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1、免疫组化技术,1、定义 用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（技术）。 2、基本原理 根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上
2、原位确定某些化学成分的分布和含量。,3、目前几种常用免疫组化方法简单介绍 1）免疫荧光方法 利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用较广。,2）免疫酶标方法 是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标技
3、术是目前最常用的技术。 本方法与免疫荧光技术相比的主要优点是： 定位准确，对比度好，染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。 免疫酶标方法目前在病理诊断中广为使用的有ABC法、SP三步法、即用型二步法检测系统等.。,4、被检测的物质 组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。,5、从蛋白水平检测角度，免疫组化技术与Western blotting、ELISA的异同 1）Western blotting：蛋白质免疫印迹，也是利用抗体抗原反应原理，结合化学发光等技术来检查组织或细胞样品内蛋白含量的检测方法
4、。与免疫组化技术相比，定量可能更加准确；当然Western blotting也可定性和定位（通过提取膜蛋白或核蛋白、胞浆蛋白分别检测其中抗原含量，进而间接反映它们的定位），但敏感性远远低于免疫组化技术。 2）ELISA：酶联免疫吸附试验，也是利用抗体-抗原-抗原结合反应原理来检查体液或组织匀浆中蛋白含量的检测。与免疫组化技术相比，定量最准确，是分泌性蛋白检测首选方法之一。,免疫酶标法下的两个实验流程简介 一、SP三步法 1）石蜡切片，常规脱蜡至水。 2）0.3%或3%H2O2去离子水（无色液体）孵育10-30分钟，以灭活内源性过氧化物酶活性。 3）蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟 4）候选步骤：采
5、用抗原修复：微波（建议30分钟内4次中火）、高压、酶修复方法。自然冷却，再用3分钟3次. 5）血清封闭：室温15-30分钟，尽可能与二抗来源一致。倾去，勿洗。 6）滴加适当比例稀释的一抗，37孵育23小时或4过夜（最好复温）。PBS冲洗，3分钟5次。 7）滴加生物素标记的二抗，室温或37孵育30min-1h。8）PBS冲洗，3分钟5次。9）滴加SP（链霉亲和素过氧化物酶），室温或37孵育30min1h。 10）PBS冲洗，3分钟5次。 11）显色剂显色（DAB等）。 12）自来水充分冲洗。 13）可进行复染，脱水，透明， 14）选择适当的封片剂封片。,二、二步法免疫组化染色步骤,二甲苯脱蜡，梯
6、度酒精置换二甲苯 PBS冲洗3次，每次3分钟 根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复 0.3%过氧化氢甲醇液阻断20分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性 PBS冲洗、浸泡5分钟，3次 正常山羊血清室温封闭10分钟,甩去血清，加入适当稀释的一抗，37孵育60分钟或4过夜 PBS冲洗，浸泡5分钟，3次 滴加多聚螯合物，37孵育30分钟 PBS冲洗，浸泡5分钟，3次 新鲜配置酶底物显色液DAB显色310分钟 流水冲洗 苏木素复染，脱水，透明，封片。 显微镜观察拍照 IPP软件分析光密度,DAB-二氨基联苯胺是过氧化物酶的生色底物，在过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化和积累，形成浅棕色不溶
7、性产物。用于检测过氧化物酶的活性，它灵敏度高，特异性好。,是HRP结合物最常用的底物常在免疫组化,原位杂交, Western blot 等膜显色或检测细胞或组织内源性的过氧化物酶中应用广泛。,苏木素是从洋苏木中提取的一种染色剂，它在被氧化后生成苏木精，同媒染剂（常用的是三价的铁或铝的盐）一起使用，能够使细胞核染色。苏木素是一种碱性染料。,2、免疫荧光方法中的重要环节 1）冰冻切片制备：建议用新鲜组织，否则组织细胞内部结构破坏，易使抗原弥散。选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等，防止裂片和脱片严重。 2）组织切片固定：切好片风干后立即用冰丙酮等固定液进行固定5-10min，尤其要较长时间保存
8、的白片，一定要及时固定和适当保存。 3）血清封闭：为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用血清（与二抗来源一致）封闭，减弱背景着色。血清封闭的时间是可以调整的，一般10-30min。 4）一抗孵育条件：在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。具体条件还要摸索。 5）二抗孵育条件：二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度，切记要避光反应。,6）封片：为了长期保
