《5.1《DNA的粗提取与鉴定》教案.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《5.1《DNA的粗提取与鉴定》教案.doc（5页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、挫折其实就是迈向成功所应缴的学费DNA的粗提取与鉴定【考试说明要求】1.制备和应用固定化酶（A）2. 酵母细胞的固定化（B）【课堂活动】基础回顾一、实验原理1DNA的溶解性 DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度（如2mol/L）就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反(DNA在浓度为0.14mol/L的NaCl溶液中，溶解度最小)，以达到分离目的。此外，DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步的分离。2DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性 蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响。大
2、多数蛋白质不能忍受6080oC的高温，而DNA在80oC以上才会变性。洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。3DNA的鉴定 在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。二、实验材料的选取 凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是使用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大，如鸡血（原因：DNA含量丰富，材料易得，鸡血细胞吸水易胀破）。若用动物组织如猪肝，则需研磨。三、过程1破碎细胞，获取含DNA的滤液 动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。如果实验材料是植物细胞，需要先用洗涤
3、剂溶解细胞膜。例如，提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。注意：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响?研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物
4、、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质。2 去除滤液中的杂质 方案一的原理是DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质，不分解DNA；方案三的原理是蛋白质和DNA的变性温度不同。注意：为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。方案二与方案三的原理有什么不同？方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开
5、；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离（6075的恒温水浴保温1015min）。3 DNA的析出与鉴定 将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等、冷却的酒精溶液，静置23min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水分。取两支20ml的试管，各加入物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液5ml，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4ml的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管溶液颜色的变化，看看溶解有DNA
6、的溶液是否变蓝。四、注意事项1以血液为实验材料时，每100ml血液中需要加入3g柠檬酸钠防止血液凝固。2加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤地操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。3二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。4DNA的溶解度与NaCl溶液浓度的关系：当NaCl溶液浓度低于0.14mol/L时，随浓度的升高，DNA的溶解度降低；当NaCl溶液浓度高于0.14mol/L时，随浓度升高，DNA的溶解度升高。5盛放鸡血细胞液的容器，最好是塑料容器。鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容
7、器吸附，由于细胞内DNA的含量本来就比较少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的DNA就会更少。因此，实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管，这样可以减少提取过程的DNA的损失。诊断检测1.下列图示中能反映DNA溶解度与NaCl溶液浓度之间关系的是：2.在DNA粗提取的实验过程中，得到的丝状物主要成分就是DNA， 依据是 A丝状物易溶于2molL的氯化钠溶液中 B丝状物溶解后，遇二苯胺(沸水浴)变蓝色 C丝状物能在约为O14molL氯化钠溶液中析出 D加酒精可使溶解的丝状物再被析出3.在“DNA的粗提取与鉴定”实验中，向5mL血细胞液中加入20mL蒸馏水的目的是A.使血细胞破裂 B.防止血液凝固 C
8、.析出DNA D.使蛋白质与DNA分离4.在NaCl溶液中反复溶解、析出并过滤，就能除去DNA溶液中的杂质的理由不包括 ( ) A用高浓度盐溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质 B用低浓度盐溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质 C反复操作就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质 D反复操作就能够使各种杂质变性而沉淀析出典例引路在采用鸡血为材料对DNA进行粗提取的实验中，如果需要进一步提取杂质较少的DNA，可以依据的原理是( )A.在物质的量浓度为0.14 mol/L的氯化钠溶液中DNA的溶解度最小B.DNA遇二苯胺在沸水浴的条件下会变成蓝色C.DNA不溶于酒精而细胞中的一些物质
9、易溶于酒精D.质量浓度为0.1 g/mL的柠檬酸钠溶液具有抗凝血作用有关DNA粗提取的操作，错误的是A向溶解DNA的烧杯中加蒸馏水的目的是漂洗DNABDNA和杂质分子在95%的冷酒精中溶解度存在差异C提取植物细胞DNA时需在研钵中加入洗涤剂和氯化钠等试剂D提取动物细胞DNA时可用鸡血与蒸馏水混合后用玻璃棒搅拌 归纳总结1.鸡血细胞的DNA提取2.实验关键(1) 取材不用哺乳动物的血细胞( 由于成熟红细胞无细胞核)。(2)获取 DNA 时要向鸡血细胞液加入足量的蒸馏水，以便使细胞膜和核膜破裂，把核内物质释放出来。(3)实验中的搅拌，除最后一次搅拌外，其余搅拌均要朝一个方向。并且，在析出 DNA、
