第08章电泳技术hu.ppt

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1、第八章 电泳技术,第八章 电泳技术,第一节 电泳技术发展简史 第二节 电泳的基本原理 第三节 影晌电泳分离的主要因素 第四节 电泳的分类 第五节 各种电泳技术介绍 第六节 电泳测纯技术,第一节 电泳技术发展简史,1809年，俄国物理学家首次发现电泳现象。他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极，加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变混浊，即带负电荷的粘土颗粒向正极移动，这就是电泳现象。 1909年，Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。,1937年，瑞典Uppsala大学的Tiselius对电泳仪器作了改进，

2、创造了Tiselius电泳仪，建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法，并首次证明了血清是由白蛋白及、球蛋白组成的，由于Tiselius在电泳技术方面作出的开拓性贡献而获得了1948年的诺贝尔化学奖。 1948年，Wieland和Fischer重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法，对氨基酸的分离进行了研究。,上世纪50年代起，特别是1950年，Durrum用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后，开创了利用各种固体物质（如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等）作为支持介质的区带电泳方法。 1959年，Raymond和Weintraub利用人工合成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳，极

3、大地提高了电泳技术的分辨率，开创了近代电泳的新时代。,聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学和分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分析鉴定技术，是检验生化物质的最高纯度：即“电泳纯”（一维电泳一条带或二维电泳一个点）的标准分析鉴定方法，至今仍被人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的最后、最准确的手段，即“Last Check”。 上个世纪80年代发展起来的毛细管电泳技术，是化学和生化分析鉴定技术的重要新发展，己受到人们的充分重视。,第二节 电泳的基本原理,电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。 许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离

4、基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。,电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。,电泳过程必须在一种支持介质中进行。 Tiselius等在1937年进行的自由界面电泳没有固定支持介质，所以扩散和对流都比较强，影响分离效果。 样品在固定的介质中进行电泳过程，减少了扩散和对流等干扰作用。 支持介质：滤纸、醋酸纤维素膜、硅胶薄层平板、淀粉凝胶、琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等。,电泳装置主要包括两个

5、部分：电源和电泳槽。 电源提供直流电，在电泳槽中产生电场，驱动带电分子的迁移。 电泳槽可以分为水平式和垂直式两类。 垂直板式电泳是较为常见的一种，常用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白质的分离。,稀溶液中，电场对带电分子的作用力（F）等于分子所带净电荷量（q）与电场强度（E）的乘积。即： FqE 带电分子移动过程中，会受到介质粘滞力的阻碍。粘滞力（F）的大小与分子大小、形状、电泳介质孔径大小以及缓冲液粘度等有关，并与带电分子的移动速度成正比，对于球状分子，F的大小服从Stoke定律，即：F=6r r是球状分子的半径，是缓冲液粘度（或介质粘滞系数），是电泳速度(单位：cm/s )。,当带电分子匀速移动时

6、： F = F qE = 6r =qE/6r 电泳迁移率（m）：单位电场强度下的迁移速度： m = /E = q/6r 电泳迁移率与带电分子所带净电荷成正比，与分子的大小和缓冲液的粘度成反比。,带电分子由于各自的电荷和形状大小不同，因而在电泳过程中具有不同的迁移速度，形成了依次排列的不同区带而被分开。 即使两个分子具有相似的电荷，如果它们的分子大小不同，由于它们所受的阻力不同，因此迁移速度也不同，在电泳过程中就可以被分离。 有些类型的电泳几乎完全依赖于分子所带的电荷不同进行分离，如等电聚焦电泳； 有些类型的电泳则主要依靠分子大小的不同即电泳过程中产生的阻力不同而得到分离，如SDS-聚丙烯酰胺凝

7、胶电泳。,第三节 影晌电泳分离的主要因素,3.1 待分离生物大分子的性质 3.2 缓冲液的性质 3.3 电场强度 3.4 电渗 3.5 支持介质的筛孔,3.1 待分离生物大分子的性质 待分离生物大分子所带的电荷、分子大小和性质都会对电泳有明显影响。 一般来说，分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。 3.2 缓冲液的性质 主要是指电极溶液（缓冲溶液）和蛋白质样品溶液的pH值、离子强度和粘度等。,3.2.1 pH值 溶液pH值决定带电颗粒的解离程度，也即决定其带净电荷的量。 对两性电解质（如蛋白质）而言，溶液的pH值离其等电点越远，带净电荷量就越多，泳动速度就越快。

