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1、单基因遗传病的研究方单基因遗传病的研究方 法与技术法与技术 宋书娟宋书娟 医学遗传学系细胞楼医学遗传学系细胞楼304304室室 电话：电话：8280297582802975 已知致病基因突变分析已知致病基因突变分析 基因突变 基因突变 l l 稳定突变稳定突变：传递中不改变原有的突变。 l l 动态突变动态突变：传递中不断改变自己，多见 于短重复序列的突变，在一代代传递中 重复次数发生明显变化。 三核苷酸重复突变 基因突变类型 l l 点突变点突变：只有一个或几个核苷酸的改变，是突变 中最多见的形式。突变的结果分为： 同义突变、同义突变、 错义突变、无义突变、剪切突变等。错义突变、无义突变、
2、剪切突变等。 l l 碱基的插入碱基的插入和和缺失缺失：基因编码序列中插入或丢失：基因编码序列中插入或丢失 一个或几个碱基，其结果是突变点下游碱基序列一个或几个碱基，其结果是突变点下游碱基序列 发生移码，编码氨基酸序列都发生改变，又称移发生移码，编码氨基酸序列都发生改变，又称移 码突变（码突变（frameshift frameshift mutmuta ationtion），并可在突变点并可在突变点 下游提前出现终止密码。下游提前出现终止密码。 基因突变类型 l l 框内突变框内突变（inframe inframe mutationmutation）：）：3 3个或是个或是3 3的的 倍数的倍
3、数的碱基缺失或插入导致的突变，使基因丢碱基缺失或插入导致的突变，使基因丢 失或增加失或增加1 1个或几个氨基酸。个或几个氨基酸。 l l DNADNA大片段缺失或复制大片段缺失或复制（large large deletion deletion or or duplication)duplication)：几百个几百个bpbp至几十个至几十个kbkb的的碱基碱基缺缺 失或复制。失或复制。 各种类型病理性突变的比例 无义突变和移码突变：无义突变和移码突变： 6060 稀有的错义突变：稀有的错义突变： 2020 DNADNA大片段缺失或重复大片段缺失或重复: : 2020 微小突变 基因突变分析所用
4、实验材料 vv临床样本取材：临床样本取材： l l 外周血外周血 l l 组织组织 l l 毛囊毛囊 l l 颊粘膜脱落细胞颊粘膜脱落细胞 l l 羊水细胞羊水细胞 l l 绒毛绒毛 vv实验应用材料：实验应用材料： l l DNADNA l l RNARNA l l ProteinProtein RNA RNA 的优点与缺点的优点与缺点 l l 优点优点: : 不包含内含子不包含内含子 RT-PCR RT-PCR 能够检测异常的剪切体能够检测异常的剪切体 l l 缺点缺点: : 不易获得不易获得 要求操作特别小心且快速以免降解要求操作特别小心且快速以免降解 目的基因可能不在获得的材料组织中表
5、达目的基因可能不在获得的材料组织中表达 导致导致RNARNA不稳定的突变不能被检测不稳定的突变不能被检测 vv聚合酶链式反应聚合酶链式反应 vv分子杂交分子杂交 基因突变分析常用技术基因突变分析常用技术 SouthernSouthern 印迹杂交印迹杂交 例如：脆例如：脆X X综合征综合征 l l 若若X X染色体在染色体在Xq27.3Xq27.3处呈现细丝样结构，处呈现细丝样结构， 且连接的末端形似随体，这条染色体就且连接的末端形似随体，这条染色体就 被称为脆性被称为脆性X X染色体。染色体。 l l 主要临床症状：智力低下、语言障碍、主要临床症状：智力低下、语言障碍、 性格孤僻、伴有特殊面
6、容性格孤僻、伴有特殊面容长脸、方长脸、方 额、大耳朵、嘴大唇厚，青春期后可见额、大耳朵、嘴大唇厚，青春期后可见 明显大于正常的睾丸。明显大于正常的睾丸。 l l 通贯掌、三叉点通贯掌、三叉点C C缺如。缺如。 Xq27.3 前突变和全突变 正常 CGG 200 SouthernSouthern杂交法诊断杂交法诊断FragileFragile X X F: Fully expanded and methylated NM: Methylated X do not cut with EclXI P: Unmethylated premutation N: X in normal male and
