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1、免疫检测常用方法及应用 肥城市人民医院检验科 秦 伟,免疫学检测方法是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、补体、细胞因子等免疫相关物质及微量物质如激素、酶、血浆微量蛋白、血液药物浓度、微量元素、毒品等试验方法。,这些方法所具有的特异性好、敏感性高、简单、快速和稳定的特点为临床上确定诊断、分析病情、调整治疗方案和判断预后等提供有效的实验依据，使它们在临床的应用进一步普及和推广。,凝集反应(agglutination),颗粒性抗原(细菌、细胞等)与相应的抗体，或可溶性抗原(亦可用抗体)吸附于与免疫无关的载体形成致敏颗粒与相应的抗体(或抗原)，在有适量电解质存在下，形成肉眼可见的凝集小块。,凝
2、集反应的分类,直接凝集反应 间接凝集反应 抗人球蛋白试验（Coombs试验）,直接凝集反应,颗粒性抗原(细菌、细胞等)与相应的抗体在有适量电解质存在下，形成肉眼可见的凝集小块。 常见的应用是血型的鉴定,血型鉴定示意图,间接凝集反应,将可溶性抗原（或抗体）先吸附于适当大小颗粒性载体的表面，然后与相应抗体（或抗原）作用，在适宜的电解质存在的条件下，出现特异性凝集的现象称间接凝集反应（indirectagglutination）或被动凝集反应（assiveagglutination）。,间接凝集反应,常用的载体微球有人O型血红细胞、绵羊或家兔红细胞、聚苯乙烯乳胶、活性炭/甲苯胺红、明胶颗粒等,间接凝
3、集反应,正向间接凝集反应 反向间接凝集反应,正向间接凝集反应,用抗原致敏载体以检测标本中的相应抗体,正向间接凝集反应 胶乳凝集试验,所用载体颗粒为羧化的聚苯乙烯胶乳，是一种直径约为0.8m大小的圆形颗粒，带有负电荷，可物理性吸附蛋白分子。 将溶血素O 吸附在羧化的聚苯乙烯胶乳颗粒上检测抗”O”。 将变性IgG包被于羧化的聚苯乙烯胶乳颗粒上检测RF。,正向间接凝集反应 RPR/TRUST试验,血浆反应素试验(RPR) 所用载体颗粒为活性炭颗粒 甲苯胺红不加热血清反应素试验 （TRUST） 所用载体颗粒为甲苯胺红颗粒,正向间接凝集反应 RPR试验,正向间接凝集反应 TRUST试验,正向间接凝集反应
4、 明胶颗粒凝集试验,所用载体为人工合成的惰性明胶颗粒 梅毒螺旋体明胶凝集试验（TPPA） 肺炎支原体抗体检测（MP-Ab）,正向间接凝集反应 TPPA试验,正向间接凝集反应 TPPA试验,正向间接凝集反应 MP-Ab试验,正向间接凝集反应 MP-Ab试验,正向间接凝集反应 MP-Ab试验,正向间接凝集反应 MP-Ab试验,检测肺炎支原体的总抗体（IgM, IgA IgG) 以滴度的方式报告检测结果（1:80 1:80、1：160、1:320 ),反向间接凝集反应,用已知特异性抗体致敏载体以检测标本中的相应抗原。,抗人球蛋白试验 （Coombs试验）,抗人球蛋白抗体参与的间接血凝试验，用于检测抗
5、红细胞不完全抗体 分类： 直接Coombs试验 间接Coombs试验,直接Coombs试验,间接Coombs试验,凝集反应总结,一、直接凝集反应 血型鉴定 二、间接凝集反应 胶乳凝集试验 ASO/RF 1正向间接凝集反应 RPP/TRUST 明胶颗粒凝集 TPPA/MP 2反向间接凝集反应 三、抗人球蛋白试验 直接/间接Coombs试验,酶联免疫吸附试验 （ELISA）, 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。 使抗原或抗体与酶连接成酶标抗原或抗体，且既保留其免疫活性又保留酶的活性。 标本中的抗原或抗体、酶标抗原或抗体按一定的次序与固相载体表面的抗体或抗原反应，并通过底物与酶的
