨基酸的等电点，简称pI。 在等电点时，处于电场中的氨基酸既不向正

22、极也不向负极移动，即没有电泳行为。,丙氨酸的解离方程,COOH H3N+ C H CH3,K1,COO- H3N+ C H CH3,COO- H2N C H CH3,K2,+,H+,COO- H3N+ C H CH3,+,H+,Ala+,Ala+,Ala+,Ala-,丙氨酸在酸性溶液中，完全质子化：,K1、K2分别代表-COOH和-NH3+的表观解离常数，若侧链R基有可解离的基团，其表观解离常数用KR表示。,当Ala处于pI时，Ala+=Ala-,Ala+H+,Ala+*K2,K1,H+,=,-,-,H+2,=,K1,K2,.,pI=(pK1+ pK2)/2,所以，丙氨酸 pI=(2.34+9

23、.69) /2=6.02,侧链不含解离基团的中性氨基酸，其等电点是它的pK1和pK2的算术平均值,HCl NaOH,物质的表观解离常数可以用测定滴定曲线的实验方法求得。,20种基本氨基酸中只有组氨酸咪唑基的pK最接近生理pH值（游离氨基酸中为6.00，在多肽链中为7.35 ），是在生理pH条件下唯一具有缓冲能力的氨基酸。,天冬氨酸的解离方程,COOH CH NH 3 CH2 COOH,COO- CH NH3 CH2 COOH,COO- CH NH3 CH2 COO-,COO- CH NH2 CH2 COO-,+ H+,- H+,- H+,- H+,+ H+,+ H+,K1,K2,KR,Asp+

24、,Asp+,Asp-,Asp2 -,pIAsp= (pK1 + pKR) /2,+,+,+,带有可解离R基的氨基酸，相当于三元酸，有3个pK。,赖氨酸： H+ OH- COOH COO- COO- COO- K1 K2 KR H3N+ C H H3N+ C H H2N C H H2N C H 2.18 8.95 10.53 ( CH2 )4 ( CH2 )4 ( CH2)4 ( CH2)4 N+H3 N+H3 N+H3 NH2 Lys2+ Lys+ Lys+- Lys- pI=(pK2+pKR) /2=(8.95+10.53)=9.74,氨基酸等电点的计算:侧链不含离解基团的中性氨基酸，其等电

25、点是它的pK1和pK2的算术平均值：pI = (pK1 + pK2)/2 同样，对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其pI值也决定于两性离子两边的pK值的算术平均值。 酸性氨基酸： pI = (pK1 + pK R-COO- )/2 碱性氨基酸： pI= (pK2 + pKR-NH2 )/2,小 结,1.某氨基酸的等电点即为该氨基酸两性离子两边的pK值和的一半。 2.在氨基酸等电点以上任何pH，AA带净的负电荷，在电场中向正极移动；在氨基酸等电点以下任何pH，AA带净的正电荷，在电场中向负极移动。 3.在一定pH范围中，溶液的pH离AA等电点愈远，AA带净电荷愈多。,用途：常用于氨基酸的定性或定量

26、分析。,（四）氨基酸的化学反应,1.与茚三酮的反应（弱酸加热条件下- NH2和-COOH 共同参与的反应）,脯氨酸与茚三酮反应的产物：,N+,黄色化合物,（四）氨基酸的化学反应,2.与2、4-二硝基氟苯的反应(- NH2 参与的反应),在碱性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。,+,DNFB（dinitrofiuorobenzene）,氨基酸,DNP-AA(黄色),+ HF,用途：可以用来鉴定多肽或蛋白质-NH2末端氨基酸.亦称Sanger反应,2. 与2、4-二硝基氟苯的反应,在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与

27、N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。 此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol。,3.与丹磺酰氯的反应,丹磺酰氨基酸具有强烈的黄色荧光。此法优点为灵敏性较高(比DNFB法提高100倍，样品量小于1毫微克分子)及丹磺酰氨基酸稳定性较高(对酸水解稳定性较DNP-氨基酸高)，可用纸电泳或聚酰胺薄膜层析鉴定。,+,PITC,苯硫乙内酰脲(PTH-AA),苯氨基硫甲酰氨基酸（PTC-氨基酸）,4.与苯异硫氰酸酯的反应(- NH2 参与的反应),用途：可以用来鉴定多肽或蛋白质-NH2末端氨基酸.亦称Edman反应,弱碱,PITC+ 多肽 蛋白,PTC多肽