8、缓冲液pH还会影响到其电泳方向，当缓冲液pH大于两性电解质的等电点，两性电解质带负电荷，其电泳的方向是指向正极。 电泳时应选择适宜的pH值，并需采用缓冲溶液，使溶液的pH值恒定。,3.2.2 离子强度 为了保持电泳过程中待分离生物大分子的电荷以及缓冲液pH值的稳定性，缓冲液通常要保持一定的离子强度，一般在0.020.2。 离子强度过低，则缓冲能力差，往往会因溶液pH值变化而影响泳动的速率。 离子强度过高，会在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层（即离子氛），由于离子氛与待分离分子的移动方向相反，它们之间产生了静电引力，因而引起电泳速度降低。,离子强度的计算公式为： I1/2mizi2

9、=1/2(m1z12+m2z22+mnzn2) I：溶液的离子强度； mi：离子的摩尔浓度； zi：离子的价数；1，2，n代表各种离子。 3.2.3 溶液粘度 泳动度与溶液粘度是成反比关系。粘度过大或过小，必然影响泳动度。,3.3 电场强度 电场强度（V/cm）是每厘米的电位降，也称电位梯度。电场强度越大，电泳速度越快。但增大电场强度会引起通过介质的电流强度增大，而造成电泳过程产生的热量增大。电流在介质中所做的功（W）为： W=I2Rt I为电流强度，R为电阻，t为电泳时间。,电流所作的功绝大部分都转换为热，因而引起介质温度升高，这会造成很多影响： 样品和缓冲离子扩散速度增加，引起样品分离带的

10、加宽； 产生对流，引起待分离物的混合； 如果样品对热敏感，会引起蛋白变性； 引起介质粘度降低、电阻下降等等。,电泳中产生的热通常是由中心向外周散发的，介质中心温度一般要高于外周，尤其是管状电泳，由此引起中央部分介质相对于外周部分粘度下降，摩擦系数减小，电泳迁移速度增大，电泳分离带通常呈弓型。 电场强度或电极缓冲液中离子强度增高时，电流强度会随着增大。不仅降低分辨率，而且在严重时会烧断滤纸或熔化琼脂糖凝胶支持物。,电流强度过低，生热少，电泳时间延长，引起待分离生物大分子扩散的增加而影响分离效果。 电泳实验中要选择适当的电场强度，同时可以适当冷却降低温度以获得较好的分离效果。,3.4 电渗 当支持

11、物不是绝对惰性物质时，常常会有一些离子基团如羧基、磺酸基、羟基等吸附溶液中的正离子，使靠近支持物的溶液相对带电。在电场作用下，此溶液层会向负极移动。反之，若支持物的离子基团吸附溶液中的负离子，则溶液层会向正极移动。这种溶液层的泳动现象称为电渗。,电泳电场中，液体也会相对固体支持介质发生移动，出现电渗现象。在pH值高于3时，玻璃表面带负电，吸附溶液中的正电离子，引起玻璃表面附近溶液层带正电，在电场的作用下，向负极迁移，带动电极液产生向负极的电渗流。 当颗粒的泳动方向与电渗方向一致时，则加快颗粒的泳动速度；当颗粒的泳动方向与电渗方向相反时，则降低颗粒的泳动速度。,3.5 支持介质的筛孔 支持介质的

12、筛孔大小（如：琼脂和聚丙烯酰胺凝胶都有大小不等的筛孔）对待分离生物大分子的电泳迁移速度有明显的影响。 在筛孔大的介质中泳动速度快，反之，则泳动速度慢。 除上述影响泳动速度的因子外，温度和仪器装置等因子的影响也应考虑。,第四节 电泳的分类,4.1 电泳按其分离的原理分类 4.2 按支持介质的分类 4.3 按支持介质形状分类 4.4 按用途分类 4.5 按所用电压分类,4.1 电泳按其分离的原理分类 区带电泳：电泳过程中，待分离的各组分在支持介质中被分离成许多条明显的区带，应用最广。 自由界面电泳： 这是瑞典Uppsala大学的著名科学家Tiselius最早建立的电泳技术，是在形管中进行电泳，无支

13、持介质，分离效果差，已被取代。 等速电泳：需使用专用电泳仪，电泳平衡后，各电泳区带相随，分成清晰界面，以等速向前运动。 等电聚焦电泳：两性电解质在电场中自动形成pH梯度，当被分离的生物大分子移动到各自等电点的pH处聚集成很窄的区带。,4.2 按支持介质分类 纸电泳（Paper electrophorisis） 醋酸纤维薄膜电泳（Cellulose Acetate electrophoresis） 琼脂凝胶电泳（Agar Gel electrophoresis） 聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel electrophoresis，PAGE） SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SD

