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1、氧化葡萄糖酸杆菌Gluconobacter oxydans,裴承强,1. 氧化葡萄糖酸杆菌简介 2. 1,3-二羟丙酮的代谢途径及相关酶类 3. 气升式生物反应器发酵生产二羟丙酮 4. 氧化葡萄糖酸杆菌膜结合乙醇脱氢酶的应用和性质 5. 代谢工程技术在微生物产DHA 中的应用,简介 氧化葡萄糖酸杆菌，是一种专性好氧的革兰氏阴性菌属于醋酸杆菌科，对人和其它动物无病原性，但可引起水果的细菌性腐烂和褐变。该菌种含有多种酶类能不完全氧化有机物，产生多种重要化合物，这使得氧化葡萄糖酸杆菌在工业应用中占有一席之地。其酶类主要有两大类：第一种是颗粒酶，结合在细胞膜上，如D-葡萄糖脱氢酶、甘油脱氢酶、D-山梨
2、醇脱氢酶等，这些酶为黄素蛋白类或者细胞色素；第二种存在于胞质中，催化胞内碳水化合物的代谢。,1,3-二羟丙酮（DHA）的代谢途径和参与酶 G. oxydans 代谢甘油产生DHA 主要有两条氧化途径： （1）不需要ATP和辅酶因子NAD+，甘油可被细胞膜上的甘油脱氢酶一步直接氧化成DHA，电子传递链与ADP 氧化磷酸化形成ATP 的过程相耦合，当细胞中糖酵解途径及三羧酸循环途径缺乏时，这条途径可为细胞生长及其他代谢过程提供所需的能量； （2）甘油进入细胞后，在细胞质中甘油脱氢酶的作用下生成DHA，然后在二羟丙酮激酶作用下转变为磷酸二羟丙酮 (DHAP)，或者甘油在磷酸激酶作用下磷酸化成甘油-3
3、- 磷酸(Glycerol-3-P)，然后经细胞质内甘油-3-磷酸脱氢酶作用转变成DHAP，再进入磷酸戊糖循环途径，这一过程需要ATP，也需要辅酶因子NAD+。,微生物中的甘油脱氢酶 (Glycerol dehydrogenase，GDH) 按照其依赖辅酶的情况可划分为3 种类型： （1）依赖NAD+的GDH (EC1.1.1.6)，主要存在于细胞质中，它将甘油转化为DHA 后，DHA 进一步磷酸化，进入糖酵解和三羧酸循环途径，为微生物生长提供能量； （2）GDH (EC1.1.1.72 、EC1.1.1.156) 需要以NADP+作为辅酶因子，这类GDH 大多存在于霉菌和动物组织中，可将甘油
4、氧化为DHA 或甘油醛； （3）GDH(EC1.1.99.22) 既不依赖NAD+、也不依赖NADP+，主要存在于葡萄糖酸杆菌属 (氧化葡萄糖酸杆菌、弱氧化葡萄糖酸杆菌等) 的细胞膜上。,气升式生物反应器发酵生产二羟丙酮,气升式反应器不需机械搅拌，而是利用两个区域间流体静压力的不同来使液相循环。其优势是高位液体循环，高效热量传递，低剪切力，低能量损耗，低维护费用。 获得具有高活性甘油脱氢酶的静息细胞优化培养基的成分：5.6g/L酵母浸出液，4.7g/L甘油，42.1g/L甘露醇，0.5g/L K2HPO4 ，0.5g/L KH2PO4 ，0.1g/L MgSO4.7H2O , 2.0g/L C
5、aCO3 , pH 4.9。,膜结合乙醇脱氢酶的应用和性质,应用：乙醇脱氢酶可参与全细胞催化1,2- 丙二醇生成D- 乳酸 性质：此酶由两个亚基组成，其表观相对分子质量分别为80000 和50000。其催化条件及特性：最适反应温度是30，最适pH 值在5.56.0 之间，该酶能催化短碳链的一元、二元醇，随着碳链长度的增加，催化活性减小。大多数金属离子及抑制剂(Cu2+、Fe3+、Ca2+、EDTA 等)对此酶都有抑制作用。,代谢工程技术在微生物产DHA 中的应用,国内外学者将代谢工程技术应用于微生物生产DHA 的研究工作主要包括两个关键方面： （1）过量表达甘油脱氢酶基因，改善微生物细胞已有的
6、代谢网络。分别利用强启动子tufB 和gdh 使G. oxydans 膜系脱氢酶sldAB 基因过量表达，不但提高了菌体生长的密度，还明显提高了DHA 浓度和转化率。 （2）将甘油脱氢酶基因在模式宿主菌中表达，构建新的代谢途径或拓宽菌株的底物利用范围。,针对目标产物的不同，我们可以对菌株进行改造，以达到我们想要的结果。 如：获得高产量的二羟丙酮，就可以设计乙醇脱氢酶缺陷突变株，使得甘油脱氢酶超表达。重建载体的主要过程:（1）设计寡核苷酸引物（2）获得GDH基因（3）PCR GDH基因（4）酶切PCR合成片段（5）由T4DNA连接酶连接酶切片段到pBBR1 MCS-5载体上获得重组载体（6）重组载体转化到E.coli DH5中（7）转化子在含有10g/mL的庆大霉素LB琼脂平板培养基上筛选。,谢谢欣赏,