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1、第十章 甾体激素类药物的分析 Analysis of steroid hormones,激素（Hormone，荷尔蒙） 是人体内各种内分泌腺所分泌的一种生物活性物质。激素作用于特定的称为靶器官的组织、细胞上而发挥作用。如果激素分泌出现平衡失调，可使人体发生病变，如甲亢、糖尿病等。,A,B,C,D,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,基本结构,概 述,甾体激素类药物均具有环戊烷骈多氢菲母核。,分类,甾体激素,肾上腺皮质激素,性激素,雄性激素,孕激素,雌激素,蛋白同化激素,（一）肾上腺皮质激素,43酮基 （紫外吸收）,天然皮质激素：氢化可
2、的松,母核有21个碳原子,C17醇酮基 （还原性）,醋酸地塞米松,结构修饰,曲安息龙,地塞米松磷酸钠,提高结构稳定性 增强抗炎作用,（二）雄性激素和蛋白同化激素,天然雄性激素：睾酮,43酮基,4位引入卤素或19位去甲基或将A环结构改造 均明显降低雄性作用，增加蛋白同化作用,母核有19个碳原子,A环中有43酮基结构,结构修饰,增加脂溶性，制成油注射剂 可口服、延效,丙酸睾酮,甲睾酮,增加位阻，难代谢氧化，稳定性增强 可口服,蛋白同化激素,苯丙酸诺龙,4-氯醋酸睾丸素,母核有18或19个碳原子,（三）孕激素,C17-甲酮基,43酮基,天然孕激素：黄体酮,母核有21个碳原子,口服被迅速破坏失效，只能
3、肌注,结构修饰,醋酸甲地孕酮（孕酮类孕激素）,炔诺孕酮（睾酮类孕激素）,炔诺酮（睾酮类孕激素）,口服、长效,口服、长效，17-OH作成庚酸酯，注射一次可维持3个月,（四）雌激素,天然的雌性激素：雌二醇,母核有18个碳原子,A环为苯环，C3位上有酚羟基，C17位上有-羟基,结构不稳定，口服无效,结构修饰,炔雌醇,戊酸雌二醇,苯甲酸雌二醇,乙炔基引入，使仲醇变叔醇，增加空间位阻，阻碍酶对药物的氧化代谢，可口服,17位羟基酯化，酯在体内缓慢水解，延效,3位羟基酯化，酯在体内缓慢水解，延效,可口服 高效 长效,人工合成代用品：非甾体化合物,己烯雌二酚,高效、长效,二、特殊官能团与分析方法,第二节 鉴别
4、试验,一、物理常数的测定,二、化学鉴别法,三、制备衍生物测定熔点,四、紫外分光光度法 五、红外分光光度 六、薄层色谱法 七、高效液相色谱法,第二节 鉴别试验,二、化学鉴别法 （一）呈色反应,（1）与强酸的呈色反应,强酸： H2SO4、H3PO4、HClO4、HCl,原理：酮基先质子化，形成正碳离子，再与HSO4-作用呈色。,与硫酸显色反应,1、C3酮基和C20酮基,（1）与羰基试剂2,4-二硝基苯肼、异烟肼、硫酸苯肼反应生成腙。,(2)官能团的呈色反应,（2）与羟胺或氨基脲分别生成具有一定熔点的肟或缩氨脲。,+,HCl,黄色,3，20-双腙,室温下长时间加热,结论：,成腙反应中,C20酮基受C
5、18甲基的空间位阻影响，反应较慢，需加热或较长时间放置，才完成反应。,C11酮基受C18、C19位甲基甲基的阻碍，不发生反应。,C3酮基空间位阻最小，最易起反应，室温下先生成单腙。,2、C17醇酮基的呈色反应（还原性）,能与碱性酒石酸铜试液（斐林试液）、氨制AgNO3试液（多伦试液）、四氮唑盐反应呈色。其中以四氮唑盐的显色反应最为常用，不但可用作层析法的显色剂，还可用于含量测定.,适用：肾上腺皮质激素。, 2Cu2+ + 4OH-,+ Cu2O + H2O,橙红色, 2Ag+ + 2OH-,+2Ag + CH3COOH,黑色,醋酸去氧皮质酮,+,H2O,+ CH3COOH,+,+,OH-,醋酸