14、S-PAGE）。,4.3 按支持介质形状分类 薄层电泳 ； 板电泳 ； 柱电泳。 4.4 按用途分类 分析电泳； 制备电泳； 定量免疫电泳； 连续制备电泳。 4.5 按所用电压分类 低压电泳：100V500V，电泳时间较长，适于分离蛋白质等生物大分子。 高压电泳：1000V5000V，电泳时间短，有时只需几分钟，多用于氨基酸、多肽、核苷酸和糖类等小分子物质的分离。,第五节 各种电泳技术介绍,5.1 纸电泳（paper electrophoresis） 5.2 醋酸纤维薄膜电泳 5.3 琼脂糖凝胶电泳 5.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳 5.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） 5.6 梯

15、度凝胶电泳 5.7 等电聚焦 5.8 二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（2D-PAGE） 5.9 毛细管电泳 5.10 免疫电泳 immunoelectrophoresis 5.11 细胞电泳 5.12 电泳应用法 ion（t）ophoretic administra-tion， electrophoretic administration 5.13 差异凝胶电泳,5.1 纸电泳（paper electrophoresis） 纸电泳是在渗透了缓冲液的滤纸上加上电场使物质移动的一种区带电泳法。也就是把样品以带状加在作为支持体的滤纸内来检测其移动和分离的方法。滤纸悬垂或水平地支在支持板上。 分辨率比凝胶介质

16、要差，但操作简单，所以仍有很多应用，特别是在血清样品的临床检测和病毒分析等方面有重要用途。,电泳完毕记下滤纸的有效使用长度，然后烘干，用显色剂显色。 定量测定的方法有洗脱法和光密度法。 洗脱法是将确定的样品区带剪下，用洗脱剂洗脱后进行比色或分光光度测定。 光密度法是将染色后的干滤纸用光密度计直接定量测定各样品电泳区带的含量。,5.2 醋酸纤维薄膜电泳 与纸电泳相似，不同之处在于醋酸纤维薄膜为支持介质。将纤维素的羟基乙酰化为醋酸酯，溶于丙酮后涂布成的均一细密微孔的薄膜。 操作简单、快速、价廉，广泛用于分析检测血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、体液、脊髓液、脱氢酶、多肽、核酸及其他生物大分

17、子，为心血管疾病、肝硬化及某些癌症鉴别诊断提供了可靠的依据，因而已成为医学和临床检验的常规技术。,正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图 1：清蛋白；2：1-球蛋白；3：2-球蛋白；4：-球蛋白；5：-球蛋白；6：点样原点,醋酸纤维薄膜电泳与纸电泳相比的优点： 对蛋白质样品吸附极少，无“拖尾”现象。 快速省时。亲水性小，吸水少，电渗作用小。 灵敏度高，样品用量少。临床医学用于检测微量异常蛋白的改变。 应用面广。可用于那些纸电泳不易分离的样品，如胎儿甲种球蛋白、溶菌酶、胰岛素等。 醋酸纤维薄膜电泳染色后，用乙酸、乙醇混合液浸泡后可制成透明的干板，有利于光密度计和分光光度计扫描定量及长期保存。,5.3

18、 琼脂糖凝胶电泳 天然琼脂（agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（agarose，约80%）及琼脂胶（agaropectin）组成。 琼脂胶是含硫酸根和羧基的强酸性多糖，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。 琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。,琼脂糖凝胶电泳优点： （1）琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可以进行电泳。 （2）琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占98%99%），近似自由电泳，样品扩散较自由，对样品吸附极微，电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。 （3）琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用

19、紫外光灯检测及定量测定。 （4）电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。,琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结构，这种交联的结构使琼脂糖凝胶有较好的抗对流性质。 琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来控制，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。 琼脂糖凝胶通常是形成水平式板状凝胶，用于等电聚焦、免疫电泳等蛋白质电泳，以及DNA、RNA的分析。垂直式电泳应用得相对较少。,5.3.1 蛋白质的琼脂糖凝胶电泳 1的琼脂糖凝胶的孔径对于蛋白质来说比较大，对蛋白质的阻碍作用较小。此时蛋白质分子大小对电泳迁移率的影响相对较小，适用于忽略蛋

20、白质大小而只根据蛋白质天然电荷来进行分离的电泳技术，如免疫电泳、平板等电聚焦电泳等。 常用琼脂糖作为电泳支持物，分离蛋白质和同工酶。将琼脂糖电泳与免疫化学相结合，发展成免疫电泳技术，能鉴别其他方法不能鉴别的复杂体系；超微量技术，可检出0.1g蛋白质。,5.3.2 核酸的琼脂糖凝胶电泳 用于分离、鉴定核酸、提纯DNA片段等。如DNA鉴定，DNA限制性内切核酸酶图谱制作等。 操作简单、迅速，能分辨其它方法不能分开的DNA片段混合物，分开的DNA可用低浓度的萤光染料（0.5g/ml溴化乙锭）染色，在紫外灯下直接观察检测少至1ng的DNA。 对核酸的分离作用主要是依据它们的相对分子量质量及分子构型，同

