生物电子显微术第一章.ppt

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1、 生物电子显微术 河北农业大学生命学院 *1 生物电子显微术 1 绪论 l基本概念 lEM发展史 lEM分类及特点 l电镜技术的应用 l各种显微镜性能与特点的比较 2 电子显微镜的基本知识 lTEM的结构和原理 lSEM的结构和原理 2019/2/282 3 超薄切片技术 l基本概念 l普通超薄切片技术 4 负染色技术 5 金属投影和复型技术 l金属投影技术 l复型技术 6 EM冷冻制样技术 l概述 l冷冻超薄切片技术 l冷冻断裂(蚀刻)及复型技术 l冷冻安全规则 Date3 7 SEM的样品制备技术 l 概述 lSEM电镜的样品制备 l特殊样品的制备 8 电镜的应用(个案分析） l花粉表面形

2、态的SEM观察 l熏蒸固定真菌的SEM观察 l样品包埋块的制作 l扫描电镜观察石蜡切片观察法 l植物原生质体超薄切片的制作 l真菌菌丝及孢子的包埋 Date4 9 X-ray显微分析 lX-ray微区分析的基本原理 lX-ray显微分析仪工作的基本原理 lX-ray显微分析的方法及应用 10 其他显微技术 l扫描隧道显微镜 l原子力显微镜 l激光扫描共焦显微镜 l扫描电-声显微镜 Date5 生物电子显微术 l课时安排 l讲授：30学时 l实验：10学时 l主要内容： l电镜的原理、结构（TEM，SEM ） l电镜的样品制备技术 1) 超薄切片技术 4) 金属投影及复型技术 2) 负染色技术

3、5) SEM制样技术 3) 冷冻制样技术 6) 其他制样技术 l应用举例 Date6 主要参考文献 生物电子显微术 张景强 中山大学出 版 实用生物电子显微术 林钧安 辽宁科技出 版 生物电子显微术教程 陈力 北师大出 版 电子显微镜与电子光学 黄兰友 科学出 版 生物医学电子显微技术 程时 北医、协 和 生物学工作者实用生物电子显微术 英 G 1976 参考文献1，2，3图书馆均有 Date7 第一章 绪论 1.1基本概念 1. 电子显微镜：简称电镜 利用电子束作为照明源，电磁透镜聚 焦成像，并结合特定的机械装置，应用现 代电子技术、高真空技术而制成的一种精 密电子光学仪器。 TEM：Tra

4、nsmission Electron Microscope SEM： Scanning Electron Microscope Date8 2电子显微术： 以电子显微镜为工具，对物质（样品）进行 物理、化学、成分、超微结构等方面研究的一种 技术。 电子显微术定义: 电子显微学是凝聚态物理、材料科学、乃至生 命科学的交叉学科，是物质科学研究的一个重要 组成部分。它是以电子显微学等方法, 在原子尺度 上对物质的微观结构进行研究分析, 从而促进了新 物质、新结构、新性能、新现象的发现，极大地 推动了新材料、新器件的发展。 Date9 3超微结构： 指一般光学显微镜不能分辨的细微形态结构（亚显 微 结

5、构），直至生物大分子结构（蛋白质、核酸、多 糖、 脂类）。 4电子显微方法：Electron Microscopy 指利用电子与固体样品作用时所发出的信息，对样 品 进行微区观察和分析的一种方法。 1mm=103 m 1m=103nm 1nm=10 1 =10-10m Date10 1.2 电子显微镜的发展概况 l光学显微镜的发展(LM: light microscope) l光镜的诞生 l人眼分辨率：人肉眼能分辨清楚的两 点之间的最短距离用“”表示 l13世纪玻璃的发明 制造眼镜、放大 镜 l16世纪 欧洲放大镜=0.01 M=330倍 l1590年 荷兰眼镜商Hans之子- Janssen

