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1、内标法 (Internal Standard Method),PPT主讲：袁诗芬 PPT制作：聂长钰 资料收集：丁凯达 何承蓉 左嫱,目,录,1,2,3,4,5,6,分类,内标物、校正因子,注意事项,内标法的特点,内标法的应用实例,概念与原理,1.内标法的概念与原理,内标法是将一定重量的纯物质作为内标物加到一定量的被分析样品混合物中，根据测试样和内标物的质量比及其相应的色谱峰面积之比及相对校正因子，来计算被测组分的含量。 fw=（mi /Ai）/（ms/As）=（mi / ms）（As / Ai ）,2.分类（详见书P295）,标准曲线法 先求标准曲线或者回归方程 内标对比法 不知道校正因子是
2、的一种应用 归一化法 样品中的所有组分都能流出色谱柱，且可以检测出峰,3.内标物、校正因子,3.1内标物 3.2校正因子,3.1内标物,定义 将一个已知质量的纯物质，加入至待测样品溶液中，以此纯物质的量为标准，对比测定待测组分的含量，该纯物质称为内标物。 选择要求 a原样品中不含组分 b与待测物保留时间应接近,但不重叠 c为高纯度标准物质，或含量已知物质 d.在给定色谱条件下具有一定化学稳定性。,3.2校正因子f,定义（详见教材P292-293） 当相同质量的不同物质通过检测器时，产生的峰面积（或峰高）不一定相等。 为使峰面积能够准确地反映待测组分的含量，就必须先用已知量的待测组分测定在所用色
3、谱条件下的峰面积，以计算定量校正因子。,4.注意事项,4.1校正因子f 配制校正因子测定用的对照溶液和含有内标物质的待测组分溶液使用同一份内标物质溶液时，则配制内标物质溶液不必精密称(量)取。 4.2内标物的选择 满足要求，最好是被分析物质的一个同系物,4.3影响内标和被测组分峰高或峰面积比值的因素,化学方面（产生的面积比的变化常常在分析重复样品时出现。） 1、内标物在样品里混合不好 2、内标物和样品组分之间发生反应 3、内标物纯度可变等。 色谱方面(问题发生的可能性更大一些) (渗漏)对绝对面积的影响比较大， 进样量改变太大 样品组分浓度和内标浓度之间有很大的差别 检测器非线性等 其他方面
4、检查积分装置（面积比可变而峰高比保持相对恒定）和设置、斜率和峰宽定位。，,5.内标法的特点,优点 1.测定的结果较为准确，由于是通过测量内标物及被测组分的峰面积的相对值来进行计算的，因而在一定程度上消除了操作条件等的变化所引起的误差。 2. 操作过程中样品和内标是混合在一起注入色谱柱，因此只要混合溶液中被测组分与内标的量的比值恒定，上样体积的变化不会影响影响定量结果。 3.内标法抵消了上样体积，乃至流动相、检测器的影响 缺点 1.操作程序较为麻烦 2.有时寻找合适的内标物也有困难,1.高效液相色谱法内标法测定斑蝥中斑蝥素的含量,6.内标法的应用实例,高效液相色谱法内标法测定斑蝥中斑蝥素的含量,
5、斑蝥 为芫青科昆虫南方大斑蝥或黄黑小斑蝥的干燥体，于夏秋两季捕捉，闷死或烫死后晒干服用。斑蝥是我国最先发现的一种具有抗肿瘤活性的昆虫，斑蝥素是斑蝥中抗癌的有效成分，对多种肿瘤细胞有抑制作用，但斑蝥素毒性强烈，在临床应用中受到剂量的限制。本实验用HPLC内标法测定提取物中斑蝥素含量。,色谱条件： 色谱柱为Hypersil OSD2柱（250mmx4.6mm，5um大连伊利特科学仪器有限公司）流动相为甲醇，浓度0.04mol/L的磷酸二氢钾溶液（用磷酸条PH至3）=30:70，流速为1ml/min，检测波长为230nm，柱温30摄氏度，进样量10um 试剂与仪器： Agilent1200高效液相色
