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1、3.膜的合成与分选 Medicine Nobel goes to pioneer of protein guidance mechanisms Nature 401, 625 (1999) How do the proteins know where to go? How do they make their way? -Nature Gunter Blobel 细胞中自组装和自组织问题的重要课 题之一是物质的分选、定向和转运， 是细胞自组装自组织过程的第一步 # Individual Proteins are transported within the pattern according
2、to intrinsic signals. Signal sequences - initiate translocation of proteins across specific membranes. Stop-transfer sequences - interrupt the translocation process that was previously initiated by a signal sequence. Sorting sequences - act as determinants for posttranslocational traffic of subpopul
3、ations of proteins. Insertion sequences - initiate unilateral integration of proteins into the lipid bilayer without the mediation of a distinct protein effector. - Gunter Blobel (PANS 77, 1980, 1496- 1500) 蛋白质分选存在不同层次 蛋白质分选存在不同层次 由线粒体和叶绿体DNA编码的蛋白，则 在这些细胞器的核糖体中合成，因此这 些蛋白就直接编入线粒体和叶绿体空间 里(compartment)
4、。 在真核细胞中，大多数线粒体和叶绿体 蛋白，以及其它细胞器、颗粒和膜的蛋 白都是由核DNA编码，并在胞浆核糖体 中合成的。 l将这些蛋白分选到其正确的方向，就需要多 重的分选信号及多步的分选活动。 蛋白质分选存在不同层次 对于在胞浆中合成的蛋白质分选 l在粗面内质网上膜束缚的核糖体 (membrane-attached ribosomes) 上合 成的蛋白。 l未附着膜上的胞浆核糖体(membrane- unattached ribosomes)合成的蛋白。 蛋白质分选存在不同层次 对于未附着在膜上的胞浆核糖体中 合成的蛋白合成后被释放到胞浆中 ，其中一些蛋白仍保留在胞浆中， 而另外一些则被
5、编入细胞核、线粒 体、叶绿体或过氧化酶体中，然后 再进一步分选到这些细胞器中的正 确方位。 线粒体定位信号(targeting to mitochondria) 线粒体蛋白有几百种，它们是在两套遗传系 统指导下合成的。 只有大约10种线粒体内膜蛋白是由线粒体基 因编码的。 而绝大部分线粒体蛋白是由核基因编码，在 胞质中的核糖体上合成，然后跨越线粒体外膜 进入线粒体的。 把蛋白从胞浆运进线粒体至少需要两类分选 信号，一类是把蛋白导向线粒体的信号；另一 类是使蛋白定位于线粒体内膜、外膜或基质的 信号。 被导向线粒体的蛋白要首先与线粒体外膜胞质侧 的特异性受体结合，即输入受体(import-rece
6、ptor) 。许多进入线粒体的蛋白含有一个具有信号功能的 前导序列(pre-sequence)，大小从0.5kd到20kd不等 。当蛋白定位于线粒体膜上之后此前导序列被切除 。 对大量的前导序列的分析发现，它们富含Arg和 Lys，并且通常被不带电的氨基酸如Ser和Thr分隔 开，几乎不含有酸性氨基酸。这些特征都说明它们 是决定蛋白在线粒体上定位的序列. 此外还发现线粒体前体蛋白在特定的内外膜接触 区域跨越线粒体的内外膜. 蛋白质分选存在不同层次 对于在粗面内质网上膜束缚的核糖体上 合成并进入分泌途径的蛋白，又可分为 两种类型蛋白。 l一类以共转移形式即边合成边穿过内质网 膜进而进入内质网中腔
7、中的蛋白。 l另一类为整合膜蛋白(integral membrane protein)，这些蛋白的前25个氨基酸组成的 序列叫做拓扑序列(topogenic sequences)，用 以保证蛋白在插入内质网膜时获得正确的定 向。 蛋白质合成与分选的分泌途径 对于内质网来说，一个基本的任务就是 把继续留在内质网中发挥功能的蛋白与移 向其他膜系统的蛋白区别开来。 有关决定蛋白质的精确定位的信息目前 了解较少，但已经鉴别了一些与蛋白的分 选和定位相关的地址信号序列，其中之一 为内质网驻留信号。 内质网驻留信号(signals for retention in ER) 目前一种观点认为，那些将要离开内