6、反应来反映标本中的抗原或抗体的量。,酶联免疫吸附剂试验,酶联免疫吸附试验,双抗体夹心法 双抗原夹心法 间接法 竞争法 捕获法测 IgM 抗体,ELISA双抗体夹心法,用特异性抗体进行包被和制备酶标抗体，以检测相应的抗原。 乙肝标志物中HBsAg、 HBeAg的检测常采用本法,ELISA双抗体夹心法,ELISA双抗体夹心法,ELISA双抗原夹心法,用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。 抗HBs的检测 抗HCV的检测 抗HIV的检测,ELISA双抗原夹心法,ELISA竞争法,标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。如受检标本中无抗体，则酶标抗体能顺利地与固相抗原结合。加
7、入酶标抗原后就显色深。如受检标本中含有抗体，则与酶标抗体以同样的机会与固相抗原结合，竞争性地占去了酶标抗体与固相抗原结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。加入酶标抗原后就显色浅或不显色。,ELISA竞争法,ELISA竞争法,最常见的应用： 乙肝HBeAb、 HBcAb检测,ELISA捕获法,（1）将抗人 IgM 抗体（抗人 IgM 链抗体）连接在固相载体上，形成固相抗人 IgM。 （2）加入标本， IgM 抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他抗体。 （3）加入特异性抗原试剂，它只与固相上的特异性 IgM 结合，洗涤。 （4）加入针对特异性抗原的酶标抗体，形成固相二抗 IgM抗体抗原 酶标抗
8、体复合物。 （5）加底物显色，如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性 IgM 抗体存在，是为阳性反应。,ELISA捕获法,以优生四项IgM抗体检测为例,ELISA捕获法,甲肝IgM抗体测定,ELISA总结,酶免疫测定具有高度的敏感性和特异性， 几乎所有的可溶性抗原抗体系统均可用以检测。它的最小可测值达 ng 甚至 pg 水平。酶免疫测定标记试剂比较稳定，且无放射性危害。因此，酶免疫测定的应用日新月异，酶免疫测定的新方法、新技术不断发展。,固相膜免疫测定,利用微孔膜（主要是醋酸纤维素膜）作为固相进行免疫检测的方法 根据标记物的不同分为两类： 酶标固相膜免疫测定： 酶免疫斑点法 酶免疫印迹法 金标
9、法： 胶体金斑点渗滤试验 胶体金免疫层析试验,酶标固相膜免疫测定原理,酶免疫斑点法,常应用于自身抗体的检测,酶免疫印迹法,胶体金斑点渗滤试验,胶体金斑点渗滤试验,胶体金免疫层析试验,金标双抗体夹心法测抗原 将试纸条下端浸入液体标本中，下端吸水材料即吸取液体向上端移动，流经C处时使干片上的免疫金复合物复溶，并带动其向膜条渗移。若标本中有待测特异抗原，其时可与免疫金复合物之抗体结合，此抗原抗体复合物流至测试区即被固相抗体所获，在膜上显出红色反应线条（T）。过剩的免疫金复合物继续前行，至参照区与固相小鼠IgG结合（免疫金复合物中的单克隆抗体为小鼠IgG），而显出红色质控线条（R）。反之，阴性标本则无
10、反应线条，而仅显示质控线条。,胶体金免疫层析试验,胶体金免疫层析试验,检测HIVAb的双抗原夹心法,金标法的应用,HCG的检测,金标法的应用,HBs-Ag的检测,金标法的应用,大便潜血试验（FOB）,金标法的应用,轮状病毒和腺病毒抗原检测,金标法的应用,幽门螺杆菌（HP）抗原检测,金标法的应用,O1群霍乱弧菌检测,金标法的应用,HCV-Ab检测,金标法的应用,艾滋病抗体金标检测,金标法总结,上述两种试验的共同特点是：简便、快速、单份测定、可立等结果，除试剂外无需任何仪器设备，且试剂稳定。因此特别适用于急诊检验。 但这类试验不能准确定量，所以主要限于检测正常体液中不存在的物质（例如诊断传染病中的抗原或抗体）以及正常含量极低而在特殊情况下异常升高的物质（如 HCG 等）。 虽然检测敏感性和特异性还不如ELISA高，但是检测的项目越来越多和上述的特点使其应用越来越广泛。,谢谢!,