7、active normal female Mullis FMullis F “for “for his his invention invention of of the the polymerase polymerase chain chain reaction reaction (PCR) method“(PCR) method“ 聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCRPCR） v聚合酶链式反应于1983年由美国Cetus公司的K.Mullis建立，并和 定点突变的发明者M.Smith一起荣获1993年度诺贝尔化学奖，为生 命科学领域的研究开创了崭新时代。 PCRPCR反应的特点反应的特点
8、 l l 特异性强特异性强 引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性 l l 灵敏度高灵敏度高 指数增长指数增长，从从pg (10pg (10-12 -12) )可扩增至 可扩增至 m mg (10g (10-6 -6) )水平 水平 l l 简便、快速简便、快速 2 24 4 小时完成扩增小时完成扩增 l l 对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低 DNA DNA 粗制品及总粗制品及总RNARNA均可作为扩增模板均可作为扩增模板 DNADNA的体外复制包括的体外复制包括3 3个步骤：个步骤： l l 变性（变性（denaturationdenaturatio
9、n）:94 :94 C C 95 95 C C l l 退火（退火（annealingannealing）: 40 : 40 C C 70 70 C C l l 延伸（延伸（extensionextension）:72 :72 C C 3 3个步骤作为个步骤作为PCRPCR的一个循环，每当完成一个循的一个循环，每当完成一个循 环，一个分子的模板被复制为二个，产物量以环，一个分子的模板被复制为二个，产物量以 指数形式增长。指数形式增长。 PCRPCR反应原理和反应过程反应原理和反应过程 5 5 3 3 d.NTPs 耐热DNA聚合酶 引物 53 53 53 53 53 53 53 53 添加反应
10、混合液 及样本 变性 53 53 53 53 53 53 退火 加入试管中 延伸 53 53 53 53 继续延伸 53 53 5 5 Taq Taq 3 53 Taq Taq 5 5 循环 53 5 3 5 35 3 5 53 3 53 5 3第二个循环 4个拷贝 第三个循环 8个拷贝 5 35 3 53 5 3 53 5 3 53 5 3 53 5 3 53 35 53 5 3 53 5 3 第n个循环 2n个拷贝 PCRPCR反应体系反应体系 参与参与PCRPCR反应的主要成份反应的主要成份: : 模板、引物、模板、引物、dNTPdNTP、Taq Taq DNADNA聚合聚合 酶和缓冲液
11、等。酶和缓冲液等。 引物引物(Primers)(Primers) 引物决定引物决定PCRPCR扩增产物的特异性和长度扩增产物的特异性和长度 l l 化学合成的寡核苷酸化学合成的寡核苷酸 l l 能与模板特异地结合能与模板特异地结合 l l 引物决定产物的特异性和长度引物决定产物的特异性和长度 l l 引物设计引物设计时必须遵循一些原则时必须遵循一些原则 设计引物的原则：设计引物的原则： l l 二条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正负二条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正负 链序列互补链序列互补 l l 长度为长度为18 18 25 25个核苷酸个核苷酸 l l 二条引物之间避免形成引
12、物二聚体二条引物之间避免形成引物二聚体 l l 引物的碱基组成应平衡引物的碱基组成应平衡 l l 引物的引物的55端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位 点、生物素等标记）点、生物素等标记） DNADNA聚合酶聚合酶 Taq DNATaq DNA聚合酶复制的保真性：聚合酶复制的保真性： l l Taq DNATaq DNA聚合酶无聚合酶无33 5 5外切酶活性，外切酶活性， 因而无校正功能，在复制新链的过程中因而无校正功能，在复制新链的过程中 会发生碱基错配。会发生碱基错配。 l l Taq DNATaq DNA聚合酶在每次循环中产生的移聚合酶在每次循环中产生