6、装配具有划时代意义的“显微镜” l1665年 英国物理学家Robert Hook( 虎克) 第一台光学显微镜 l1675年 荷兰Leeuwen.Hook(列文.贺 克 M=270倍, 共研制247台光镜 l高倍率的光镜 l18世纪到19世纪中叶 英、法、意相 继研制消色差显微镜 M=15002000 人的视力提高了1000 多倍 0.2 m Date11 3. 光镜的局限性 l1878年 德.理论光学家 E.Abbe 提出 光镜的最优分辨率 opt=0.4*光 l波的反射 水波 障碍物:石块产生的影子 芦苇杆 Date12 表1-1 电磁波各光谱区的一些参数及相应的结构 分析方法 Date13

7、 l可见光波长 40008000 opt=0.4*光 l 紫外线波长 =3900130 紫外线显微镜opt=1000 lX-ray =1000.5 但无法偏 转不能成像 l目前,光镜最好分辨率 opt=0.160.32 m l结论: 利用波长的更短光线做照明光源, 可提高分辨率。 （OR：波长越短，分辨率越高） 电子波波长很短 易于成像，从而导致 电镜的产生和发展 Date14 l电镜的发展 q国外情况 电镜产生的三大理论基础 Thomson（1897）证明电子 的存在 L.de.Broglie(德.1923)提出微 观粒子的波粒二 相 性 H.Busch(德.1926)建立几何 电子光学理论

8、 电子的存在 19世纪50年代 德.波恩 Geissler Date15 l1858年,Pluker(德.波恩物 理学家),发现阴极射线 l1881年,Hertz(赫兹)只认识 到阴极射线具有波动性 l1897年, Thomson证明阴 极射线是带电粒子 l其荷质比为1011C/Kg l波粒二相性 法国. L.de.Broglie提出: 一个动量为P,能量为E的自由 运动的电子,相当于波长为 =h/p,频率为V=E/h, 并沿着粒子运动方向传播的平面波. 电子束既有粒子性,也有波动 性。 Date16 l几何电子光学理论 电子光学：指研究和利用电 子流的偏转、聚焦、 成像规律的一门 学科。 1

9、925年，柏林工学院M.knoll 和 A.Matthias尝试做聚焦的电子束透镜 1926年， H.Busch 带有铁轭 的短磁透镜聚焦理论 D.gabor(M.knoll 的学生）包壳 透镜(1948年提出全息技术 全息技术之父并获诺贝尔 奖) 1928-1929, Ernst.Ruska 极靴 磁透镜,现代磁透镜 l透射电镜的诞生 l1932年， M.Knoll 和他的学生 E.Ruska发明了电镜 ,放大倍数16倍;改进后75Kv, 1.2万 倍 l1939年,西门子制造第一台商品 透射电镜 l1940年,Helmut.Ruska,研究噬菌 体,建立第一个开放实验室 l1986年Ern

10、st.Ruska和 Gerd.Binnig、Heinirich.Rothrer获得诺贝尔物理奖 Date17 l扫描电镜的诞生 1935年， M.knoll 设计第一台SEM 1956年，二次电子探测器出现 1956年， SEM商品化 q国内情况 q校外状况 vTEM q1953年，长春光机所第一台 XD- 100型 100kv TEM q1965年，中科院科仪厂 DX-2型 TEM 100kv 5 q1970年，上海新跃仪表厂 DXB1_12型TEM 40万 q1977年，上海新跃 DXB2_12型 TEM 80万 2 vSEM v1975年，中科院科仪厂 第一台 SEM DX-3 100

11、DX-5 60 v1980年，中科仪 KYKY-1000B v1993年，中科仪 KYKY-2000 KYKY-2800 KYKY-2800B KYKY- 3800 Date18 vSTM (scanning tunneling microscope) v1987年，中科仪、中科院化学所 白春礼等研制 第一台STM SSX-1型 国产电镜的缺点： 制造工艺粗燥、自动化程度低、清洁度差 q我校情况 q1980s DX-2型TEM q1996年， KYKY-2800型数字 式扫描电镜 q分辨率6nm，放大倍数10万 Date19 1.3 EM分类及特点 l透射电镜（TEM） l原理：利用TE，整幅