8、质网转运 到高尔基体、并进一步转运到质膜或溶酶体等 细胞器的蛋白，是不需要特定的信号序列的( ? ，这种观点可能不对!)。 而在那些保留在内质网中的蛋白上却发现了一 些保守的信号序列所谓的内质网驻留信号。 如，已发现序列lys-Asp-Glu-Leu对三种驻留在 内质网中的非膜蛋白是必需的。 转运囊泡介导的胞内运输 转运囊泡介导的胞内运输 对于进入粗面内质网的分泌蛋白，通过 转运囊泡把它们转运到高尔基复合体。 那些被转运到高尔基体囊泡中的蛋白， 其中一部分将继续留在高尔基体中，剩 下的则会被运送到溶酶体及各种囊泡中 。 其中进入分泌囊泡的蛋白经过胞吐 (exocytosis)，即分泌小泡的膜与
9、细胞膜 融合，将蛋白释放到细胞外 转运囊泡介导的胞内运输 这样，各层次的分选保证了每一种蛋白 都能到达其正确的方位。而粗面内质网 的膜和腔、高尔基复合体及分泌囊泡中 ，都含有各自特有的标记酶(resident enzyme)，可以对经过该细胞器的蛋白进 行特定的化学修饰。而且，每一种蛋白 上都带有一个或多个靶信号，用以引导 其到达自己正确的定位。 The secretory pethway of protein synthesis 转运囊泡介导的胞内运输 第一，转运囊泡是如何形成的，某些膜 整合蛋白是如何选择性插入囊泡而其他 蛋白却被排除在外？ 第二，导致特定转运囊泡只结合在特定 种类细胞器膜
10、上的分子机制是什么？ 第三，转运囊泡与靶细胞器膜融合的机 制是什么？ Stage and components of a vesicle shuttle Nature396(1998)543Science272(1996)228. Cell97(1999145Cell92(1998)759 budding targeting fusion 转运囊泡介导的胞内运输 Budding (出芽) Targating(导向定位) Fusion(融合) 转运囊泡介导的胞内运输 Budding (出芽): 两种包被蛋白参与两 类转运囊泡的形成 lclathrin-coated vesicles: 由笼形蛋白
11、 (clathrin)包被的囊泡，形成于plasma membrane和trans-Golgi Network之间。 lCOP-coated vesicles: COP包被蛋白包括 若干种coatmer，其中COP是一种与笼形 蛋白重链相似的蛋白。这些非笼形包被蛋 白包被的囊泡形成于ER与Golgi之间，以 及不同种类的Golgi囊泡之间。 笼形蛋白包被囊泡 的形成 膜整合蛋白选择性编 入笼形蛋白包被囊泡 过程一个的模型。一 些膜蛋白的胞浆结构 域特异性结合在组装 颗粒上。然后，这些 组装颗粒再与笼形蛋 白相结合，并与其一 起自发地聚集到膜的 一个区域。未与组装 颗粒结合的膜蛋白则 被排除在笼
12、形蛋白包 被囊泡之外。 位于纤维原细 胞膜胞浆侧的笼 形蛋白包被凹陷 ，具有笼形蛋白 纤维组成的多面 体网状结构。 The cell was rapidly frozen in liquid helium, freeze-fractured, and then treated by the deep- etching technique. 非笼形蛋白包被囊泡 从cis Golgi形成的过 程(Golgi复合体中囊泡转 运的细节) 当ARF蛋白（在膜结合 酶的作用下）将结合的 GDP换为GTP、其本身结 合到cis Golgi囊泡膜上的 ARF受体上时，囊泡开始 出芽。Coatomer结合在ci
13、s -Golgi囊泡的胞浆侧；它 聚合成纤维性包被可以诱 导囊泡的出芽。脂酰辅酶 A是最终转运囊泡与供体 膜分离时所必需的，但其 功能目前还不知道。 转运囊泡介导的胞内运输 Budding (出芽) Targating(导向定位) Fusion(融合) Subcellular location of Rab proteins in mammalian cells 哺乳动物细胞Rab蛋 白的分离。每一种 Rab蛋白都位于特定 的转运囊泡中，并引 导这些转运囊泡到达 正确的acceptor- organelle. Rab4 Rab5 Rab7 Rab9 Rab3 Rab10 Rab6 Rab1 R
14、ab2 一种小的GTP结合蛋白家族参与转运囊泡的流通 一族GTP结合蛋白参与控制真核细胞中囊泡的流通。这 些Rab蛋白全都含有约200个氨基酸残基，并且具有完全相 似的结构，但是每一种都位于不同的细胞器。纯化的Rab 蛋白可以结合及水解GTP。 胞浆Rab蛋白可以将结合的GDP交换为GTP，并同时发 生构象的变化，结合到刚从供体囊泡上出芽的特定转运囊 泡表面蛋白上。 Rab-GTP复合体可以促进转运囊泡与其正确的受体细胞 器的结合，并起始囊泡的融合过程。一旦囊泡融合发生， 结合在Rab蛋白上的GTP就会水解为GDP，从而引发Rab蛋 白从膜上的释放。释放下来的Rab蛋白与GDP结合，而且 只有