6、泼尼松,深红色的三苯甲鐕,四氮唑盐,结论：,三苯甲鐕于490nm处显示最大吸收，可用比色法测含量。,四氮唑盐反应还用于肾上腺皮质激素类药物中杂质“有关物质”检查的显色剂。,反应在碱性条件下（水解）进行。,适用：具有甲酮基或活泼亚甲基的甾体激素类药物。,3.甲酮基的呈色反应,能与亚硝基铁氰化钠、间二硝基酚、芳香醛反应呈色。,孕激素,（1）甲酮基：,黄体酮专属性反应。,黄体酮,其他甾体,亚硝基铁氰化钠,蓝紫色,淡橙色或不显色,结论：,在碱性条件下进行。,与亚硝基铁氰化钠反应称为碱性硝普钠反应。,（2）亚甲基的反应：,硫酸普拉睾酮,乙醇 间二硝基苯,氢氧化钠,紫红色,适用：雌激素类药物。,4.酚羟基
7、的呈色反应,能与重氮苯磺酸发生偶合反应，生成红色偶氮染料。,苯甲酸雌二醇,H+,+,红色,有机氟,F,有机破坏,有机氯,5、卤元素的呈色反应,茜素氟蓝硝酸亚铈,硝酸硝酸银,呈蓝紫色,Cl,AgCl,氯原子结合在母核环上,6、沉淀反应,（1）与碱性酒石酸铜（斐林试液）的沉淀反应,（2）氨制AgNO3（多伦试液）的沉淀反应,（3）与AgNO3的沉淀反应,适用：含炔基的甾体激素类药物（炔雌醇、炔诺酮）。,机理：,HNO3,+,+,NaOH滴定，电位法指示终点,（4）与HNO3-AgNO3的沉淀反应,适用：甾体激素类药物C21位上有氯原子取代，如丙酸氯倍他索。,机理：,有机氯原子,水解 加热,无机氯原
8、子,结合在母核 环上的氯原子,氧瓶燃烧法 破坏,无机氯原子,硝酸硝酸银,AgCl,原理：一些甾体激素类药物具有醋酸酯、戊酸酯及已酸酯的结构，可先行水解，根据水解产物来鉴别。,7、水解产物的反应,适用： 本类药物C3、C17或C21位上羟基的酯,结果： 醋酸酯水解后生成的醋酸可与乙醇反应，生成有香气醋酸乙酯。,戊酸或己酸酯类水解后可生成有特臭的戊酸或己酸，进行鉴别。,三、制备衍生物测熔点,（二）酯的水解,醇制KOH 水解,m.p.为150 156,（一）酯的生成,+ KOH,丙酸睾丸素,睾丸素,m.p.为201,+,m.p.约182（分解）,（三）缩氨基脲的生成,苯丙酸诺龙,苯丙酸诺龙缩氨脲,H
9、2NCONHNH2,（四）酮肟的生成,炔诺酮,HONH2,炔诺酮肟,m.p.约195（分解）,醋酸泼尼松,-3-酮,（五）UV-ViS分光光度法,240nm左右,280nm左右,苯环,其他共轭结构,原 理,200-760nm有特征吸收。,方 法,可规定最大吸收波长、A、吸收系数、A大/A小。,示 例,结构特征： 酚羟基 C17 OH C17 乙炔基,eg1:炔雌醇,（六）IR法,原料药,1505cm-1,3505cm-1,3300cm-1,1590cm-1,3610cm-1,酚羟基,醇羟基,1615cm-1,苯环的骨架振动,eg2：黄体酮,-3-酮,结构特征：,C17-酮基,1700cm-1,
10、C=O,20位酮基,1665cm-1,3位酮基,1615cm-1,870cm-1,C-H,双键,第三节 特殊杂质检查,杂质来源：原料、中间体、异构体、降解产物以及试剂和溶剂。,一、有关物质的检查,其他甾体：有些杂质与该甾体激素药物结构类似，也具有一定的药理作用而又互不相同，因此在甾体激素类药物的质量控制中，“其他甾体”的限度检查显得很重要。,检查方法：（具有一定分离能力）,判定方法：规定杂质斑点数目 规定杂质斑点颜色,1、TLC法（自身对照法）,eg：氢化可的松中其他甾体的检查 供试液：本品+氯仿-甲醇（9：1） 浓度：3.0mg/ml 对照液：供试液（3.0mg/ml）+氯仿-甲醇（9：1）
11、 60g/ml 层析：供试液 对照液 点样、展开、斑点检出。 判断：供试液如显杂质斑点，不得多于3个，其颜色与对照液的主斑点比较，不得更深。,2、HPLC法（自身对照法）,图A中峰1面积的四分之三,判定方法： 规定杂质峰数目 规定杂质峰面积,二、游离磷酸盐的检查,方法：对照品比色法,杂质来源：地塞米松磷酸钠生产过程中，由磷酸酯化时残存的过量磷酸盐。,结果判断：供试品溶液的吸光度不得大于对照溶液的吸光度。,740nm,原理：供试液+钼酸铵+1-氨基-2-萘酚-4-磺酸 钼蓝,三、有机溶剂残留量的检查,eg：地塞米松磷酸钠,方法：GC色谱法,杂质来源：地塞米松磷酸钠生产中，使用大量甲醇和丙酮。,结