28、蛋白,无水甲酸 或HF,PTH-AA + 少一个AA的多肽或蛋白,4.与苯异硫氰酸酯的反应,5.成肽反应,是多肽和蛋白质生物合成的基本反应,6侧链基团的化学性质,(1) 巯基（-SH）的性质,作用：这些反应可用于巯基的保护。,（1） 巯基（-SH）的性质,作用：与金属离子的螯合性质可用于体内解毒,对羟汞苯甲酸,6侧链基团的化学性质,(1) 巯基（-SH）的性质,作用：氧化还原反应可使蛋白质分子中二硫键形成或打开。,胱氨酸,6侧链基团的化学性质,（2）羟基的性质,作用：可用于修饰蛋白质。,二异丙基氟磷酸酯,6侧链基团的化学性质,（3）咪唑基的性质,组氨酸含有咪唑基，它的pK2值为6.0，在生理条

29、件下具有缓冲作用。 组氨酸中的咪唑基能够发生多种化学反应。可以与ATP发生磷酰化反应，形成磷酸组氨酸，从而使酶活化。 组氨酸的咪唑基也能发生烷基化反应。生成烷基咪唑衍生物，并引起酶活性的降低或丧失,作用：判断酶的活性中心,6侧链基团的化学性质,三、氨基酸的分离和分析鉴定,1、分配层析 2、离子交换层析 3、高效液相色谱,1. 氨基酸的纸层析,2. 离子交换层析,3. 高效液相色谱（HPLC）,小 结,AA的分类 AA的理化性质 一般物理性质 AA的光吸收 AA的两性解离 AA的化学反应 AA的分离分析,第二章 蛋白质,第一节 蛋白质的化学组成 第二节 氨基酸 第三节 肽 第四节 蛋白质的分子结

30、构 第五节 蛋白质结构与功能的关系 第六节 蛋白质的理化性质 第七节 蛋白质的分离纯化与鉴定 第八节蛋白质组学简介,一、肽与肽键 二、肽链中AA的排列顺序和命名 三、肽的重要理化性质 四、天然存在的重要寡肽,第三节 肽（peptide）,第三节 肽（peptide）,一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基之间失水缩合形成的酰胺键称为肽键，所形成的化合物称为肽。,一、肽与肽键,由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由少于10个氨基酸组成的肽称为寡肽，由多于10个氨基酸组成的肽称为多肽。肽链中的氨基酸单元称为氨基酸残基。,肽平面：肽链中的酰胺键及相邻的两个C原子处于同一平面，构成折叠单位， 称为肽平面。肽链

31、中肽平面涉及的原子形成主链骨架，称主肽链。,四肽的结构,在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序 通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基端或C-端。习惯上将氨基末端写在左侧。 氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。肽链中的氨基酸称为氨基酰，如上述五肽可表示为： Ser-Val-Tyr-Asp-Gln,二、肽链中AA的排列顺序和命名,三、肽的重要理化性质,1.每种肽也有其晶体，晶体的熔点都很高。 2.在pH0-14范围内，肽的酸碱性质主要来自游离末端-NH2和游离末端-CO

32、OH以及侧链上可解离的基团。 3.每一种肽都有其相应的等电点，计算方法与AA一致且复杂。 4.肽的化学反应：也能发生茚三酮反应、Sanger反应和Edman反应；还可发生双缩脲反应（是肽和蛋白质所特有而氨基酸所没有的颜色反应）。,三、肽的重要理化性质,双缩脲是两分子的尿素经加热失去一分子NH3而得到的产物。 双缩脲能够与碱性硫酸铜作用，产生蓝色的铜-双缩脲络合物，称为双缩脲反应。 含有两个以上肽键的多肽，具有与双缩脲相似的结构特点，也能发生双缩脲反应，生成紫红色或蓝紫色络合物。这是多肽定量测定的重要反应。,四、 天然存在的重要寡肽,在生物体中有许多分子量比较小的肽以游离状态存在。它们具有各种特

33、殊的生理功能，常称为活性肽（active peptide）。 如：谷胱甘肽;脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；蛇毒多肽等。,谷胱甘肽存在于动、植物及微生物中,CO-NH-CH-CO-NH-CH2-COOH,CH2,CH2,CHNH2,COOH,CH2,SH,1.参与体内氧化还原反应 2.作为辅酶参与氧化还原反应 保护巯基酶或含Cys的蛋白质中SH的还原性 3.防止过氧化物积累 4.作为一种电子传递体参与植物体内的电子传递,L- Leu- D-Phe- L-Pro-L- Val L-Orn L-Orn L- Val- L-Pro- D-Phe - L-Leu 由细菌分泌的多肽，有时也含有D-氨基