21、时与凝胶的浓度密切关系。,DNA迁移率取决于以下参数： DNA分子的大小 线状双链DNA分子通过凝胶的速率与其分子量的常用对数成反比。 用已知分子量的标准物质和待测分子量的DNA片段同时电泳，比较其电泳速率，可求出待测片段大小。DNA分子超过20kb时，电泳迁移率不再依赖于分子大小。,琼脂糖浓度 不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。,DNA构型 不同构型DNA的移动速度次序为：供价闭环DNA（covalently closed circular，cccDNA）直线DNA开环的双链环状DNA。 琼脂糖浓度太高时，环状DNA（一般为球形）不能进入胶中，相对迁移率为0，而同等大小

22、的直线双链DNA（刚性棒状）则可以长轴方向前进。,电压 低电压时，线状DNA片段的迁移率与所用电压成正比。 电压增高时，大分子量DNA片段迁移率的增大是不同的，琼脂糖凝胶的有效分离范围随电压增大而减小。 为了获得DNA片段的最大分辨力，凝胶电泳时电压不应超过5V/cm。,5.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳 简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。,1：样品胶pH6.7 2：浓缩胶pH6.7 3：分离胶pH8.9 4：电极缓冲液pH8.3,聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图 (A为正面,B为剖面),夹心垂直板电泳槽示意图 1.导线

23、接头 2.下贮槽 3.凹形橡胶框 4.样品槽模板 5.固定螺丝 6.上贮槽 7.冷凝系统,凝胶模示意图,5.4.1 聚丙烯酰胺凝胶的聚合 聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺（acrylamide，简称Acr）和甲叉双丙烯酰胺（N,Nmethylene-bisacylamide，简称Bis）聚合而成，这一聚合过程需要有自由基催化完成。 常用的催化聚合方法有两种：化学聚合和光聚合。,化学聚合：通常是加入催化剂过硫酸铵（ammonium persulfate， (NH4)2S2O8，简称AP）以及加速剂四甲基乙二胺（N,N,N,N-tetramethyl ethylenedia mine，简称TEME

24、D） TEMED催化过AP产生自由基：,光聚合：催化剂是核黄素（ribofavin，即vita min B2，C17H20O6N4），核黄素在光照下能够产生自由基，催化聚合反应。一般光照23小时即可完成聚合反应。,聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度来控制，丙烯酰胺的浓度可以在330之间。 低浓度的凝胶具有较大的孔径，如3的聚丙烯酰胺凝胶对蛋白质没有明显的阻碍作用，可用于平板等电聚焦或SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩胶，也可以用于分离DNA； 高浓度凝胶具有较小的孔径，对蛋白质有分子筛的作用，可以用于根据蛋白质的分子量进行分离的电泳中，如1020的凝胶常用于SDS-聚丙

25、烯酰胺凝胶电泳的分离胶。,聚丙烯酰胺凝胶的强度、弹性、透明度、粘度和孔径大小均取决于两个重要参数T和C，T是丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺两个单体的总百分浓度。C是与T有关的交联百分浓度。T与C的计算公式是： T=（a+b）/m C=b/(a+b) a：丙烯酰胺的克数，b：甲叉双丙烯酰胺的克数，m：水或缓冲液体积（mL）。 a与b的重量比应在30左右，此时凝胶富有弹性，且完全透明。,选择T和C的经验公式是： C = 6.50.3T T：520。C值并不很严格，可变化的范围约为 1； 当C保持恒定时，凝胶的有效孔径随着T的增加而减小； 当T保持恒定，C为4时，有效孔径最小，C大于或小于4时，有效孔径均

26、变大，C大于5时凝胶变脆，不宜使用。 实验中最常用的C是2.6和3。,配成30的丙烯酰胺水溶液在4下能保存1个月，在贮存期间丙烯酰胺会水解为丙烯酸而增加电泳时的电内渗现象并减慢电泳的迁移率。 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是一种对中枢神经系统有毒的试剂，操作时要避免直接接触皮肤，但它们聚合后则无毒。,5.4.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点 目前尚无更好的支持介质能够取代丙烯酰胺凝胶。主要的优点有： 可以控制胶浓度“T”和交联度“C”，从而得到不同的有效孔径，用于分离不同分子量的生物大分子。,能把分子筛作用和电荷效应结合在同一方法中，达到更高的灵敏度：10-9 10-12 mol/L。 由于聚丙烯酰胺凝