6、谱仪G1315D二极管阵列检测器，G1311A泵，Agilent1200系列标准自动进样器，AT201型十万分之一电子天平，旋转蒸发仪，循环水式真空泵，低温冷却循环泵，微量移液器（200-1000um）领苯二甲酸酐（分析纯，纯度99%）斑蝥素对照品（纯度99%）甲醇为色谱纯,内标溶液的制备： 称取领苯二甲酸酐对照品50.00mg置于100ml量瓶中加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀即得 对照品溶液的制备： 称取斑蝥素对照品50.00mg置于25ml量瓶中，加流动相使其溶解，并稀释至刻度线，摇匀作为储备液，量取储备液2ml，内标液1ml置于同一10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀即得,供试品溶液
7、的制备： 取斑蝥虫体于50摄氏度干燥5h粉碎过60目筛，于干燥器中保存备用。取本品粗粉约1g，置于圆底烧瓶中，加丙酮15ml和PH=1的盐酸水溶液5ml，回流提取2h，过滤，残渣在重复提取2次合并提取液，过滤，用少量丙酮分次洗涤容器，洗液与滤液合并，回收溶剂至干，残渣加流动相使其溶解，并转移至50ml量瓶中，加内标溶液5ml，加流动相至刻度，摇匀，经0.45um滤膜滤过即得,内容： 取对照品储存液0.25、0.50、 1.00、 2.00、 3.00、 4.00、 5.00ml，分别置于100ml容量瓶中，加入内标溶液各10um。加流动相稀释至刻度，摇匀，作为各对照品溶液。照上述色谱条件，分别
8、金阳10um，记录色谱图，得对照品峰面积与内标物峰面积的比值，并以斑蝥素浓度与内标物溶度（mg/ml）的比值为横坐标，对照品峰面积与内标物峰面积（mAU/s） 的比值为纵坐标，进行线性回归，绘制回归曲线，计算回归方程,实验结果,参 考 文 献,1.国家药典委员会中华人民共和国药典（ 一部)S .北京：中国医药科技出版社，2010 :311- 312 ， 2.王丽，刘彩虹，刘俊芳，斑蝥临床应用J .中医中药2006， 9(9)：72-73 ， 3.吴磊，王宪龄，白一明，斑蝥临床外用举隅及药理作用J.中国医药指南，2010，8(14）：57-59. 4.刘沁，陈建伟，李祥，等，HPLC法测定5个产
9、地斑蝥药材中斑蝥素的含量J.海南医学院学报, 2011,13(5): 582-585. 5.李清，贾英，邓新秀，等，斑蝥药材提取工艺与含量测定J .沈阳药科大学学报,2006,23(11): 706-709. 6.朱颖,夏少秋,赵越,RP-HPLC法测定斑蝥中斑蝥素的含量J.中药新药与临床药理;2010,21(6):643-5. 7.敖国富,曾造,周建威,高效液相色谱法测定短翅豆芫箐体液中斑蝥素含量J.贵州帅范大学学报:自然科学版,2008,26(1):100-102,THANK YOU FOR YOUR ATTENTION!,01,02,03,04,色谱条件： 玻璃色谱柱，固定相，柱温，汽化室温度，检测室温度，氮气流速，氢气流速，空气流速，进样量,标准曲线绘制： 内标溶液、对照品溶液制备,内标矫正因子测定,样品测定,气相色谱法测定薄荷油中薄荷醇的含量的实验步骤,气相色谱法测定薄荷油中薄荷醇的含量,色谱条件：玻璃色谱柱，固定相，柱温，汽化室温度，检测室温度，氮气流速，氢气流速，空气流速，进样量 标准曲线绘制：内标溶液、对照品溶液制备 内标矫正因子测定 样品测定,