13、的移 码突变率为码突变率为1/300001/30000，碱基替换率为，碱基替换率为 1/80001/8000。 扩增失败扩增失败 l l 试剂错加或漏加试剂错加或漏加 实验中如发现对照样本也扩增失败，可用原试剂实验中如发现对照样本也扩增失败，可用原试剂 重复一次，以确定试剂是否错加或漏加。重复一次，以确定试剂是否错加或漏加。 l l 试剂失效试剂失效 l l 变性温度偏低变性温度偏低 有些有些DNADNA所含所含G G、C C碱基对丰富，当变性温度偏低碱基对丰富，当变性温度偏低 时，双链时，双链DNADNA不能完全解链。不能完全解链。 l l 退火温度偏高退火温度偏高 l l 标本中标本中DN
14、ADNA含量过高含量过高 或杂质过多。降低或杂质过多。降低 加样量拖尾可明显加样量拖尾可明显 改善。改善。 l l TaqTaq酶加量过大或扩酶加量过大或扩 增循环数太多增循环数太多 拖尾拖尾 非特异条带非特异条带 l l 退火温度低退火温度低, ,提高退提高退 火温度。火温度。 l l 引物特异性不佳，引物特异性不佳， 切胶纯化特异条带切胶纯化特异条带 l l TaqTaq酶加量过大或扩酶加量过大或扩 增循环数太多增循环数太多 引物二聚体引物二聚体 l l 引物量过多：降低引物引物量过多：降低引物 浓度。浓度。 l l 引物设计问题引物设计问题 l l 操作问题：反应体系建操作问题：反应体系
15、建 立后，如在室温放置时立后，如在室温放置时 间过长，会引起扩增后间过长，会引起扩增后 的二聚体加重。的二聚体加重。 应用PCR相关技术进行基因突变 分析的策略与方法 策略与方法 直接分析法：直接分析法： vvPCRPCR片段大小分析：片段大小分析：片段大小有明显差异片段大小有明显差异 vvPCR-RFLPPCR-RFLP：有酶切位点有酶切位点 vvPCR-PCR-测序：测序：确定突变点碱基改变确定突变点碱基改变 vv多重连接探针扩增（多重连接探针扩增（MLPAMLPA）：）：片段缺失与重复片段缺失与重复 vvRT-PCR:RT-PCR: 基因大，可取到新鲜材料，且基因在其中有表达基因大，可取
16、到新鲜材料，且基因在其中有表达 间接分析法：间接分析法： vvPCR-STRPCR-STR连锁分析：连锁分析：基因大；在已知致病基因编码区未检测基因大；在已知致病基因编码区未检测 到突变的家系到突变的家系 1. 脊髓小脑性共济失调 l l 脊髓小脑性共济失调是遗传性共济失调的主要脊髓小脑性共济失调是遗传性共济失调的主要 类型，包括类型，包括SCA1SCA12727。成年期发病、常染色体。成年期发病、常染色体 显性遗传及共济失调等是本病的共同特征，并显性遗传及共济失调等是本病的共同特征，并 表现在连续数代中发病年龄提前和病情加重（表现在连续数代中发病年龄提前和病情加重（ 遗传早现）。遗传早现）。
17、 l l SCA3SCA3是我国最常见的脊髓小脑性共济失调亚型是我国最常见的脊髓小脑性共济失调亚型 ，基因位于，基因位于14q24314q2433232，含，含4 4个外显子。个外显子。CAGCAG 突变位于突变位于4 4号外显子，患者扩增拷贝数为号外显子，患者扩增拷贝数为6161 8989，正常人为，正常人为12124141。 NC F1 F2 F3 F4 F5 PC M 应用PCR技术分析一遗传性脊髓小脑性共 济失调（SCA)3型家系 NC:正常对照 PC:阳性对照 F:家系成员 M:Marker 结果： 家系成员1、3 、4有SCA3致病 基因突变; 家系成员2、5 未检测到突变 1 2
18、 3 4 5 2. 脊肌萎缩症 l l 脊肌萎缩症脊肌萎缩症( Spinal Muscular ( Spinal Muscular Atrophy , SMA)Atrophy , SMA)系指一类由于下运动神系指一类由于下运动神 经元变性导致的进行性骨骼肌无力和萎经元变性导致的进行性骨骼肌无力和萎 缩的一组疾病缩的一组疾病 , ,是儿童和少年常见的致是儿童和少年常见的致 死性常染色体隐性遗传病之一死性常染色体隐性遗传病之一 , ,其隐性其隐性 致病基因携带率在人群中为致病基因携带率在人群中为 1/ 401/ 401/ 1/ 50 ,50 ,发病率为发病率为1/60001/60001/10000
19、.1/10000. 应用PCR-RFLP技术分析脊肌萎缩症（SMA） 致病基因SMN PCR扩增SMN基因 exon7,DraI酶切 PCR产物. 酶切N：正常人 PCR产物被酶切为 两条带 酶切P：阳性对照 PCR产物被酶切为 一条短带 病人1：结果显示 SMN基因有突变 病人2和3：结果 显示未有突变 3. 3. 腓骨肌萎缩症腓骨肌萎缩症(CMT)(CMT) l l CMTCMT是一类周围神经系统遗传病是一类周围神经系统遗传病 , ,其遗传方式其遗传方式 可为常染色体显性遗传可为常染色体显性遗传(AD ,(AD ,占绝大多数占绝大多数) ) 、常、常 染色体隐性遗传染色体隐性遗传(AR)(