27、胶是由CC键结合的酰胺多聚物，侧链只有不活泼的酰胺基CONH2 ，没有带电的其他离子基团，化学惰性好，因而电渗作用比较小，不易和样品相互作用。 高纯度的单体原料制备容易，电泳分离的重复性好。,在一定浓度范围聚丙烯酰胺对热稳定。透明度好，便于照相和复印。机械强度好，有弹性，不易碎，便于操作和保存。 无紫外吸收，不染色就可以用于紫外波长的凝胶扫描作定量分析。 还可以用作固定化酶的惰性载体。,5.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） 最常用的定性分析蛋白质的电泳方法，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。 5.5.1 SDS-PAGE原理 SDS-PAGE 是在要走电泳的样品中加

28、入含有SDS和-巯基乙醇的样品处理液。 强还原剂-巯基乙醇可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键，破坏蛋白质的四级结构。 SDS（十二烷基磺酸钠），是一种阴离子表面活性剂（即去污剂），它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。,电泳样品加入样品处理液后，沸水浴35 min，使SDS与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构。 SDS与蛋白质结合后使蛋白质-SDS复合物上带有大量的负电荷，平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子；蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖，消除蛋白质本身电荷上的差异。 样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料，用于控制电泳过程。另外样品处理液中也

29、可加入适量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加样时样品溶液可以沉入样品凹槽底部。,5.5.2 SDS-PAGE制备 制备凝胶时首先要根据待分离样品的情况选择适当的分离胶浓度 分离胶聚合后，通常在上面加上一层浓缩胶（约1 cm），并在浓缩上插入样品梳，形成上样凹槽。 浓缩胶是低浓度的聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺浓度通常为35），具有较大的孔径，各种蛋白质都可以不受凝胶孔径阻碍而自由通过。 浓缩胶通常pH值较低（通常pH = 6.8），用于样品进入分离胶前将样品浓缩成很窄的区带。浓缩胶聚合后取出样品梳，上样后即可通电开始电泳。,5.5.3 SDS-PAGE系统 聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

30、有两种系统：只有分离胶的连续系统和有浓缩胶与分离胶的不连续系统。 不连续系统中最典型、国内外均广泛使用的是著名的Ornstein-Davis高pH碱性不连续系统，其浓缩胶丙烯酰胺浓度为4，pH = 6.8，分离胶的丙烯酰胺浓度为12.5，pH = 8.8。电极缓冲液的pH = 8.3，用Tris、SDS和甘氨酸配制。配胶的缓冲液用Tris、SDS和HCl配制。,不连续系统浓缩效应示意图,SDS-PAGE电泳过程示意图 A：电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子，慢离子 B：电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。 C：显示蛋白质样品分离成数个区带。,SDS-聚丙烯酰胺凝

31、胶电泳还可以用于未知蛋白分子量的测定，在同一凝胶上对一系列已知分子量的标准蛋白及未知蛋白进行电泳，测定各个的标准蛋白的电泳距离（或迁移率），并对各自分子量的对数（log Mr）作图，即得到标准曲线。 测定未知蛋白质的电泳距离（或迁移率），通过标准曲线可以求出未知蛋白的分子量。,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测，纯化的蛋白质通常在SDS电泳上应只有一条带，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏度，一般只需要不到微克量级的蛋白质，而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况，这些信息对于了解未

32、知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的。,5.6 梯度凝胶电泳 梯度凝胶电泳也通常采用聚丙烯酰胺凝胶，但不是在单一浓度（孔径）的凝胶上进行，而是形成梯度凝胶。 从凝胶顶部到底部丙烯酰胺的浓度呈梯度变化，如通常顶部浓度为5，底部浓度为25。 凝胶梯度是通过梯度混合器形成的，高浓度的丙烯酰胺溶液首先加入到玻璃平板中，而后溶液浓度呈梯度下降，因此在凝胶的顶部孔径较大，而在凝胶的底部孔径较小。 梯度凝胶电泳也通常加入SDS，并有浓缩胶。电泳过程与SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳基本类似。,梯度凝胶优点： 梯度凝胶比单一浓度凝胶分离范围宽，可同时分离较大范围分子量的蛋白质。 分子量较大的蛋白质可以在凝胶顶部大孔径部