12、像同时成立 ，在荧光板上成象 l特点： l样品超薄 h500kv为超高压电镜， Hvmax=3MV 其特点： 穿透能力强、可观察较厚的样品 m 级 l分辨率高，2 （晶格分辨率） l单色性好，色差小，成像质量好 l辐射损伤小 l体积庞大、结构复杂、价格昂贵 、需专用的防护装置 l观察对象：主要非生物材料的晶 格结构、观察细胞骨架 系统（微梁、微 丝） Date22 l分析电镜（AEM:analysis electron electron microscope ) 连续X-ray 背底扣除 能量：Z 特征X- ray的能量 特征X-ray 波长： Z 特征X- ray的波长 l波谱仪（WDS）

13、Wavelength-disperse spectrometer 微区定量分析，4Be 92U 慢 2060分，灵敏度高 l能谱仪（EDS） Energy- disperse spectrometer 微区定性分析，11Na 92U 快 23分，灵敏度低 Date23 l低压扫描电镜（LVSEM:low voltage） HV=1Kv，可观察绝缘物质、生物 样品 试样不易发生充放电效应 l生物分析电镜（BATEM:biologic analysis ） TEM+EDS（or：WDS） 分辨率高 =1.5 、分析性能好 l扫描隧道显微镜（STM:scanning tunneling micros

14、cope） l M=1000万倍，水平1 ， 垂直0.1 l可进行“活体”观察、可在大气、液体环 境下直接观察物质表面特征 l 只能观察导体和半导体的表面结构、 非导电的物质需要覆盖一层导电薄膜 l STM主要用于研究表面科学、半导体 材料、生命科学 Date24 优点： 可在真空、大气、常温等不同环境下工作，甚至可将样 品浸在水和其它溶液中，不需要特别的制样技术，并且探测 过程对样品无损伤。这些特点适用于研究生物样品和在不同 试验条件下对样品表面的评价，例如对于多相催化机理、超 导机制、电化学反应过程中电极表面变化的监测等。 STM在生物领域的应用： STM在生物和有机材料一领域有着广泛的应

15、用前景。尽 管目前还存在着如何解释生物样品的STM图象、如何更好地 制备生物样品以及选择合适衬底以沉积生物分子等问题，但 实际应用中已取得了不少好结果。例如在真空、大气和溶液 条件下的DNA研究，球蛋白、胶原蛋白及红血球的研究等。 STM在纳米科技中的应用： STM不仅能够对样品表面进行成像，而且还能在纳米尺 度上对材料表面进行刻蚀与修饰。由微观到宏观，即直接操 纵单个原子和分子，对它们进行排列组合，以形成新的物质 ，或制造出一定功能的机器这是实现纳米加工的新思想， STM的出现使这一思想变为现实。自从STM问世以来，STM 作为一种纳米加工的工具的研究已涉及到表面直接刻写、电 子束诱导沉积以

16、及单原子操纵等方面，并取得了一批高水平 的研究结果。 Date25 硅111面7 7原子重构象 硅片是大家熟悉的制作晶体管和大规模集成电路的半导体材料 ，为了得到表面清洁的单质材料，要对硅片进行高温加热和退火处 理，在加热和退火处理的过程中硅表面的原子进行重新组合，结构 发生较大变化，这就是所谓的重构。 Date26 液体中观察原子图象 下图所示的是在电解液中得到的硫酸根离子吸附在铜单 晶(111)表面的STM图象。图中硫酸根离子吸附状态的一级 和二级结构清晰可见。 Date27 1990年，IBM公司的科学家展示了一项令世 人瞠目结舌的成果，他们在金属镍表面用35个惰 性气体氙原子组成“IB

