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1、,蛋白样本制备与免疫印迹 （Immunoblotting technique）,基本概念,印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法,Western Blot基本原理,一种将
2、凝胶电泳与固相免疫结合起来的分子生物学技术。在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。,其基本过程主要有三个工序： 1、将蛋白质经凝胶电泳按分子量大小不同依次分离； 2、将分离的组分转印到印迹膜上； 3、对转印到印迹膜上的蛋白成分进行免疫学检测。,1,2,3,Western Blot一般流程,蛋白样品的制备 蛋白含量测定 蛋白质变性 SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳 转膜 免疫学检测,封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色 曝光、显影、定影,一 蛋白样本制备-成功蛋白分析的基础,1、制备蛋白样本的目的,体外活性测定（in vitro assay） 免疫印迹
3、杂交 (Immunoblot) 免疫沉淀或共沉淀 (Immunoprecipitation) 双向电泳（two-dimensional electrophoresis） 电泳迁移率变动分析 （EMSA） 染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation，ChIP),3、方法的选择,2、蛋白质的性质、分类与分布,种类：细胞、组织、微生物、酵母 亚细胞定位：胞浆、胞膜、胞核、细胞器 性质：水溶、脂溶 其他：含量多少、分子量大小、磷酸化等,自行配制抽提试剂, 根据文献方法或经验提取 购买商品化试剂盒, 按其说明书的方法提取,二 细胞中总蛋白的制备,1、组织或细胞破碎,
4、机械匀浆 组织分散机、玻璃 超声破碎 反复冻融 干冰反复于零下1520使之冻固，然后缓慢地融解，反复操作 低渗溶液 去污裂解液 表面活性剂有阴离子型（如脂肪酸盐、烷基苯磺酸盐及胆酸盐等），阳离子型（如氧化苄烷基二甲基铵等）及非离子型（Triton X-100 、Tirton X-114、吐温60及吐温80）等。,2、细胞裂解液,Company Logo,2.1 缓冲液 稳定pH环境，使蛋白保持自然构象，增加溶解性。 有 Tris-HCl，HEPES (H+)，MOPS等体系（pH7.5),2.2 表面活性剂 溶解膜与脂膜，溶解与稳定蛋白质（特别是膜蛋白） 分为,1 阴离子型: SDS，脱氧胆酸
5、盐 2 阳离子型: CPB和CTAB 3 双性离子型: CHAPS和Zwittergent系列 4 非离子型: Brij系列、Triton-100 、Nonidet P40、Tween 系列等,2.3 蛋白酶抑制剂及其鸡尾酒 抑制蛋白酶的活性，防止蛋白被水解，使用前临时加入,2.4 磷酸酶抑制剂选择 抑制磷酸酶的活化，防止蛋白样本脱磷酸化， 使用前临时加入,磷酸酶主要包括非特异性的磷酸酶（例如：碱性磷酸酶，酸性磷酸酶），特异性的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶（例如：PP1, PP2A, PP2B） 、酪氨酸蛋白磷酸酶（例如：PTP）。 常规的抑制剂主要包括：,.,2.5 还原剂 防止蛋白质发生氧化，保护
6、二硫键。DTT、巯基乙醇等。,2.6 其它 水；溶剂; NaCl。,超纯水的电阻率就是单位厘米内的水的电阻值。 即18.25M*CM.,2.7 全蛋白抽提时注意事项,2.8 细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点,三 蛋白样本制备产品选择,1、核蛋白样本制备,抽提原理 低渗裂解细胞膜,释放出胞浆蛋白与胞核; 离心分离出胞核; 高渗破裂胞核,释放出可溶性核蛋白; 加核酸酶降解DNA,释放出DNA结合蛋白(组蛋白和转录因子) 实验注意事项 试剂和器皿冰上预冷 裂解液的用量 细胞总量 抑制蛋白酶：蛋白酶抑制剂,2、膜蛋白样本制备,3、亚细胞分级抽提,用超离心技术分离出细胞器、质膜和细
7、胞核等成分，再用适当的蛋白质溶解液进行溶解。其优点是不仅大大减少样品的复杂性，而且可对分离的蛋白质进行亚细胞定位。但该法需要专业仪器，有时会出现假阳性。 根椐胞浆/胞膜/胞核/骨架蛋白的亚细胞策略用不同提取液逐级溶解,四种亚细胞组分分离提取的结果,5、其它蛋白抽提产品,高丰度蛋白去除试剂盒 信号蛋白提取试剂盒 糖蛋白提取试剂盒 细菌蛋白提取试剂盒 酵母蛋白提取试剂盒 植物蛋白提取试剂盒,四 蛋白定量产品选择指南,1、BCA法蛋白定量,BCA（bicinchoninic acid）是理想的蛋白质定量方法。该方法因快速灵敏、稳定可靠，对不同种类蛋白质检测的变异系数非常小而倍备受专业人士的青睐。 原