12、果判断：不得出现甲醇峰，甲醇含量0.3 丙酮规定不得过5.0%,四、硒的检查,氧瓶燃烧,二氨基萘比色法测定,杂质来源：地塞米松、氟轻松和曲安奈得等甾体激素类药物，在生产中使用二氧化硒(SeO2)脱氢工艺，药物可能引入杂质硒。,方法：药物,结果判断：供试品溶液的吸光度不得大于硒对照溶液的吸光度（0.0050.01） 。,378nm,五、雌酮,六、乙炔基,第四节 含量测定,常用方法,容量法,比色法,紫外分光光度法,荧光法,气相色谱法,高效液相色谱,四氮唑盐比色法,异烟肼比色法,铁-酚试剂比色法,USP、BP、JP均采用,方法：RPHPLC（内标法）,测定对象：甾体激素类药物的原料和制剂。,eg：黄
13、体酮的含量测定 色谱条件：固定相 ODS，检测波长254nm 流动相 甲醇-水（65:35） 内标物 己烯雌酚 系统适用性试验：n1000，R符合规定。,测定样品：黄体酮原料、注射液。 定量方法：内标法 内标-1,二、UV-ViS分光光度法,1、-3-酮 240nm（）,2、苯环 280nm（） 雌激素,肾上腺皮质激素 雄性激素和蛋白同化激素 孕激素,（一）UV分光光度法,缺点：专属性不强,示例：醋酸地塞米松片的含量均匀度检查 （1）配制供试液，取10片分别进行测定 （2）测定：240nm （3）计算,（二） 比色法,1、 四氮唑盐比色法,（1）原理：肾上腺皮质激素类C17-醇酮基强还原性。,
14、H,三苯甲瓒深红,蓝四氮唑（BT） 525 nm,（2）方法：对照品法,（3）影响因素,A. 基团对反应速度的影响,C11= OC11OH,C21OH未酯化C21-OH酯化,B、溶剂和水分的影响,以无水乙醇为溶剂，水含量大时，呈色减慢，不超过5对结果没有影响。,C、O2与光线的影响,避光、隔绝空气、快速、充N2,D、碱的种类及加入顺序,以氢氧化四甲基铵的结果最佳,加入顺序：皮质激素溶液,四氮唑盐,碱试液,E. 温度与时间,室温（25）反应4045 min,F. 干扰物的影响,油膏、冷霜等制剂含聚乙二醇、丙二醇、羊毛脂对BT的显色反应有干扰，要先分离后测定。,（1） 原理,异烟腙（黄）,HCl,
15、420nm,2、异烟肼比色法,C3-酮基+异烟肼,H2O,肾上腺皮质激素 雄性激素 蛋白同化激素 孕激素,（2）方法：对照品法,（3）影响因素,A.反应速度（反应专属性）,C3=OC17= O 、C20= O C11= O 不反应,B. 溶剂的选择,异烟肼盐酸盐受溶解度的影响,无水甲醇 无水乙醇,对试剂的稳定性好 呈色强度较无水乙醇中高 对植物油的溶解度小,C.水分、温度、O2与光线的影响,含水量腙水解A%,O2与光线对反应的影响不大,t ,D.酸的种类和浓度及异烟肼的浓度,酸:异烟肼 = 2:1,盐酸浓度0.0074mol/L,最大A,异烟肼浓度0.00365mol/L,（1）原理,max=
16、515,雌二醇-3-甲醚,max=465,max=515,(NH4)2Fe(SO4)2 + H2SO4 + H2O2 + 苯酚,铁酚试剂 Iron-phenol Reagent,铁盐的作用 加快黄色产物的形成、转化 加强红色产物的稳定性,酚的作用 加快红色产物的形成 消除反应产生的荧光,练习与思考,A型题,1. 醋酸地塞米松的鉴别方法是 A.三氯化铁反应 B.水解反应 C.柯柏反应 D.与碱性酒石酸铜试液反应 E.双缩脲反应,B型题,A.亚硝基铁氰化钠反应 B.Vitali反应 C.Kedde反应 D.绿奎宁(thalleiaqllin)反应 E.碱试酒石酸铜试液的反应 1. 黄体酮 2. 醋酸地塞米松 3. 地高辛 4. 硫酸奎宁,A,E,C,D,简答题： 1、简述异烟肼比色法测定甾体类激素药物含量的原理及注意事项？ 2、简述四氮唑比色法中的注意事项。 3、甾体类激素药物可能含有哪些特殊杂质？各采用什么方法检查？ 4、甾体类激素药物有哪些鉴别方法？,