17、M”三个英文字母。 Date28 科学家把碳60分子每十个一组放在铜的表面组 成了世界上最小的算盘。与普通算盘不同的是，算 珠不是用细杆穿起来，而是沿着铜表面的原子台阶 排列的. Date29 这是中国科学院化学所的科技人员利用纳米 加工技术在石墨表面通过搬迁碳原子而绘制出的 世界上最小的中国地图。 Date30 DNA分子拉成的DNA图象 Date31 l原子力显微镜（AFM：atomic force microscope) l导电样品、非导电样品均可观察 l分辨率达到原子水平 l 可以在真空、超高真空、电化学环境 、常温低温条件下工作 l 应用于表面科学、生命科学、材料科 学 注：以STM

18、、AFM为基础，衍生出扫描探 针显微镜（SPM ：Scanning probe microscope ）：如 激光力显微镜（LFM）、扫描电化学显微镜（ SECM） Date32 l环境扫描电镜（ESEM） l特点： 多种真空状态：高、低、超低真 空 1Torr=1mmHg柱压力 =1/760大气压=133.3Pa 粗真空： 76010乇 低真空： 1010-3乇 高真空：10- 310-8乇 超高真空 ：10-8乇以下 多种真空条件下可得SE像 、BE像，且 =4nm 样品室可充气体:水气、氮气 动态分析：样品温度从-185 1000 制样简单：样品无须镀膜、脱水 干燥 真正的“环境”条件，

19、可直接观察 含水、含油样品 缺点： 造价太高 $30万 Philips 低气压空间 Date33 1.4 电镜技术的应用 l生物科学方面： l细胞生物学 l分子生物学 l动物学和植物学 l微生物学 l医学科学 l基础医学 l临床医学 l农林畜牧科学 l植物保护 l良种繁育（遗传育种） l土壤改良与成分分析 l动植物疾病的快速诊断与防治 Date34 材料科学 l机械部件的疲劳、失效分析 l金属金相学 l建筑材料分析 其他方面： 矿产、地质与考古、海关、造纸、电池 生 产、 物理学与化学、环境保护 Date35 1.5 各种显微镜性能与特点的比较 种类LMTEMSEM 照明源可见光电子束电子束

20、透 镜玻璃透镜电子透镜电子透镜 最高 分辨率 0.10.2m （紫外显微镜） 12 （晶格） 3 （点） 430100 放大倍率1200010080万720万 焦点深度浅(500倍时 2 m ) 中(500倍时 500m ) 深(500倍时 1000m ) 特征 表一 Date36 种类LMTEMSEM 视场100mm(1)2mm(100)10mm(10) 图象色彩有无无 显相方式直接观察荧光屏显象管 样品种类切片、涂片切片、复型膜 ,涂片 各种实体 样品厚度厚（数微米）极薄1000 不限 样品环境空气真空真空 续表一 特征 Date37 树立正确的人类认识观 lDM机体器官解剖水平（宏观）

21、lLM 细胞细胞水平（微观） lEM 亚细胞分子结构分子水平（超微观 ） EM的发展趋势 l一般形态定量定性 lX-ray 分析 l电子衍射 l俄歇电子能谱 l能量分散谱仪 l二维平面三维立体图象重组 l静态描述动态观察 lEM+计算机信息处理 Date38 思考题 l电镜和光镜有何异同？ l你知道有那几类电镜？试简述各自特点 及其用途。 l电镜中，可否用X-ray取代电子光源？ 试分析其原因。 Date39 Date40 Date41 Date42 Date43 Date44 Date45 Date46 Date47 Date48 Date49 Date50 Date51 Date52 Date53 Date54 Date55 Date56 Date57 Date58 Date59 Date60 Date61 Date62 Date63 Date64 Date65 Date66 Date67 Date68 Date69 Date70 Date71 Date72 Date73 Date74 Date75 Date76 Date77 Date78 Date79 Date80