20、AR)及及 X X连锁显性遗传连锁显性遗传(XD)(XD) l l 依据病理和电生理特点分为两型依据病理和电生理特点分为两型: :脱髓鞘型脱髓鞘型 (CMT1 (CMT1 型型) ) 和轴突型和轴突型 (CMT2(CMT2型型). CMT1). CMT1型约占型约占 CMTCMT总数的总数的70%70%，70%70%以上以上CMT1CMT1由由PMP22PMP22基基 因重复引起因重复引起 l l 其中其中X X连锁显性遗传连锁显性遗传CMTCMT致病基因为致病基因为CX32CX32，含，含 有有2 2个外显子个外显子 MLPAMLPA分析分析PMP22PMP22基因重复突变基因重复突变 PC
21、R- PCR-测序直接分析测序直接分析CX32CX32基因来诊断基因来诊断 X X连锁腓骨肌萎缩症连锁腓骨肌萎缩症 4. 假肥大型肌营养不良症 假肥大型肌营养不良假肥大型肌营养不良 (DMD) (DMD) 是一种高发是一种高发 病率、高致残、高致死的病率、高致残、高致死的X X染色体连锁的染色体连锁的 遗传性疾病，在遗传性疾病，在25002500个活产男婴中即有一个活产男婴中即有一 个患者个患者 致病基因致病基因DMDDMD含有含有7979个外显子个外显子 DMDDMD的最主要遗传缺陷是外显子缺失，的最主要遗传缺陷是外显子缺失， 约占约占60%-70%60%-70% MLPAMLPA 技术简介
22、技术简介 l l MLPAMLPA Multiplex ligation-dependent probe Multiplex ligation-dependent probe amplificationamplification 链接依赖型多探针扩增技术链接依赖型多探针扩增技术 最早由荷兰人最早由荷兰人Schouten JP (Schouten JP et al, Schouten JP (Schouten JP et al, 2002) 2002) 在原有在原有PCRPCR技术上发展出来技术上发展出来 MLPA 技术原理 MLPA方法检测DMD 1 23 45 5. 5. 成人型多囊肾成人型
23、多囊肾 l l 是一种最常见的单基因遗传是一种最常见的单基因遗传 性肾病，发病率约为性肾病，发病率约为1/10001/1000 l l 其主要特征在双肾形成进行其主要特征在双肾形成进行 性增长的多个液性囊肿，最性增长的多个液性囊肿，最 终可引起肾衰竭终可引起肾衰竭 l l 具有遗传异质性，存在两个具有遗传异质性，存在两个 主要的致病基因主要的致病基因PKD1PKD1和和PKD2PKD2 46 47 ADPKDADPKD分子遗传基础分子遗传基础 GeneGenePKD1PKD1PKD2PKD2PKD3 ?PKD3 ? Chromosomal locusChromosomal locus16p13
24、.316p13.34q22-234q22-23 ClonedClonedYesYesYesYes PercentagePercentage85%85%15%15% Exons/Single-copy Exons/Single-copy exonsexons 46/46/Ex35-46Ex35-46 15/15/Ex1-Ex1- 1515 Mutation numberMutation number 343 343100100 Hot mutation Hot mutation No NoNoNo PKD1PKD1基因结构的复杂性基因结构的复杂性 PKDPKD基因分析基因分析: : l l 直接
25、基因突变分析：直接基因突变分析： 适于散发病例和小家系病例。具有结适于散发病例和小家系病例。具有结 果判读的不确定性果判读的不确定性 l l 连锁分析连锁分析: : 适于分析适于分析在已知致病基因编码区未检在已知致病基因编码区未检 测到突变的测到突变的较大较大家系家系，不适于散发病例不适于散发病例 和小家系病例和小家系病例 49 PCR-PCR-测序分析测序分析 l l 在在PKD1PKD1外显子编码序列上发现无义突变，使外显子编码序列上发现无义突变，使 突变碱基所在密码子由突变碱基所在密码子由CGACGA变为终止密码子变为终止密码子 TGATGA。 连连 锁锁 分分 析析 结结 果果 新致病