10、DNA 再溶解和提取中，各步骤搅拌都要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯底部，防止 DNA 分子断裂。3.此实验过程中有几次使用蒸馏水？几次过滤，几次析出，几次搅拌？答：整个实验共“两次蒸馏水，三次过滤，两次析出”两次蒸馏水第一次：细胞吸水胀破 第二次：使 DNA黏稠物析出 三次过滤第一次： DNA存在于滤液里 第二次： DNA被留在纱布上 第三次： DNA存在于滤液里 过滤时使用的纱布层数与需用滤液或黏稠物有关，第二次要用其滤出的黏稠物有关，所以要使用多层纱布，第一次和第三次均要用其滤液，使用的纱布为12层两次析出第一次：用0.14 molL 的NaCl溶液,含杂质多第二次：用冷却的95的酒精 4.预
11、冷的酒精溶液具有的优点抑制核酸水解酶活性，防止 DNA 降解。降低分子运动易于形成沉淀析出。低温有利于增加 DNA 分子柔韧性，减少断裂。5.评价：观察你提取的DNA颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多；二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备本实验提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质6.酒精的使用观察花生种子子叶细胞脂肪颗粒时，用体积分数为50的酒精洗去浮色叶绿体色素的提取和分离实验中，用无水酒精作有机溶剂提取色素制作洋葱根尖细胞装片时，用盐酸和酒精的混和液对根尖进行解离DNA粗提取过程中，用
12、体积分数为95的冷却酒精可以进一步纯化DNA70%的酒精用于消毒，如果酒的制作 变式训练（多选）下列DNA粗提取的实验操作中，经离心或过滤后取上清液或滤液的有A在新鲜鸡血中加入适量的柠檬酸钠，混合均匀后离心B在盛有血细胞的塑料烧杯中加蒸馏水，快速搅拌后过滤C在2molL的氯化钠溶液中放入丝状物，轻轻搅拌后过滤 D在溶有DNA的氯化钠溶液中缓缓加入蒸馏水，轻轻搅拌后过滤当堂反馈1.下列关于 DNA 粗提取与鉴定的说法中，正确的是A.析出 DNA 时要缓慢地加蒸馏水，当析出黏稠物时即不再加水B.在探究洗涤剂对植物细胞 DNA 提取的影响实验中，自变量是洗涤剂和食盐C.提取的 DNA 溶解后加入二苯
13、胺试剂即可染成蓝色D.将含有 DNA 的滤液放在 6075的恒温水浴箱中保温后过滤，能去除蛋白质杂质2.（多）“DNA粗提取与鉴定”实验中，将含有一定杂质的DNA丝状物分别放入体积为2mL 的四种溶液中，经搅拌后过滤，获得4种滤液，含DNA较少的是 1蒸馏水中搅拌后过滤滤液E 2 2molL的NaCl溶液搅拌后过滤滤液F 3 O14molL的NaCl溶液中搅拌后过滤滤液G 4冷却的95的酒精溶液中搅拌后过滤滤液H A滤液E B滤液F C滤液G D滤液H3.在DNA的粗提取与鉴定试验中，有两次DNA的沉淀析出，其依据的原理是 DNA在NaCl的物质的量的浓度为O.1 4molL时，溶解度最低 D
14、NA在冷却的体积分数为95的酒精中能沉淀析出 A两次都是 B两次都是C第一次是，第二次是 D第一次是，第二次是4.（多选）有关DNA粗提取的操作，正确的是A盛放鸡血细胞液的容器最好是塑料容器B将鸡血细胞液与蒸馏水混合，用玻璃棒沿一个方向快速搅拌，释放DNAC向溶解DNA的烧杯中加蒸馏水的目的是漂洗DNAD用漏斗和滤纸过滤析出的DNA，得到DNA粘稠物5.在DNA粗提取实验中，为得到含DNA的黏稠物，某同学进行了如下操作：在新鲜鸡血中加入适量的柠檬酸钠，经离心后，除去血浆留下血细胞备用。取510mL血细胞放入50mL的塑料烧杯中，并立即注入20mid015molL的氯化钠溶液，快速搅拌5min后
15、经滤纸过滤，取得其滤液。滤液中加人40mL2molL的氯化钠溶液，并用玻璃棒一个方向快速搅拌lmin。上述溶液中缓缓加人蒸馏水，同时用玻璃棒沿一个方向不停地轻轻搅拌，同时加蒸馏水，直到溶液中出现丝状物为止，再进行过滤而得到含DNA的黏稠物。 实验结果是：所得含DNA的黏稠物极少，导致下一步实验无法进行。 请指出并改正该同学的实验操作上的三个错误：(3分) ， ， 。(2)按正确操作提取和过滤黏稠物后，再溶解黏稠物所用的溶剂为 (标明浓度)；提取含杂质较少的DNA的方法是 。 (3)鉴定DNA的试剂是 试剂，DNA鉴定时对照实验的设置方法为 。(2分)(4)采用牛或羊的血液做实验，取材方便，但即
16、使正确操作也无法提取到DNA，而用动物的肝脏组织作为实验材料，实验结果良好，原因是 ，实验中最好增加一步骤为 。 （10分）（1）0.015mol/L的氯化钠溶液应改为蒸馏水；滤纸应改为纱布；直到溶液中出现丝状物为止应改为直到溶液中丝状物不再增加为止（每项1分）（2）2mol/L的NaCl溶液 加入冷却的、体积分数为95%的酒精（3）二苯胺 向试管中只加0.015mol/L的NaCl溶液和二苯胺试剂，不加DNA，沸水浴（4）哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核 研磨提取鸡血细胞的细胞核物质 将制备好的鸡血细胞液5 mL10mL，注入到50 mL烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20 mL，同时用玻璃棒充分搅
17、拌5 min，使血细胞加速破裂。然后，用放有纱布的漏斗将血细胞液过滤至500mL。取其滤液。溶解细胞核内的DNA 将氯化钠的物质的量浓度为 2 mol/L 40mL加入到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌1min，使其混合均匀，这时DNA在溶液中呈溶解状态析出含DNA的粘稠物 沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现，注意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水，溶液中出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水（这时溶液中氯化钠的物质的量浓度相当于0.14 molL）滤取含DNA的粘稠物 用放有多层纱布的漏斗，过滤步骤3中的溶液至 500mL的烧杯中
18、，含 DNA的粘稠物被留在纱布上将DNA的粘稠物再溶解 取 1个 50 mL烧杯，向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为 2 molL的溶液 20mL。用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，用玻璃择不停地搅拌，使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中过滤含有DNA的氯化钠溶液 取1个100 mL烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤步骤5中的溶液。取其滤液，DNA溶于滤液中提取含杂质较少的DNA 在上述滤过的溶液中，加入冷却的、酒精的体积分数为 95的溶液 50mL（使用冷却的酒精，对DNA的凝集效果较佳），并用玻璃棒搅拌，溶液中会出现含杂质较少的丝状物。用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物的主要成分就是DNA DNA的鉴定