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1、项目三 细胞化学染色,细胞学和化学相结合而形成的一门科学，是以细胞形态学为基础，结合运用化学反应的原理对血细胞内的各种特定的化学成分 (如酶类、酯类、铁、蛋白质、核酸等)， 作定性、定位、半定量分析的方法。,定义,第一节 概 述,细胞化学染色,原 粒,原 单,原 淋,POX 染 色,+,弱+,-,（一）固定 固定有物理法与化学法， 物理法为干燥和火焰固定， 化学法最常用的是甲醛、乙醇、丙酮和醋酸等。,血细胞化学染色流程,（二）显示 1、偶氮偶联法：利用人工合成的酶底物，在酶作用下，产生分解产物，再与重氮盐结合引起偶氮偶联，使其形成不溶性的偶氮色素，以此证明酶的存在。 2、联苯胺法：粒细胞和单核
2、细胞中的过氧化物酶作用于过氧化氢，释放新生态氧，使无色的联苯胺形成蓝色沉淀。,3、普鲁士蓝法：细胞内、外铁与酸性亚铁氰化钾作用，形成蓝色亚铁氰化铁沉淀。 4、雪夫反应：过碘酸氧化细胞内糖类中乙二醇基形成乙醛基，醛基与雪夫试剂作用，使无色品红形成红色沉淀。 5、金属沉着法 其他尚有物理学方法，如脂溶性染料染色（显示脂质）、荧光显示、放射自显影以及体外活体染色亦常用于临床血液细胞学诊断。,（三）细胞化学定量 粗略估量，以染色反应的强弱，受色的深浅，人为地区别为阴性和各种程度的阳性。 百分法，只能反映细胞阳性率，不能反映受色强弱。 积分法，是常用的半定量法，将等级估量与百分率相结合它既反映了细胞阳性
3、率的高低，又反映了细胞受色的强弱。,下面介绍几种常用的细胞化学染色方法 这些方法学在白血病的鉴别诊断上具有重要意义。,酯 酶 染 色（SE、NSE）,苏 丹 黑 染 色（SBB）,常用细胞化学染色,糖原染色（过碘酸-雪夫反应）（PAS）,中性粒细胞碱性磷酸酶染色（NAP）,酸性磷酸酶染色（ACP）,铁 染 色,过氧化物酶染色 （POX）,过碘酸-雪夫（PAS）反应,【原理】 含乙二醇基的多糖 过碘酸 双醛基 + 无色品红 （-CHOH-CHOH） （-CHO-CHO） (雪夫试剂) 紫红色化合物 （ 定位于胞浆中） 称过碘酸-雪夫（PAS）反应，以前又称为糖原染色,【正常血细胞的染色反应 】,
4、【正常血细胞的染色反应 】,1、粒系：原粒（-），以后阶段（+） 且越成熟阳性越强，阳性率达67.2， 嗜酸（浆）、嗜碱（颗粒） （+） 2、淋巴系：原淋（+）或（-），成熟（+） 阳性率10-50，多20 ； 3、红系：呈（-）； 4、巨核细胞：呈强（+）。 5、单核系：分化差原单（-），其他弱（+）。,过碘酸-雪夫（PAS）反应,正常血细胞PAS染色 1.原始粒细胞（-） 2.早幼粒细胞（+） 3.中性中幼粒细胞（+） 4.中性晚幼粒细胞（+）5.中性杆状核粒细胞（+） 6.中性分叶核粒细胞（+） 7.嗜碱性粒细胞（+）8.嗜酸性粒细胞（+） 9.单核细胞（） 10.淋巴细胞（+）,【临床
5、意义 】,1、鉴别M6与巨幼细胞性贫血： M6：幼红细胞 PAS 强（+），积分率明显。 巨幼贫、再障：幼红细胞（-）。 2、鉴别三种急性白血病 急粒：（-）。 急淋：强（+）， 急单：（+），强弱不定。 3、鉴别戈谢病和尼曼-匹克病 戈谢细胞 强（+）， 尼曼-匹克细胞呈（-弱+）。,过碘酸-雪夫（PAS）反应,糖原染色（PAS染色） A、AML-M6（+）； B、MA（-）,PAS染色A、CLL；B、ALL 原始、幼稚淋巴细胞均阳性，呈粗颗粒状阳性 幼稚红细胞 阴性,【原理】,偶氮偶联法： 血细胞内的酸性磷酸酶在酸性（pH 5.0）条件下水解基质液中的磷酸萘酚AS-BI，释放出萘酚AS-B