33、分得到分离； 分子量较小的蛋白质可以在凝胶底部小孔径部分得到分离， 如：用430的梯度胶可以分离相对分子质量5万200万的蛋白质。, 梯度凝胶可以分辨分子量相差较小，在单一浓度凝胶中不能分辨的蛋白质。 梯度凝胶孔径逐步变小，在蛋白质不能通透的孔径附近对蛋白有浓缩作用，所以电泳后形成很窄的区带，可以分辨出分子量相差较小的蛋白质。 对于太稀的样品，在电泳过程中可以将样品分几次加样，大小不同的蛋白质分子最终都会滞留在其相应的凝胶孔径中而得到分离。 可直接测定天然状态蛋白质的分子量而不需要解离为亚基，可以与SDS-PAGE测定分子量的方法互为补充。,梯度凝胶电泳主要适用于测定球蛋白的分子量，而对纤维蛋

34、白将产生较大的误差。 由于分子量的测定必须是在未知和标准蛋白质分子到达完全被阻止迁移的孔径时才能成立，因此电泳时要使用较高的电压。 例如平板凝胶为0.5mm厚，使用600V电压， 50mA电流，电泳时间约需2小时。,5.7 等电聚焦 等电聚焦技术是一种根据样品的等电点（pI）不同而使它们在pH梯度中相互分离的一种电泳技术。,本法的分辩率极高，所以在进行等电聚焦电泳时，要求样品不能过于复杂，一般应经其他方法（如层析法）提纯后再进行等点聚焦，才能得到比较满意的结果。 等电聚焦电泳可以分辨出等电点相差0.01的蛋白质，是分离两性物质如蛋白质的一种理想方法。 两性电解质是人工合成的一种复杂的多氨基多羧

35、基的混合物。不同的两性电解质有不同的pH梯度范围，既有较宽的范围如pH310，也有各种较窄的范围如pH78。 两性电解质的pH范围越小，分辨率越高。,等电聚焦具有很高的灵敏度，特别适合于研究蛋白质微观不均一性. 例1：一种蛋白质在SDS-PAGE中表现单一带，而在等电聚焦中表现三条带。 解析：可能是蛋白质存在单磷酸化、双磷酸化和三磷酸化形式。由于几个磷酸基团不会对蛋白质的分子量产生明显的影响，因此SDS-PAGE表现单一带，但由于它们所带的电荷有差异，所以在等电聚焦中可以被分离检测到。 例2：同功酶之间可能只有一两个氨基酸的差别，利用等电聚焦也可以得到较好的分离效果。,等电聚焦还可以用于测定某

36、个未知蛋白质的等电点。 将一系列已知等电点的标准蛋白（通常pI在3.510之间）及待测蛋白同时进行等电聚焦。 测定各个标准蛋白电泳区带到凝胶某一侧边缘的距离对各自的pI值作图，即得到标准曲线。 而后测定待测蛋白的距离，通过标准曲线即可求出其等电点。,5.8 二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（2D-PAGE） 二维聚丙烯酰胺凝胶电泳技术结合了等电聚焦技术（根据蛋白质等电点进行分离）以及SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术（根据蛋白质的大小进行分离）。 这两项技术结合形成的二维电泳是分离分析蛋白质最有效的一种电泳手段。,通常第一维电泳是等电聚焦，在细管中（13 mm）中加入含有两性电解质、8M的脲以及非离子型去污剂

37、的聚丙烯酰胺凝胶进行等电聚焦，变性的蛋白质根据其等电点的不同进行分离。 将凝胶从管中取出，用含有SDS的缓冲液处理30 min，使SDS与蛋白质充分结合。 将处理过的凝胶条放在SDS-PAGE浓缩胶上，加入丙烯酰胺溶液或熔化的琼脂糖溶液使其固定并与浓缩胶连接。 第二维电泳过程中，结合SDS的蛋白质从等电聚焦凝胶中进入SDS聚丙烯酰胺凝胶，在浓缩胶中被浓缩，在分离胶中依据其分子量大小被分离。这样各个蛋白质根据等电点和分子量的不同而被分离、分布在二维图谱上。,细胞提取液的二维电泳可以分辨出10002000个蛋白质，有些报道可以分辨出500010000个斑点，这与细胞中可能存在的蛋白质数量接近。 二

38、维电泳是一项很需要技术并且很辛苦的工作。目前已有一些计算机控制的系统可以直接记录并比较复杂的二维电泳图谱。,生物学问题的提出,实验模型的设计,实验组和对照组样品的制备,蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离,图像扫描和初步分析,感兴趣蛋白点的切取,胰酶对脱色后蛋白质的消化,质谱的多肽指纹图、微测序分析,质谱结果的生物信息学分析和比对,新蛋白质的发现,其它实验的进一步验证,蛋白信息的初步获得,检测蛋白质最常用的染色剂是考马斯亮蓝R-250（CBB，Coomassie brilliant blue），在聚丙烯酰胺凝胶中可以检测到0.1 mg的蛋白质形成的染色带。 银染是比考马斯亮蓝染色更灵敏的一种方法

