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1、微生物的实验室培养四川省中江中学校 叶秀琼“微生物的实验室培养”是选修1的专题2“微生物的培养与应用”中的第1个课题，它是在传统发酵技术的应用的基础上，进一步全面深入学习微生物培养的基础知识和基本操作技术，同时也为微生物应用奠定基础，具有承上启下的重要作用。在生物技术模块中是学生应该选择的一个重要的操作实验，但由于该课题实验难度很大，多数中学实验室实验器材不足，实验经费紧张，尤其是该实验具有一定风险性（微生物本身就是危险生物），多数学校在选择实验操作课题时都放弃该专题中这个基础实验。为了使学生更好了解与我们自身关系极为密切的微生物培养与应用的知识和技能，下面就结合自己的教学实际谈谈对本课题的教
2、学设计。1 教学目标确立依据课程标准中内容标准“进行微生物的分离和培养”和活动建议“用大肠杆菌为材料进行平面培养分离菌落”，结合人教社选修1教材和本校实验室条件，确立本课题教学目标如下：知识目标：列举培养基的种类等基础知识，说明培养基配方及作用；概述无菌技术。能力目标：尝试培养基的制备、高压蒸汽灭菌和平板划线法等基本操作技术。熟练规范地进行无菌操作，成功地培养微生物。情感态度价值观方面：体验制作牛肉膏蛋白胨培养基，培养纯化大肠杆菌的方法；参与实验过程，体验实验操作领悟实验原理，交流实验体会；形成勇于实践、严谨求实的科学态度和科学精神。教学重难点：无菌技术的操作。由于微生物在自然界分布广泛，在实
3、验室培养微生物除了要为微生物提供合适的营养和环境条件外，还需要确保其他微生物无法混入。因此，实验时针对培养基、操作者、用于培养的器皿、接种工具等使用不同的方法进行消毒灭菌处理。在“无菌”的条件下接种和培养，获得纯净培养物，才能成功培养微生物。可见无菌技术是微生物培养过程的关键。教学中可联系医疗和生活实际深入理解无菌技术 2 教学实施建议21 拟定实验计划微生物实验室培养需要在无菌条件下进行，实验技术要求高。对本课题教学组织采用实验探究的模式，注重微生物实验基本操作和技能的训练。采用课上和课下统筹安排，理论和实践并举，在操作中理解原理，利用原理指导实践。基于此，对本实验教学安排如下：实验计划教学
4、目标教师活动学生活动设计意图第一课时学习有关培养基的知识和无菌技术提供相关材料，进行基础知识介绍明确实验原理通过讲解，设计表格进行知识归纳第二课时学习有关制备牛肉膏、蛋白胨固体培养基的方法；进行制备牛肉膏、蛋白胨培养基、倒平板操作提供实验器具，和培养基配方，指导学生操作进行实验培养基和器皿灭菌，倒平板操作尝试配制培养基及倒平板第三课时进行实验室纯化大肠杆菌操作介绍平板划线和稀释涂布平板原理，并指导学生接种操作利用各小组自己配制的培养基在无菌条件下接种大肠杆菌操作尝试利用牛肉膏蛋白胨培养基接种大肠杆菌并纯化培养第四课时培养观察、展示成果，分析原因和课题延伸组织交流和介绍菌种保藏观察记录结果并进行
5、分析观察并分析成功和失败原因，拓展视野22 理解实验原理实验原理是实验所遵循的科学道理，具体地说它是进行实验设计和操作的理论依据。是为解决某方面生物学问题所应用到的生物学及相关学科中的方法和理论。把握实验原理是实验设计和操作的前提。本课题依据的实验原理是：211培养基配制原理：微生物的生长繁殖时需要各种营养物质，一般包括水、无机盐、碳源和氮源，有的还需要少量特殊营养物质（生长因子）根据微生物的种类和实验目的不同，选择不同的原料配制不同培养基。本课题使用牛肉膏蛋白胨培养基，它是一种应用最广泛和最普遍的细菌基础培养基，也称普通培养基。它含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl，其中牛肉膏为细菌提供碳源和能源，
6、磷酸盐；蛋白胨主要提供氮源；而NaCl提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入琼脂作凝固剂。在培养细菌时要用稀酸或稀碱将pH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。牛肉膏蛋白胨培养基的配方见教材P15。212 无菌操作原理：针对不同对象采用不同的消毒和灭菌的方法，在高温、高压、化学药剂、强酸和强碱作用下，使微生物蛋白质凝固变性，从而达到杀菌的目的。本实验采用酒精对实验者双手消毒，紫外线对操作环境照射消毒，对培养基采用高压蒸汽灭菌，对玻璃器皿进行干热灭菌和接种环灼烧灭菌等。213 纯化大肠杆菌的原理：为了获得某种微生物的纯培养，选用平板划线法或稀释涂布平板法，在牛肉膏蛋白胨培养基上操作，经培养后可