6、I，后者与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。,酸性磷酸酶（ACP）染色,【原理】,抗酒石酸酸性磷酸酶染色： 用相同方法制备两份基质液，一份加入适量的L-酒石酸（左旋酒石酸）,另一份不加酒石酸。取两张相同标本的涂片，分别用这两种不同的基质液做酸性磷酸酶染色。 如果血细胞内的酸性磷酸酶耐L-酒石酸，两张涂片均呈阳性；如不耐L-酒石酸，不加L-酒石酸的涂片呈阳性反应，而加L-酒石酸呈阴性反应。,酸性磷酸酶（ACP）染色,【正常血细胞的染色反应 】,粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、巨核细胞、血小板、浆细胞、巨噬细胞均呈阳性。,酸性磷酸酶（ACP）染色,【临床意义 】,1
7、. 诊断多毛细胞白血病 多毛细胞呈阳性（常呈强阳性），阳性反应不被L-酒石酸抑制。 CLL的淋巴细胞和恶性淋巴瘤细胞ACP染色也可呈阳性，但可被L-酒石酸抑制。 2. 鉴别戈谢细胞和尼曼-匹克细胞 前者阳性，不被L-酒石酸抑制；后者阴性。 3. T淋巴细胞和B淋巴细胞的鉴别 T淋巴细胞ACP呈阳性反应； B淋巴细胞ACP呈阴性或弱阳性反应。,酸性磷酸酶（ACP）染色,多毛细胞白血病酸性磷酸酶染色 多毛细胞呈阳性反应,酯 酶 染 色,根据 酯酶特异性高低分为 :,特异性酯酶(氯乙酸AS-D萘酚酯酶),非特异性酯酶,pH值不同,酸性酯酶(酸性- 醋酸萘酚酯酶 ),碱性酯酶( -丁酸萘酚酯酶 ),中
8、性酯酶,- 醋酸萘酚酯酶,醋酸AS-D萘酚酯酶,【原理】,血细胞内的氯乙酸AS-D萘酚酯酶水解基质液中的氯乙酸AS-D萘酚，产生AS-D萘酚，进而与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。 本试验常用的重氮盐为坚牢紫酱GBC，形成的有色沉淀为红色。,（一）氯乙酸AS-D萘酚酯酶(NAS-DCE)染色,【临床意义 】,1.急性粒细胞白血病 原始粒细胞呈阳性或阴性。 2.急性早幼粒细胞白血病 早幼粒细胞呈强阳性。 3.急性单核细胞白血病 原始单核及幼稚单核细胞几 乎呈阴性。 4.急性粒-单核细胞白血病 原始粒细胞及早幼粒细胞 呈阳性，原始单核及幼稚单核细胞呈阴性。 5
9、.急性淋巴细胞白血病和急性巨核细胞白血病 白血 病细胞均呈阴性。,（一）氯乙酸AS-D萘酚酯酶(NAS-DCE)染色,（一）氯乙酸AS-D萘酚酯酶(NAS-DCE)染色,【正常血细胞的染色反应 】,1.粒细胞系统 分化差的原始粒细胞呈阴性，分化好 的呈阳性，自早幼粒细胞至成熟中性 粒细胞均呈阳性。嗜酸性粒细胞呈阴 性或弱阳性，嗜碱性粒细胞呈阳性。 2.单核细胞系统 绝大多数为阴性。 3.其他细胞 如淋巴细胞、浆细胞、巨核细胞、有核 红细胞、血小板等均呈阴性； 肥大细胞呈阳性。,急性粒细胞白血病（M2a）氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色 1.原始粒细胞，呈弱阳性；2.幼稚粒细胞，呈强阳性；3.中性杆状