8、理是，在碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。 BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。在组织细胞裂解实验中，低浓度的去垢剂SDS，Triton X-100，Tween不影响检测结果，但螯合剂（EDTA，EGTA）、还原剂（DTT，巯基乙醇）和脂类会对检测结果有一定影响。 实验中，若发现样品稀释液或裂解液本身背景值较高，可试用Bradford法测定蛋白浓度。,2、Bradford法蛋白定量,考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（l
9、max），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。 原理：染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。 测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。 去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）干扰此法的测定。,3、Lowery法蛋白定量,Lowry法蛋白质测定法是最灵敏的方
10、法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法。 原理：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。 Folin酚试剂中的磷钼酸盐磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。,这个测定法的优点是灵敏度高，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。,DC Protein Assay,免疫印迹（Western Blot）,SDS-聚丙烯酰胺电泳,蛋白变性,五、蛋白质变性,2SDS电泳上样缓冲液： 1M Tris-base (pH 6.8) 2.5ml， -巯基乙醇 1.0
11、ml， SDS 0.6 g， 甘油 2.0ml， 0.1%溴酚兰 1.0ml， ddH2O 3.5ml。 总体积：10ml,加一倍体积的上样缓冲液，95 左右加热5-10min,六、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,十二烷基磺酸钠（SDS ）是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链. 当 SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用. 蛋白质结合固定比例之 SDS 後,由於 SDS 带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且每单位重量之蛋白质带电价一致 (charge density),所以决定不同蛋白的泳
12、动速率就只剩下分子大小一项因素。,1、原 理：,2、SDS -蛋白质复合物的特点,（1）具有相同的形状，形状像 一个 长椭圆棒。 （2）平均1 g 蛋白质结合1.4 g SDS （3）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相同的。 （4）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比。,3、支持体：聚丙烯酰胺（Acr和Bis）,聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和N，N亚甲基双丙烯酰胺聚合而成的大分子。凝胶的网状结构是带有酰胺侧链的碳-碳聚合物，没有或很少带有离子的侧基，因而电渗作用比较小，不易和样品相互作用。 在水溶液中，单体和交联剂通过自由基引发的聚合反应形成凝胶 。 常用的引发剂和加速剂是过硫酸氨(A
13、P)和 N，N，N，N-四甲基对乙二胺(TEMED)。 浓度可在7.5%-15%之间变化。 温度高聚合快，温度低聚合慢。,凝胶成份,丙烯酰胺(Acr)和N,N-亚甲双丙烯酰胺 (Bis) 避光，保存时间 SDS（十二烷基磺酸钠） Tris-Cl 缓冲液 TEMED 避光 过硫酸铵 保存时间（用前加入） 去离子水（ddH2O）,4、不连续SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,浓缩胶：浓缩效应 分离胶：电荷、分子筛效应,堆积作用:凝胶浓度较小，孔径较大， pH=6.8 负极 （低电导区，高电场强度 ） 慢 GLy- (pI=5.97) 中间 Pr- (pI大多接近5) 快 Cl- 正极,在浓缩胶(pH=6.