26、基因的研究方法 和技术 l l 家系连锁分析来定位家系连锁分析来定位: : 适于分析较大的遗传病家系，不适于适于分析较大的遗传病家系，不适于 散发病例和小家系病例散发病例和小家系病例 l l 二代测序技术：二代测序技术： 适于散发病例和小家系病例适于散发病例和小家系病例 研究对象不同，策略方法不同研究对象不同，策略方法不同 连锁分析与二代测序相结合加快新基因的发现连锁分析与二代测序相结合加快新基因的发现 A A T T GG GG T T C C T T C C A A C C T T GG C C A A A A C C C C GG A A T T GG GG T T C C T T C
27、C A A C C T T GG T T A A A A C C C C GG MetMet ValVal SerSer LeuLeu GlnGln ProPro MetMet ValVal SerSer LeuLeu Stop 定位克隆定位克隆 利用被定位的基因与在同一染色体利用被定位的基因与在同一染色体 上另一遗传座位相连锁的特点，将该基上另一遗传座位相连锁的特点，将该基 因定位在某一染色体或染色体某一区带因定位在某一染色体或染色体某一区带 上。上。 连锁分析连锁分析 vvDNA STR DNA STR vvSNPSNP 常见遗传标记常见遗传标记 PCR-STRPCR-STR连锁分析连锁分
28、析 CACACA Primer 1 Primer 2 CACACACA CACACACACA CACACACACACA 毛细管电泳分析毛细管电泳分析PCRPCR片段大小片段大小 分析分析 D4S1534D4S2929D4S2460D4S423 I-1114,124176,178200,202105,112 II-1114,120153,159200,202107,109 II-2114,124157,176202,204105,112 II-3114,122157,178200,202102,105 II-4114,124157,176202,204105,112 II-5114,124157
29、,176198,202107,109 III-1114,124153,176200,202109,112 III-2114,124176,176202,202109,112 连锁分析结果连锁分析结果 vv均匀分布于均匀分布于2323对染色体上的对染色体上的STR STR vvSNPSNP芯片芯片 通过全基因组扫描来定位基因通过全基因组扫描来定位基因 vv外显子组测序外显子组测序 用二代测序技术寻找致病基因用二代测序技术寻找致病基因 vv全基因组测序全基因组测序 基因功能相关分子遗基因功能相关分子遗 传学研究方法传学研究方法 隐性突变往往导致失去功能（loss of function） 显性突变
30、可导致获得功能（gain of function）和失去功能 失去功能：单倍剂量不足（halpoinsufficency） 获得功能：显性负效应（dominant negtive） 隐性突变和显性突变的致病机制隐性突变和显性突变的致病机制 基因突变对基因功能的影响及发病 机制研究 l l 将目的基因将目的基因cDNAcDNA克隆到合适载体克隆到合适载体 l l 应用定点突变方法建立突变基因载体应用定点突变方法建立突变基因载体 l l 体外功能研究：应用分子生物学技术研究与正常基体外功能研究：应用分子生物学技术研究与正常基 因相比突变基因突变有否功能差异。因相比突变基因突变有否功能差异。 l l
31、 细胞水平功能研究，突变基因转然细胞内，顺时转细胞水平功能研究，突变基因转然细胞内，顺时转 染或建立细胞系，研究其所引起细胞功能改变及其染或建立细胞系，研究其所引起细胞功能改变及其 可能信号转导通路。可能信号转导通路。 将目的DN片段克隆到质粒载体 建立遗传病动物模型建立遗传病动物模型 l l 隐性遗传病：隐性遗传病： 往往因基因失去功能所致，往往因基因失去功能所致，适于建立基因适于建立基因 敲除动物模型，纯合突变会表现出人类疾病相敲除动物模型，纯合突变会表现出人类疾病相 似表型似表型 l l 显性遗传病：显性遗传病： 失去功能引起单倍剂量不足，适于建立基适于建立基 因敲除动物模型，杂合突变动物会表现出人类因敲除动物模型，杂合突变动物会表现出人类 疾病相似表型，纯合突变往往致死。疾病相似表型，纯合突变往往致死。 获得功能导致显性负效应，适于建立转基 因动物模型，杂合突变会表现出人类疾病相似会表现出人类疾病相似 表型，纯合突变往往表型更重。表型，纯合突变往往表型更重。 Thank you!Thank you!