15、当它与另一个刚形成的转运囊泡结合时，才能将GDP 换为GTP，完成一个Rab“循环”。 每一个Rab蛋白都有一个中心结构，其氨基酸序列在所有Rab 蛋白中都很相似，这一区域可以结合GTP并将其水解为GDP。接 近C-端、约35个氨基酸长的片断，是各种Rab蛋白特异性的，它 决定了该种Rab蛋白结合的膜的种类。C-端的半胱氨酸残基，共 价结合到聚异戊二烯脂上，通常是20碳的geranylgeranyl。各种 Rab蛋白N-端的约20个残基也非常不同。 Rab蛋白的通常结构 转运囊泡介导的胞内运输 Budding (出芽) Targating(导向定位) Fusion(融合) 膜融合前转运囊泡与受
16、 体medial-Golgi囊泡的 结合(Golgi复合体中囊泡转 运的细节) 两个膜的吸附是由Rab蛋白起 始的，并且由转运囊泡膜上的 VAMP样蛋白的胞浆结构域与 受体囊泡膜上的syntaxin样蛋 白的胞浆结构域相结合。三种 SNAP蛋白结合到上述复合体 上，并进一步结合NSF。然后 （步骤5，不知在何处发生）， ATP的水解引发了Golgi膜与转 运囊泡膜的融合，同时，NSF 和SNAPs释放到胞浆中。 突触囊泡循 环的最关键 步骤是膜融 合引发的出 胞作用。 Golgi复合体中囊泡转运的细节 cis和medial Golgi囊泡间的转运步 骤是通过对非细胞提取物的研究确 定的。将ci
17、s-Golgi囊泡培育在GTP ，ATP，和coatomer中，ARF（1 ）可以导致非笼形蛋白包被转运囊 泡的形成（2）这些囊泡结合到受 体medial-Golgi囊泡上（3）。非笼 形蛋白包被转运囊泡的去包被（4 ）需要一种胞浆蛋白Rab及GTP水 解为GDP和Pi；实验中若添加不能 水解的GTP类似物，则此步骤被阻 断。囊泡膜与medial-Golgi膜（5） 融合需要ATP的水解和四种胞浆蛋 白：NSF和三种SNAPs（溶解的 NSF结合蛋白）。添加化学物质 NEM（N-ethylmaleimide）可以选 择性阻断这一步骤，因为它可以与 NSF上关键的SH基团发生反应。 转运囊泡介导
18、的胞内运输 Vesicle shuttle Vesicle shuttle Vesicle shuttle 膜脂的合成与运输 膜脂的生成 磷脂在已有细胞膜上结合的酶的催化 下合成，并在合成后直接插入该膜中 。 膜的生成是在已有膜的基础上的延伸 。 上述观点可由实验证明，将细胞暂时暴露在放射性磷酸盐 或放射性标记的脂肪酸或糖中，则可以看到由这些前体物 质合成的放射性磷脂和糖脂全都与细胞内的膜相结合；并 没有游离在胞浆中。由此可知，磷脂是边合成边插入膜中 的。 所有的细胞中，磷脂都是在膜和胞浆的分界面上合成的 。 在动物和植物细胞中，大多数磷脂的合成都是与内质网 相结合的，通常是滑面内质网。催化合
19、成反应的酶，大多 是一端与内质网结合或插入内质网中，而另一端伸入胞浆 中。 多数细胞可以利用乙酸盐合成脂肪酸；而许多动物细胞 则可以从三酰甘油的水解获得脂肪酸。在动物细胞的磷脂 酰乙醇胺合成途径中，其中的一个底物-脂肪酰辅酶A 是一 种lipid-anchored protein，其脂肪酰链埋入内质网膜的胞浆 侧(in the cytosolic leaflet of the ER membrane)，辅酶A部分 则伸向胞浆中(protruding into the cytosol)。其它的底物和 反应产物，如ATP、乙醇胺、CTP等，则都是胞浆中的可 溶性组分。 特定的膜蛋白使磷脂在膜 两侧
20、平衡 新合成的磷脂分布在内质网的胞浆侧，但不久，大多数磷脂 就会如同大部分细胞的膜结构一样，分布到胞浆和非胞浆两 侧。在大多数膜中，一个磷脂分子从膜的一侧移动到另一侧 (翻转, flip-flop)至少需要几个小时。那么新合成的磷脂是如 何快速地从内质网的胞浆侧移动到非胞浆侧的呢? 这是由于在内质网膜上(及细菌的细胞膜)含有一种或几种蛋 白，叫做翻转酶(flippase)蛋白，可以催化磷脂的翻转过程。 这种翻转过程的半衰期(half-time)，即一半新合成的磷脂移 动到内质网的非胞浆侧所需要的时间，只有几分钟。 红细胞膜含有少量的、不同种类的翻转酶，可以催化磷脂从 膜一侧向另一侧翻转 pho
21、spholipid flippase 磷脂翻转酶的检验 磷脂二丁基磷脂酰胆碱 是水溶性的，因为它含有短 的、四碳脂肪酸链。当向纯 磷脂囊泡悬浮液中添加这种 磷脂时，这些磷脂会自发插 入到囊泡的外层，但由于脂 质体中缺少翻转酶，这些磷 脂无法翻转到内层。实验证 明，当加入一种翻转酶之后 ，添加在囊泡外侧的二丁基 磷脂酰胆碱就可以翻转到膜 内层。在膜内层，这种磷脂 就可自发的运动到囊泡腔中 。 磷脂二丁基磷脂酰胆碱 (Dibutyrylphosphatidylcholine) 特定的膜蛋白使磷脂在膜 两侧平衡 膜的两侧常含有不同的磷脂组成。这种 脂类分布的不对称性是如何达到的，目 前还不清楚！ l