39、，银染的灵敏度比考马斯亮蓝染色高100倍，可以检测低于1 ng的蛋白质。 糖蛋白通常使用过碘酸Schiff试剂（PAS）染色，但PAS染色不十分灵敏，染色后通常形成较浅的红粉红带，难以在凝胶中观察。 糖蛋白灵敏的检测方法是凝胶印迹后用凝集素。,5.9 毛细管电泳 5.9.1 毛细管电泳的发展史 毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE)又叫高效毛细管电泳(HPCE)，是近年来发展最快的分析方法之一。 1981年Jorgenson和Lukacs创立了现代毛细管电泳 1984年Terabe等建立了胶束毛细管电动力学色谱 1987年Hjerten 建立了毛细管等电聚焦,

40、 Cohen和Karger提出了毛细管凝胶电泳。,高效毛细管电泳仪实图,19881989年出现了第一批毛细管电泳商品仪器。 CE在生命科学各领域中对多肽、蛋白质(包括酶，抗体)、核苷酸乃至脱氧核糖核酸(DNA)的分离分析要求, 得到了迅速的发展。,5.9.2 毛细管电泳的特点 CE是利用被分析离子在电场作用下移动的速率不同而达到分离的目的，这种技术主要用来分析在毛细管缓冲溶液中能离解为离子的物质。是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物。 CE除了比其它色谱分离分析方法具有效率更高、速度更快、样品和试剂耗量更少、应用面同样广泛等优点。,CE的优点可概括为三高二少： 高灵敏度, 常用紫外检测器的

41、检测限可达10-1310-15mol，激光诱导荧光检测器则达10-1910-21mol； 高分辨率, 其每米理论塔板数为几十万；高者可达几百万乃至千万, 而HPLC一般为几千到几万； 高速度, 最快可在60s内完成, 在250s内分离10种蛋白质, 1.7min分离19种阳离子, 3min内分离30种阴离子； 样品少, 只需nL (10-9 L)级的进样量； 成本低, 只需少量(几毫升)流动相和价格低廉的毛细管。 CE成为近年来发展最迅速的分离分析方法之一。有些理论研究和实际应用正在进行与开发。,5.9.3 毛细管电泳基本原理 CE和一般电泳法的区别在于使用毛细管柱。在熔融石英毛细管内壁覆盖一

42、层硅氧基（Si-O）阴离子，由于吸引了溶液中的阳离子，由此在毛细管内壁形成表面带阴离子的双电层。层外缘扩散层中富集的阳离子被阴极吸引导致溶液向阴极的流动，这种效应称为电渗（electroosmosis）。,电渗流的速度ueo和电场强度E成正比，定义电渗淌度eo。 eo=ueo/E 电渗淌度与硅氧层表面的电荷密度成正比，与离子强度的平方根成反比。 在低pH条件下，硅氧层形成分子（Si-OH），因而减少了表面电荷密度，故电渗速度减小。如在pH=9的绷砂缓冲液中电渗淌度约2mm/s ，而在pH=3介质中电渗淌度减小约一个数量级。,淌度：溶质在单位时间内、单位电场上移动的距离,影响电渗的一个重要因素是

43、毛细管中因电流作用产生的焦耳热，能使得柱中心的温度高于边缘的温度，形成抛物线型的温度梯度，管壁附近温度低，中心温度高，结果使电渗淌度不均匀而造成区带变宽，柱效降低。 应避免使用过长和内径大于50m 的毛细管柱，减小毛细管的壁厚、选择适宜的电压和缓冲液及使用良好的冷却系统。,CE 中观察到的离子速度是离子的电泳淌度eo和溶液的电渗淌度ep的加和。定义为表观淌度app，则 app=ep +eo 带正电荷的离子的ep0，eo0，故app总是为正号，离子向阴极移动； 带负电荷的离子受电泳流的影响被阴极排斥，ep0 在高pH条件下，若eoep，app仍为正号，离子仍然可向阴极移动， 低pH条件下，app