14、8)中HCl几乎全部解离为Cl-，但只有极少部分甘氨酸解离为H2NCH2COO-。 蛋白质的等电点一般在pH5左右，在此条件下其解离度在HCl和甘氨酸之间。当电泳系统通电后，这3种离子同向阳极移动。其有效泳动率依次为Cl-蛋白质H2NCH2COO-，故C1-称为快离子，而H2NCH2COO-称为慢离子。 电泳开始后，快离子在前，在它后面形成离子浓度低的区域即低电导区。电导与电压梯度成反比，所以低电导区有较高的电压梯度。这种高电压梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。在快离子和慢离子之间形成一个稳定而不断向阳极移动的界面。 由于蛋白质的有效移动率恰好介于快慢离子之间，因此蛋白质离子就集聚在快
15、慢离子之间被浓缩成一条狭窄带。这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数百倍。,浓缩效应,SDS-聚丙烯酰胺凝胶最佳分离范围,不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度,5、电泳装置,Bio-Rad 和国产天能,操作图示,6、灌制SDS-聚丙烯酰胺凝胶,灌制分离胶 隔绝空气,灌好后一般室温放置30分钟左右,灌制浓缩胶 插入梳子,7、配胶注意事项,过硫酸铵一般现配现用，如连续实验可在4度放置23天。配制30丙烯酰胺储存液要过滤。 配制过程中每加入一种试剂要充分混匀，防止胶出现浓度不均的情况。 要根据温度调整TEMED或AP的使用量。 水封的时候水要慢慢加入，太快会导致胶面不平。 插梳子的时候要用力均匀，一次成
16、型。 在上样前可20V恒压预电泳20分钟，可去除泳道中的杂质。,8、电泳注意事项,原则上每次上样前将蛋白重新煮沸变性。 0.75mm厚的SDSPAGE的10孔梳每孔最多可上蛋白体积为20ul，15孔梳每孔最多可上蛋白体积为10ul。 一般的蛋白每孔上样总量为20ug比较适宜,特殊蛋白特殊对待，0.75mm厚度的胶，每泳道最高承受能力为100ug。 为保持条带的美观，不同浓度的蛋白上样导致加样体积不同时，最好用1的上样缓冲液补平。 看溴酚蓝压缩成一条线后把电压调为100V。 当溴酚蓝跑至离胶的下面还有0.40.6mm时停止电泳。 只要被检测蛋白量占总蛋白的1/105, 即可被检测。,9、蛋白ma
17、rker,NEB蛋白marker,Bio-rad彩虹marker,在电泳时、电泳后，以及转膜后监测电泳情况和估计迁移率。 值得注意的是预染蛋白Marker与染料共价耦联，电泳时迁移特性可能会发生某些变化，导致一些偏差，不太适合精确定位蛋白。,10、胶上蛋白质的检测（染色）,考马斯亮蓝染色,银 染,最小检出量为0.1ug,最小检出量为0.1-1ng,1、半干法 将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间，电转1030min。 2、湿法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中，电转45min或过夜。,七、转 膜,蛋白质带负电荷，凝胶在负极一侧，膜在正极一侧，接通电源以后，
18、蛋白质由负极向正极转移至膜上。,聚丙烯酰胺胶-膜三明治,半干转 快速，约10-30min 湿转 较稳定，250mA，1.5-2h,3、半干转仪,4、湿转槽,Mini Trans-Blot cell components,5、三种膜的特点比较,6、转膜注意事项,恒流250mA，1.5h-2h，根据所需蛋白的分子量来调节。 PVDF膜用前先在甲醇中浸泡15秒钟，然后在转膜液中浸泡15分钟以上后方可使用。 “三明治”的制作需在转膜液中进行，确保各层精确对齐且不能留有气泡，胶靠负极（黑色），膜靠正极（白色）。 半干转对胶、膜及滤纸的大小要求比较高，滤纸不能大于膜和胶而直接接触，这样会引起短路，湿转的要
19、求不是很高。 胶的左右方向要记牢，膜上做好标记。 为了防止过热因而导致在夹层中形成气泡或使凝胶变形，条带扭曲，转移过程应在冷室中进行。,7、转膜后检测,丽春红染色 可逆，灵敏度较低，且红色不易拍照 氨基黑染色 不可逆，灵敏度为30ng/条带 印度墨汁染色 不可逆，灵敏度为6ng/条带 胶体金染色 灵敏度最高，400pg/条带,八、免疫学检测,脱脂奶粉（5） BSA（3%） Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供）,2、封闭液,1、洗膜 TBST：Tris-base 2.42 g（pH 7.6），NaCl 8.0 g，Tween-20 1ml， 定容至1000ML,3、封闭注意事项