22、其产生也可能部分受到磷脂对翻转酶蛋白的 不同亲和性， l或者整合膜蛋白在膜两侧特定区域的不均衡 分布的影响。 膜脂的运输 胞内和胞间的囊泡运输 磷脂交换蛋白的参与 膜脂的运输 胞内和胞间的囊泡运输 细胞内转运囊泡(vesicle shuttle)从内质网膜上出芽、离开 ，并与高尔基复合体的膜融合；然后另一种囊泡再从高尔 基复合体出芽，与其它的细胞器融合。这种反复的出芽- 融合就完成了磷脂的转运。 各种磷脂可以选择性的插入不同的转运囊泡，因此不同的 细胞器有不同的磷脂组成。在动物细胞中，糖脂末端的糖 链如半乳糖、N-乙酰神经氨酸(唾液酸)的添加是在高尔基 复合体中进行的。因此这种新合成的糖脂只存
23、在于高尔基 体膜的非胞浆侧(内腔侧)。合成后，糖脂经过转运囊泡 可能与运送新合成的分泌蛋白和膜整合蛋白相同的囊泡- 运送到细胞膜上。 The endosomal origin of exosomes 一种胞间囊泡运 输 Nature Reviews 4(2001)213 C) Argosomes. GPIanchored green fluorescent protein (GFP)GPI (green star, red tag) in the outer-membrane leaflet and geranylgeranyl-anchored cyan fluorescent protei
24、n (CFP)Rho (geranylgeranyl, blue) in the inner leaflet are incorporated into the argosome membrane (orange), whereas myristoylanchored GFP (GFPMyr) in the inner leaflet of the membrane is not. Da) The exosomal origin of argosomes. In the donor cells, argosomal membrane is endocytosed (1) and targete
25、d to endosomes (2); invagination of argosomal membrane in the endosomes gives rise to multivesicular bodies (MVBs) (3). The outer membrane of MVBs fuses to the plasma membrane (4), which releases the internal vesicles, exosomes or argosomes (5). Exosomes fuse with the plasma membrane (6) or they are
26、 endocytosed by receiving cells (7). They are then internalized, form MVBs (8), and can be released again. 膜脂的运输 磷脂交换蛋白的参与 磷脂交换蛋白(phospholipid exchange proteins),一种水溶 性蛋白，也参与了磷脂的交换。它可以将磷脂从一个细胞 器膜(如内质网)的胞浆侧分离出来然后再将其释放到另一 个细胞器膜的胞浆侧。在所有种类的真核细胞中都可以找 到这种交换蛋白。每一类交换蛋白只能结合一种磷脂。 这些磷脂交换蛋白还可以使某些磷脂在特定的细胞器膜上 富集。
27、例如，在酵母细胞中，有一种特定的交换蛋白，为 了适应高尔基体膜的功能，高速地将其膜上的磷脂酰肌醇 交换为磷脂酰胆碱。当酵母细胞发生突变，使此交换蛋白 失活时，就会得到含有非正常磷脂组成的、有缺陷的高尔 基体膜。 磷脂交换蛋白的作用 这种蛋白可以催化特 定的磷脂，在不同膜 的胞浆侧间进行交换 ，但它不能催化非胞 浆侧的交换。 线粒体和叶绿体线粒体和叶绿体，可以自己合成一些特有 的膜脂，同时也从胞浆转运进其它的膜脂。 其中，一些磷脂是在内质网上合成的，如磷 脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱，然后它们也象插 入细胞膜和高尔基体膜一样，插入线粒体膜 。此过程中没有囊泡从内质网出芽与线粒体 融合，所以这些磷脂都是通过磷脂交换蛋白 的作用，从内质网转运到线粒体的。 某些磷脂，如心磷脂，只存在于线粒体内 膜上；它是利用转运进来的前体物质，在线 粒体内膜的基质侧合成的。 登顶成功，可惜神仙都被一脸幸 福地俺们吓跑了。 膜分子生物学 游击队