34、酸和一些非蛋白氨基酸。如鸟氨酸（Ornithine, 缩写为 Orn）。能抗革兰氏阳性菌，对阴性细菌如绿脓杆菌、变性菌也有效。临床上用于治疗和预防化脓性病症。,短杆菌肽S(环十肽),能够与真核生物的RNA聚合酶和牢固结合，抑制转录进行。,脑 啡 肽 Met- 脑啡肽： TyrGlyGlyPheMet Leu-脑啡肽： TyrGlyGlyPheLeu 具有镇痛作用，在中枢神经系统中形成，是体内产生的一类鸦片剂。,重要的寡肽,牛催产素和牛加压素只有2个氨基酸之差，生理作用居然 不同，对于分子更大的蛋白质来说，氨基酸的排列、组合 不同，其功能也是千差万别。可见，结构决定性质和功能。,小结,一、肽与肽

35、键 二、肽链中AA的排列顺序和命名 三、肽的重要理化性质 四、天然存在的重要寡肽,第三节 肽,第二章 蛋白质,第一节 蛋白质的化学组成 第二节 氨基酸 第三节 肽 第四节 蛋白质的分子结构 第五节 蛋白质结构与功能的关系 第六节 蛋白质的理化性质 第七节 蛋白质的分离纯化与鉴定 第八节蛋白质组学简介,第四节：蛋白质的分子结构,一、蛋白质的一级结构 二、蛋白质的构象 三、蛋白质的二级结构 四、超二级结构和结构域 五、蛋白质的三级结构 六、蛋白质的四级结构,蛋白质的结构,蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide)链以特殊方式结合而成的生物大分子。 蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量

36、在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。 蛋白质分子量变化范围很大, 从大约6000到1,000,000道尔顿甚至更大。,一级结构 二级结构(构象单元） 超二级结构 结构域 三级结构 四级结构,空 间 结 构,蛋白质的结构有不同的层次：,共价键,次级键,化学键,肽键,一级结构,氢键,二硫键,二、三、四级结构,疏水键,盐键,范德华力,三、四级结构,a盐键（离子键 ） b氢键 c疏水相互作用力 d 范德华力 e二硫键 f 酯键,氢键虽是弱键，但数量极大，在维系蛋白质二级结构中起主要作用，对维持三、四级结构也起一定作用 范德华引力是弱键，但数量大且具有加合性，对维持蛋白质的三、四级结构起一定作用。 蛋

37、白质分子中离子键的数量较少，主要在侧链起作用，参与维持蛋白质三、四级结构。 另外，蛋白质分子中的二硫键（共价键）在稳定蛋白质构象中也起重要作用。,稳定蛋白质高级结构的作用力,疏水作用,疏水作用是指在水介质中球状蛋白质的折叠总是倾向于把疏水残基埋藏在分子的内部。 疏水作用是疏水基团或疏水侧链出于避开水的需要而被迫接近。 往往位于蛋白质分子内部，对维系蛋白质的三、四级结构起主要作用。,龙虾素（含锌的内肽酶）,半胱氨酸蛋白酶抑制剂,一、蛋白质的一级结构,1. 定义 1969年，国际纯化学与应用化学委员会（IUPAC） 规定：多肽链中氨基酸的排列顺序称为蛋白质的一级结构。包含下述内容：蛋白质分子的多肽

38、链数目；每条肽链中氨基酸残基的种类、数目、排列次序；链内和链间二硫键的位置和数目。,以胰岛素(insulin) 为例,1）由A、B两条链组成，（A链：21 AA, B链：30AA） 共计51个氨基酸残基,Mr=5734 2）两条链由两个链间二硫键（A7-B7,A20-B19)连接，A链本身第6位和第11位的2个Cys残基之间形成一个链内二硫键。,胰岛素是动物胰脏细胞分泌的一种分子量较小的激素蛋白，主要功能是降低体内血糖含量。 英国Sanger等人于1953年首先完成了胰岛素一级结构的测定工作。,1958年获得诺贝尔化学奖,牛胰核糖核酸酶（RNase） 一条多肽链，124AA残基组成，四 个链内

39、二硫键，分子量12600。它是测出一级结构的第一个酶分子。,2.蛋白质一级结构的测定,蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。,蛋白质测序的基本策略,(1) 直接法（测蛋白质的序列） 理想方法是从N端直接测至C端，但目前一次只能测几十个氨基酸的长度。所以必须将多肽链降解成较小的肽段,然后分离,测每一个肽段的的氨基酸序列.,(2) 间接法（测核酸序列推断氨基酸序列）,a、样品必需纯（97%以上）； b、测定蛋白质的分子质量。（用于估算氨基酸残基数从而估计序列测定工作量的大小）,测定蛋白质一