9、存，我们一般用缓冲甘油等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液。避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。 7）切片清洗：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要。（2）温柔冲洗，防止切片的脱落。3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。（4）PBS的pH和离子强度的使用附和要求。,组织与细胞材料的制备,组织石蜡切片制作 组织冰冻切片制作 细胞爬片制作
10、 细胞涂片制作,切片的制作,组织的固定 组织石蜡包埋 切片,目的: （1）防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞 的固有形态。 （2）使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶 性物质，以保持它原有的结构与自然状态时相仿。防止组织细 胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。 （3）使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射率，造 成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。 （4）固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、增加组织硬度、便于制 片。 （5）防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。 （6）经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，
11、便 于辨认。,组织材料的固定,固定液的选择： (1)甲醛固定液：10福尔马林，10中性福尔马林，10中 性缓冲福尔马林 (2)4多聚甲醛固定液 (3)Bouin S液及改良Bouin S液 (4)Zenker S液 (5)Zamboni S液 (6)PLP固定液：过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛固定液。该固定剂 较适合富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保 存较好。 (7)PLPD固定液 取PLP固定液25ml，加入2.5%重铬酸25ml。 (8)Kanovsky S液 (9)Methacarn固定液，对核内抗原的保存效果较好。 (10)PEG液 (11)0.4%对苯醌 (12)碳二亚酰胺-戊二
12、醛（ECG-G）液 (13)丙酮及醇类固定剂,固定时间： 固定时间要视组织块的厚薄，固定液的种类及浓度，温度而定，原则上，组织块大小与固定时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。,大组织：75乙醇30120min，85乙醇30120min，95醇 2h，95乙醇 2h，95乙醇过夜，无水乙醇30 60min，无水乙醇3060min，无水乙醇60min120min，二甲苯、和各15min（可视观察结果而定），石蜡30min石蜡12h，石蜡23h。 小组织：75乙醇30min，85乙醇30min，95乙醇1h、1h、过夜或2h，无水乙醇、和各30min，二甲苯15min、10min、10
13、min（肉眼观察），石蜡30min，石蜡30min，石蜡12h。,组织石蜡包埋,切 片,载玻片的清洁： 市售载玻片需经清洁液浸泡24h，流水冲洗，系列乙醇浸泡，凉干涂胶，如需开展原位杂交，还需将玻片240烤2h。 切片粘合剂的使用： （1）多聚赖氨酸（分子量300KD）：0.5%浓度。 （2）APES试剂（3-氨基、丙基三氧基硅烷） 干净载玻片丙酮5min 用镊子夹住浸入APES试剂（1ml+50ml丙酮） 13次纯丙酮洗二次干燥玻片用铝箔包好，室温或4保存备用。 （3）铬矾明胶液：铬矾0.5g 明胶5g H2O2 1000ml （4）甲醛明胶液：40甲醛2.5ml 明胶0.5g H2O2 1
14、00ml,切片： 石蜡切片： (1)连续切片按序贴在玻片的下1/3。 (2)5260烤片18h。 (3)切片厚24m。 (4)切片刀要快 (5)编上号 (6)切片可在4保存数年 冰冻切片： (1)冰冻切片分固定和新鲜组织，固定组织需经蔗糖处理 24h，冰冻切片。 (2)冰冻切片后需凉干后立即固定 (3)冰冻切片固定后-80保存备用,细胞爬片制作,将处理好的盖玻片放入接种了细胞的培养瓶或六孔板内。 待细胞生长达到60以上后取出玻片。 用4%的多聚甲醛固定2h以上。 可加甘油封存置于零下20度保存。,细胞涂片制作,离心将细胞收集出来，用预冷的PBS洗23遍，最后用PBS将细胞重悬。 吸取3050u
15、l（可根据细胞量调整）滴至处理过的载玻片上，然后涂抹均匀。 待稍微风干以后加4多聚甲醛溶液覆盖细胞，固定24小时。 在细胞上加一层甘油放-20保存。,荧光标记免疫组织化学,直接法 间接法,注意事项,一、抗体的保存 浓缩抗体：有效期内，只需放在 4冰箱内，保存时间可达1-3年。 即用型抗体：理论上在4 冰箱内 可保存半年左右。 PBS或抗体稀释液稀释的抗体：一般 只可放置1-2个月。,二、出现假阳性的原因 组织切片质量不佳，造成假象，如刀痕裂缝边缘的组织着色过深，不能作为判断阳性的依据。 出血和坏死：红细胞的内源性过氧化物酶，坏死细胞释放的内源性过氧化物酶均可出现假阳性反应。 抗体的交叉反应。,三、出现假阴性的原因 固定时间过长，浸蜡、烤片温度过高，导致抗原丢失，无法补救。 固定液不合适或浓度不对，导致固定不佳。最好使用10%中性福尔马林。 抗体浓度过低。 孵育时间太短，或孵育温度太低。 缓冲液pH值不正确。,四、必须严格设置阳性对照和阴性对照。 五、DAB有致癌性，用后不应随处倒弃。,