20、,封闭的作用是封闭膜上非特异性位点，防止抗体非特异性地结合在膜上。 可4度过夜或在常温1-3h。 尼龙膜及PVDF膜可适当延长封闭时间。 奶粉封闭液最为物廉价美，但若牛奶中可能含有需western的蛋白时，则不能用其作为封闭液。 也可用3% BSA封闭。,Protein,Protein,4、免疫学反应,抗体：单克隆抗体， 多克隆抗体,一抗：种族特异性：H,R,M， 来源:兔源，小鼠源，鸡源 二抗：羊抗兔，兔抗小鼠，驴抗兔 酶偶联：AP、HRP,5、多克隆抗体,抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组球蛋白，这就是免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力
21、的免疫球蛋白就是抗体。 抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体（Monclone antibody）。 由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，,机体内所产生的抗体就是多克隆抗体；除了抗原决定簇的多样性以外，同样一类抗原决定簇，也可刺激机体产生IgG、IgM、IgA、IgE和IgD等五类抗体。,6、单克隆抗体,抗体是由B淋巴细胞分化形成的浆细胞合成、分泌的。每一个B淋巴细胞在成熟的过程中通过随机重排只产生识别一个抗原的抗原受体基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋
22、巴细胞系，重排后具有不同基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。 当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞（浆细胞）和记忆B细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。 单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。,单克隆抗体由可以制造这种抗体的免疫B细胞与骨髓瘤细胞融合后的细胞产生的，这种融合细胞即具有瘤细胞不断分裂的能力，又具有免疫细胞能产生抗体的能力。融合后的杂交细胞(杂种瘤)可以产生大量相同的抗体。,7、一抗、二抗孵育,将膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以0.1ml/cm2的
23、量加入加入一抗溶液与滤膜温育。37 2-4小时或4 过夜。 用TBST洗液洗膜3次，每次5-10min。 加入用TBST配制的二抗，摇床上缓慢摇动， 常温1小时。 用TST洗液洗膜3次，每次10min。,抗体的结合,常用抗体品牌：Cell Signaling，R&D，Chemicon，Rockland，BD， Santa-cruz， Sigma。 抗体需分装，冰冻保存，避免反复冻融。 一般抗体可反复使用两次（一周内）。 抗体浓度过低则检测不出条带，但浓度高了也不行，一抗浓度过高易产生杂带，二抗浓度过高易发生背景，要在“平衡木”上保持平衡，找到一个平衡点。 也可用洗脱液的盐离子浓度高低、洗膜时间
24、长短，及洗膜力度的大小来调节抗体的结合程度。,8、二抗与底物显色反应,辣根过氧化物酶法（HRP） 10-20pg 碱性磷酸酶法（AP） 10-50pg 化学发光显色法,9、显色反应、曝光,我们通常使用的试剂盒是Amersham 的ECL plus。 新鲜配制发光工作液，A：B为40：1 用镊子取出膜，搭在滤纸上沥干洗液但勿使膜完全干燥。小心在膜上滴加ECL混合液，孵育3-5分钟，立即压片曝光，正常强度时肉眼可见荧光。 将膜沥干发光液后，夹入塑封膜，置于压片盒中（内贴增感屏），黑暗中取出胶片，剪至合适大小，压片，时间长短视荧光强弱而定，也可根据第一张胶片曝的效果来调整第二张的压片时间。 长时间曝
25、光或蛋白过量，将加深背景并使条带强弱变化失去线性关系。,10、显影、定影,黑暗状态下,取出胶片,放入显影液,当胶片上出现条带后,掌握火候将胶片迅速取出,用水漂洗后放入定影液定影. 显影时间要适度,时间短了条带不清晰,时间长了易使条带灰度饱和而使差异消失,同时,背景和杂带也会加深. 定影时间要充分,这样可以得到背景比较干净,透明的胶片,且易于保存,条带可以长久保持清晰.,九图片实例解析,1、灰度分析,剪取条带 灰度分析 计算比值,2、对蛋白质水平和活性的检测,对蛋白质含量的检测： Akt，JNK，c-Jun， IRS-1， 蛋白质水平内参： -Actin，GAPDH，-tublin 对蛋白质活性的检测： p-Akt473， p-Akt308， p-JNK， p-c-Jun， p-IRS， 对蛋白质相互作用的检测： 对蛋白质亚细胞定位的检测： BCL2， （膜转位、核转位和线粒体转位）,十 Western Blot常见问题分析,问题分析1,问题分析2,问题分析3,问题分析4,免疫相关实验技术,免疫印记 免疫共沉淀 免疫印记 染色质共沉淀CHIP PCR 免疫组化 细胞免疫荧光,Thank you for your attention!,