7、分离得到有单个细胞繁殖而来的子细胞群，即菌落。23 准备实验材料微生物实验涉及的实验仪器较多，完成本课题所用材料、仪器及药品列表如下： 实验材料实验仪器和设备实验试剂或药品大肠杆菌或金黄色葡萄菌等细菌培养皿、试管、试管架、锥形瓶、量筒、烧杯（100mL）、酒精灯、石棉网、高压蒸汽灭菌锅、移液管、胶头滴管、托盘天平（或电子秤）、接种环、涂布器、恒温箱、干热灭菌箱、玻璃棒、称量纸、棉花、牛皮纸（或旧报纸）、橡皮筋牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、盐酸、氢氧化钠、琼脂、蒸馏水等就目前中学生物实验室条件来说，多数学校都没有单独设立无菌室，一些实验器材也不全，这是制约微生物实验顺利进行的瓶颈。教学中为了满足实验要
8、求，积极创造条件开展好微生物培养实验，具体做法是：通过自制无菌操作箱（即接种箱见图1）可解决没有无菌室的问题；高压蒸汽灭菌锅可用家用高压锅代替，也可用铝锅隔水蒸煮3060分钟，温度100，隔24小时再照样蒸煮，连煮三次，就可以杀死全部细菌和芽孢；接种环可用废电炉丝或细钢丝做针环，用玻璃棒做柄，自己动手制作；培养时如果没有恒温箱，冬季可用电暖风或暖气附近保持温度在2030即可。 24 指导实验操作本课题实验可按照下面实验流程进行操作： 配制合适的培养基是培养、观察和研究微生物的基础。组织学生配制牛肉膏蛋白胨培养基操作时注意：（1）溶化琼脂时要控制火力的大小并不断搅拌，以免培养基溢出或糊底引起烧杯
9、破裂；（2）加热过程中部分水分蒸发，待琼脂完全溶化后应补加蒸馏水，以保持溶液的浓度；（3）培养基各种成分溶化后灭菌前要根据培养微生物需要调节pH（4）一般是培养基先灭菌再倒平板，倒平板操作必须在酒精灯火焰旁进行，并且不要将皿盖完全打开；（5）冷却后的平板要倒置，以确保拿放方便，同时避免水分蒸发，以利微生物生长。242 接种操作 （一）平板划线接种微生物接种方法有两种，一是平板划线接种（图2），即用接种环划线将菌体沾在斜面培养基或平板培养基上。微生物的生长和繁殖迅速，一段时间后，就会在培养基表面形成长满菌落的细线。划线法的作用是纯化微生物，通过划线将微生物单个地分离，并最终形成标准的菌落。划线操
10、作时注意：（1）用接种环取菌种之前、每次划线之前和划线结束都要进行灼烧灭菌，灼烧后要在酒精灯附近冷却后再操作；（2）划线时不要划破培养基，如果采用分段划线法操作从第二次操作应总在上一次划线末端开始，首尾区不能相连；（3）操作必须始终在酒精灯火焰旁进行。 （二）稀释涂布平板接种二是稀释涂布平板接种（图3），即先将菌液进行一系列梯度稀释，用涂布器将不同稀释度的菌液均匀地涂布在平板上进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。涂布操作时注意：（1）配制系列梯度稀释液必须用无菌水配制；（2）配制系列梯度稀释液和转移菌液以及涂布过程等必须都在
11、酒精灯火焰旁进行。 教学中，要求学生认真领会无菌接种的技术原理，反复练习操步骤作。通过练习达到熟练程度，并培养严谨认真的科学精神和一丝不苟的实验态度。 243培养操作将接种后的培养基和一个未接种的培养基放入37恒温箱中培养12h和24h后，观察并记录。这期间可安排生物科代表或实验小组长进行定期观察，并做好计录，以便及时让其他学生观察到自己的实验成果。特别需要说明的是，如果学生不能及时观察，培养的时间过长，很多菌落就会联成一片，就不能观察到单个菌落了。3 知识小结及作业4 教后反思 本节课可以通过生产实例入手，引导学生认识在微生物的培养过程中，保持培养物纯净的重要性。在实验中充分发挥学生的主动性，让学生多练习相应操作，从中体会纯净培养过程中“无菌”操作的重要性。要让学生熟悉实验原理再进行操作实验，利用培养结果指导学生回顾实验中的成败并相互讨论总结，深入理解知识。当然由于微生物的微观性和危害性，一定要教育学生培养良好的卫生习惯。5