10、核粒细胞，呈强阳性,【原理】,血细胞内的-醋酸萘酚酯酶在pH中性的条件下，水解基质液中的-醋酸萘酚，释放出-萘酚，进而与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。,（二）-醋酸萘酚酯酶(-NAE)染色,【正常血细胞的染色反应 】,1.单核细胞系统 分化差的原始单核细胞呈阴性， 分化好的原始单核细胞呈阳性， 幼稚单核及单核细胞也呈阳性， 阳性反应能被氟化钠抑制。 2.粒细胞系统 各期粒细胞多数呈阴性，少数呈弱 阳性，阳性反应不能被氟化钠抑制。,（二）-醋酸萘酚酯酶(-NAE)染色,【正常血细胞的染色反应 】,3.淋巴细胞系统 各期淋巴细胞多呈阴性，少数呈弱 阳性，阳性
11、反应不能被氟化钠抑制。 4.其他细胞 巨核细胞和血小板呈阳性，阳性反应不 能被氟化钠抑制；少数有核红细胞呈弱 阳性，阳性反应不能被氟化钠抑制；浆 细胞呈阴性。,（二）-醋酸萘酚酯酶(-NAE)染色,【临床意义 】,1.急性单核细胞白血病 单核系细胞多呈阳性，阳性 反应能被氟化钠抑制。 2.急性粒细胞白血病 原始粒细胞呈阴性或弱阳性， 阳性反应不能被氟化钠抑制。 3.急性早幼粒细胞白血病 早幼粒细胞呈强阳性，阳 性反应不能被氟化钠抑制。,（二）-醋酸萘酚酯酶(-NAE)染色,【临床意义 】,4.急性淋巴细胞白血病 原始淋巴细胞及幼稚淋巴细 胞呈阴性或阳性，阳性反应 不被氟化钠抑制。 5.急性粒-
12、单核细胞白血病 原始粒细胞呈阴性至阳 性，阳性反应不被氟化钠 抑制；原始单核及幼稚单 核细胞呈阳性，单核系阳 性反应能被氟化钠抑制。,（二）-醋酸萘酚酯酶(-NAE)染色,A图：急性单核细胞白血病-NAE染色 原始、幼稚单核细胞多呈强阳性,B图：急性单核细胞白血病 -NAE氟化钠抑制染色 原始、幼稚单核细胞阳性反应被氟化钠抑制 （与A图为同一标本）,A,B,【原理】,血细胞内的-NBE在pH碱性条件下，水解基质液中的-丁酸萘酚，释放出-萘酚，进而与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。,（三）-丁酸萘酚酯酶（-NBE）染色,【正常血细胞的染色反应 】,1.粒细胞
13、系统 各阶段粒细胞呈阴性。 2.单核细胞系统 分化差的原始单核细胞呈阴性， 分化好的原始单核细胞呈阳性， 幼稚单核及单核细胞呈阳性，阳 性反应能被氟化钠抑制。 3.淋巴细胞系统 T淋巴细胞、非T非B淋巴细胞可呈 阳性，B淋巴细胞呈阴性。 4.其他细胞 巨核细胞、有核红细胞、浆细胞呈阴 性或弱阳性；组织细胞也可呈阳性， 但不被氟化钠抑制。,（三）-丁酸萘酚酯酶（-NBE）染色,【临床意义 】 与-NAE染色的临床意义相同。,（三）-丁酸萘酚酯酶（-NBE）染色,【原理】,血细胞中的酸性-醋酸萘酚酯酶在pH弱酸性(pH 5.8)条件下，可水解基质液中的-醋酸萘酚，产生-萘酚，进而与重氮盐六偶氮付品
14、红形成不溶性红色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。,（四）酸性-醋酸萘酚酯酶（ANAE）染色,【正常血细胞的染色反应 】,1.单核细胞系统 单核系细胞常呈弥散型强阳性， 阳性反应可被氟化钠抑制。 2.淋巴细胞系统 T淋巴细胞呈阳性，而B淋巴细胞 多数呈阴性。 3.其他细胞 粒系细胞一般为阴性或弱阳性，但此 反应不被氟化钠抑制；红系细胞、巨 核系细胞含量较少。,（四）酸性-醋酸萘酚酯酶（ANAE）染色,【临床意义 】,1.可粗略地鉴别T、B淋巴细胞 2.鉴别其它急性白血病细胞类型同-NAE染色。 3.多发性骨髓瘤、多毛细胞白血病细胞多为阳性；恶性组织细胞病呈强阳性；霍奇金淋巴瘤网状高铁红细胞(R-S细胞)呈阳性。,（四）酸性-醋酸萘酚酯酶（ANAE）染色,四种常见类型急性白血病的染色结果,常用细 胞化学 染色与 急性白 血病亚 型诊断 思路,