40、级结构前的要求,分子质量测定的要求并不高，目前用物理化学方法测出的分子质量，误差在10%左右就足够了。 常用测定方法有： 凝胶过滤法； SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法； 沉降分析法等,1、凝胶过滤法,原理：,根据蛋白质的分子量的大小分离，在一定范围内蛋白质的分子量的对数和洗脱体积之间成线性关系。,Ve/Vo,分子量对数,SDS-PAGE法测定分子量,1) 支持介质,聚丙烯酰胺(PAGE)丙烯酰胺为单体，N，N亚甲基双丙烯酰胺作为交联剂聚合而成的具网状结构的凝胶；,在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），使蛋白样品与SDS结合形成带负电荷的复合物，由于复合物分子量的不同，在电

41、泳中反应出不同的迁移率。 根据标准样品在该系统电泳中所作出的标准曲线，推算出被测蛋白样品分子量的近似值。,相对迁移率mR =样品迁移距离（cm）/染料迁移距离（cm）,点样孔,染料迁移距离,样品迁移距离,Mr = bmR + K Mr为蛋白质分子量 mR为相对迁移率 b为斜率 K为截距。,沉降速度法,一级结构测定步骤,（1） 测定蛋白质分子中多肽链的数目 （2）拆分蛋白质分子中的多肽链 （3）断裂多肽链内的二硫键 （4） 测定多肽链的氨基酸组成 （5） 分析多肽链的N末端和C末端 （6）多肽链部分裂解成肽段 （7）测定各个肽段的氨基酸顺序 （8）确定肽段在多肽链中的顺序 （9）确定多肽链中二硫

42、键的位置,一级结构测定步骤,根据N末端或C末端残基摩尔数和蛋白质摩尔数（根据分子质量计算）确定,（1） 测定蛋白质分子中多肽链的数目 （2）拆分蛋白质分子中的多肽链 （3）断裂多肽链内的二硫键 （4） 测定多肽链的氨基酸组成 （5） 分析多肽链的N末端和C末端 （6）多肽链部分裂解成肽段 （7）测定各个肽段的氨基酸顺序 （8）确定肽段在多肽链中的顺序 （9）确定多肽链中二硫键的位置,（2）拆分蛋白质分子中的多肽链,测定步骤,多肽链之间有两种结合方式： 非共价键结合： 8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍,二硫键结合: a.过甲酸氧化 b.巯基乙醇还原：可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存

43、在下，用过量的-巯基乙醇处理,使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂（ICH2COOH）保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。,（3）断裂多肽链内的二硫键,（4） 测定多肽链的氨基酸组成,测定步骤,完全水解，测定每种氨基酸的含量，根据蛋白质分子质量，可以算出蛋白质的氨基酸组成（每摩尔蛋白质中含氨基酸残基的摩尔数）,以便选择用何种方法裂解蛋白质。 酸水解：6 mol/L的盐酸或4 mol/L的硫酸在105-110条件下进行水解，反应时间约1024小时。缺点是Trp被沸酸完全破坏；含有羟基的氨基酸如Ser、Thr、Tyr有一小部分被分解；Asn、Gln侧链的酰胺基被水解成了羧基。 碱水解：用5 mol

44、/L氢氧化钠煮沸20小时。该法的优点是色氨酸(Trp)在水解中不受破坏。 酶解：胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶。,（5） 分析多肽链的N末端和C末端,测定步骤,N-末端残基: 2,4-二硝基氟苯法 丹磺酰氯法 苯异硫氰酸酯法 氨肽酶法,C-末端残基： 肼解法 羧肽酶法,1、N端分析（氨基末端分析）,二硝基氟苯（FDNB）法,FDNB,Edman降解法（苯异硫氰酸酯法）,丹磺酰氯（DNS-Cl）法,乙酸乙酯抽提,色谱鉴定,氨肽酶法,氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个向里水解。 根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的AA种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线

45、，从而知道Pr N-末端残基顺序。 最常用为亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。,NH2PheGluLeu,氨肽酶法测定N端的氨基酸,2、C-末端分析（羧基末端分析）, 肼解法,苯甲醛,DNFB,DNFB-AA,色谱分析鉴定,水相,羧肽酶法,NH2PheGluLeu,COOHPheGluLeu,LeuGluPheCOOH,羧肽酶的种类：,羧肽酶A 羧肽酶B,LeuProLys(Arg or Pro)COOH,不能切割,不能切割,LeuProLys(Arg)COOH,能切割,小结: 蛋白质的末端分析（N、C端）,N末端分析,二硝基氟苯（FDNB）法,Edman降解法,丹磺酰氯（DNS-Cl）法,氨肽酶法,C末端分析,肼解法,羧肽酶,测定步骤,（6） 多肽链断裂成多个肽段,可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。,酶解法: 胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶,多肽链的选择性降解,化学法：溴化氰，羟胺,Trypsinase ：R1=Lys和