44、可为负号，离子将向反方向移动。此时必须改变电场方向，方可检测到欲分析的离子。,对于实际淌度为net 的组分 app=net/E = （Ld /t）/（V /Lt） Ld：从进样口到检测器的实际柱长；Lt ：总柱长；V：电压；t：所需的分析时间。 实际测试电渗淌度时可用中性组分，此时 ep=0, eo=app, eo =/E = （Ld /t）/（V /Lt）,5.9.4 毛细管电泳基本装置 CE只需高压直流电源、进样装置、毛细管和检测器。前三个部件均易实现, 困难之处在于检测器。 迄今为止, 除了原子吸收光谱、电感耦合等离子体发射光谱(ICP)及红外光谱未用于CE外, 其它检测手段如：紫外、荧

45、光、电化学、质谱、激光等类型检测器均已用于CE。,电渗是CE中推动流体前进的驱动力, 它使整个流体像一个塞子一样以均匀速度向前运动，使整个流型呈近似扁平型的“塞式流”。它使溶质区带在毛细管内原则上不会扩张。 与HPLC类似, CE中应用最广泛的是紫外/可见检测器。 按检测方式可分为固定波长或可变波长检测器和二极管阵列或波长扫描检测器两类。,毛细管电泳仪系统,理论分析表明, 增加速度是减少谱带展宽、提高效率的重要途径, 增加电场强度可以提高速度。但高场强导致电流增加, 引起毛细管中电解质产生焦耳热(自热)。自热将使流体在径向产生抛物线型温度分布, 即管轴中心温度要比近壁处温度高。 溶液粘度随温度

46、升高呈指数下降, 温度梯度使介质粘度在径向产生梯度, 从而影响溶质迁移速度, 使管轴中心的溶质分子要比近管壁的分子迁移得更快, 造成谱带展宽, 柱效下降。 一般来说温度每提高1, 将使淌度增加2% (所谓淌度, 即指溶质在单位时间间隔内和单位电场上移动的距离)。,此外, 温度改变使溶液pH值、粘度等发生变化, 进一步导致电渗流、溶质分子的电荷分布(包括蛋白质的结构)、离子强度等的改变, 造成淌度改变、重复性变差、柱效下降等现象。 降低缓冲液浓度可降低电流强度, 使温差变化减小。高离子强度缓冲液可阻止蛋白质吸附于管壁, 并可产生柱上浓度聚焦效应, 防止峰扩张, 改善峰形。 减小管径在一定程度上缓

47、解了由高电场引起的热量积聚, 但细管径使进样量减少, 造成进样、检测等技术上的困难。因此, 加快散热是减小自热引起的温差的重要途径。液体的导热系数要比空气高100倍。现在有的采用液体冷却方式的毛细管电泳仪可使用离子强度高达0.5mol/L的缓冲液进行分离, 或使用200 直径的毛细管进行微量制备, 仍能达到良好的分离效果和重现性。,5.9.5 毛细管电泳的分离模式 CE现有六种分离模式： . 毛细管区带电泳(capillary zone electrophoresis, CZE)，又称毛细管自由电泳, 是CE中最基本、应用最普遍的一种模式。前述基本原理即是CZE的基本原理。,2. 胶束电动毛细

48、管色谱 (micellar electrokinetic capillary chromatography, MECC) 把一些离子型表面活性剂 (如SDS) 加到缓冲液中, 当其浓度超过临界浓度后就形成有一疏水内核、外部带负电的胶束。 虽然胶束带负电, 但一般情况下电渗流的速度仍大于胶束的迁移速度, 故胶束将以较低速度向阴极移动。 溶质在水相和胶束相(准固定相)之间产生分配, 中性粒子因其本身疏水性不同, 在二相中分配就有差异, 疏水性强的胶束结合牢, 流出时间长, 最终按中性粒子疏水性不同得以分离。 MECC使CE能用于中性物质的分离, 拓宽了CE的应用范围, 是对CE极大的贡献。,3.

49、毛细管凝胶电泳 (capillary gel electrophoresis, CGE) 将板上的凝胶移到毛细管中作支持物进行的电泳。 凝胶具有多孔性,起类似分子筛的作用, 溶质按分子大小逐一分离。 凝胶粘度大, 能减少溶质的扩散, 所得峰形尖锐, 能达到CE中最高的柱效。 常用聚丙烯酰胺在毛细管内交联制成凝胶柱, 可分离、测定蛋白质和DNA的分子量或碱基数, 但其制备麻烦, 使用寿命短。如采用粘度低的线性聚合物如甲基纤维素代替聚丙烯酰胺, 可形成无凝胶但有筛分作用的无胶筛分(Non-Gel Sieving)介质。它能避免空泡形成, 比凝胶柱制备简单,寿命长, 但分离能力比凝胶柱略差。 CGE和无胶筛分已发展成第二代DNA序列测定仪, 在人类基因组计划中起重要作用。,4. 毛细管等电聚焦 (capillar