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1、亲和层析,生物亲和作用,生物亲和作用的本质 影响亲和作用的因素 亲和作用体系,生物亲和作用的本质,生物分子间的特异性相互作用称为生物亲和作用（bioaffinity）或简称亲和作用（affinity）。 利用生物分子间的这种特异性结合作用的原理进行生物物质分离纯化的技术称为亲和纯化（affinity purification）。 亲和作用的分子（物质）对可以是：大分子-小分子，大分子-大分子，大分子-细胞，细胞-细胞。,配基固定化、吸附样品、样品解吸 “亲和吸附剂”：载体与固定化配基的总称,具有亲和作用的分子对之间具有“钥匙”和“锁孔” 的空间结构关系。 亲和结合作用，至少存在3个对应官能团相
2、结合： 静电作用 氢键 疏水相互作用 配位键 弱共价键,图5-1 蛋白质的结合部位及各种结合作用力,亲和作用体系,将亲和体系中的一种分子与固体粒子共价偶联，可特异性结合另一种分子（目标产物） ，使其从混合物中高选择性地分离纯化。 一般将被固定的分子称为其亲和结合对象的配基（ligand），用L表示。 Keq越大，亲和结合作用越强。Keq一般为104108 L/mol，最高可达到1015 L/mol 。,常用的亲和作用体系 特异性 亲和作用体系 高特异性 抗原-单克隆抗体 荷尔蒙-受体蛋白 核酸-互补碱基链段、核酸结合蛋白 酶-底物、产物、抑制剂 群特异性 免疫球蛋白-A蛋白、G蛋白 酶-辅酶
3、凝集素-糖、糖蛋白、细胞、细胞表面受体 酶、蛋白质-肝素 酶、蛋白质-活性色素（染料） 酶、蛋白质-过度金属离子 酶、蛋白质-氨基酸（组氨酸等）,亲和色谱,亲和色谱的特点 选择性高、特异性极强, 以胰岛素提取胰岛素受体，一步纯化8000倍 分离精度高：可用于分离含量极低，结构相近的化合物 亲和色谱的局限性 通用性差，洗脱条件苛刻 费用高,亲和色谱填料,亲和吸附作用是在特定配基的存在下实现的，需根据目标产物选择适当的亲和配基修饰固定相粒子，制备所需的亲和吸附介质。 少数特殊情况如Sephadex凝胶可亲和吸附伴刀豆球蛋白A（一种植物凝集素）。 在利用亲和色谱技术纯化目标产物时，商品化的亲和吸附介
4、质往往不能满足特殊目标产物的需要，有必要自制亲和吸附介质。,亲和配基,配基的选择 足够大亲和力 结合专一 牛胰蛋白酶抑制剂: 除与牛胰蛋白酶, 还与胰凝乳蛋白酶、激肽释放酶有亲和作用 配基有化学活性,配基的浓度 亲和势较低（ KL 10-4mol/L），增加配基浓度或增加柱长 大分子配基浓度过高，活性中心相互掩盖， 吸附强，非专一性吸附 理想配基浓度1-10mol/L，2 mol/L凝胶 配基分子大小 首选大分子或插入“手臂”,偶联位置 e结合有效，偶联位置导致 亲和力差异，可吸附不同配体,亲和配基 1. 酶的抑制剂 小分子抑制剂有苄脒（benzamidine）、精氨酸和赖氨酸等。 底物，亲和
5、力抑制剂，专一性较差， 转变为产物，用不适pH，缺少辅因子 辅酶：专一性不强,2. 抗体,利用抗体为配基的亲和色谱又称免疫亲和色谱（immunoaffinity chromatography）。抗体与抗原之间的Keq一般为1071012 L/mol。 利用免疫亲和色谱法是高度纯化蛋白质类生物大分子的有效手段。,3. A蛋白 protein A为分子量约42 kD的蛋白质，与IgG具有很强的亲和作用，结合部位为IgG分子的Fc片段。A蛋白分子上含有5个Fc片段可结合部位。 不同IgG的Fc片段的结构非常相似，因此A蛋白可作为各种抗体的亲和配基，但不同抗体的结合常数有所不同。 A蛋白与抗体结合并不
6、影响抗体与抗原的结合能力，因此A蛋白也可用于分离抗原-抗体的免疫复合体。,4. 凝集素 凝集素（lectin）是与糖特异性结合的蛋白质（酶和抗体除外）的总称。 伴刀豆球蛋白A（concanavalin A，con A） 可用做糖蛋白、多糖、糖脂等含糖生物大分子的分析、纯化。 pH5.6时con A为二聚体，分子量为52 kD；pH5.6时为四聚体，分子量为102 kD，两个亚基（subunit）之间通过二硫键结合。 在利用con A为配基的亲和色谱操作中，操作条件应当适宜。,5. 辅酶和磷酸腺苷 脱氢酶和激酶与辅酶之间具有亲和结合作用。辅酶主要有NAD（nicotinamide adenine
7、 dinucleotide）、 NADP（NAD phosphate）和ATP（adenosine triphosphate）等。这些辅酶可用做脱氢酶和激酶的亲和配基。 AMP（adenosine 5-monophosphate）、 ADP（adenosine 2，5-diphosphate）的腺苷部分与上述辅酶的结构类似，可用做这些酶的亲和配基。,6. 三嗪类色素 利用色素为配基的亲和色谱法又称色素亲和色谱（Dye-ligand affinity chromatography）。 Triazine dyes是一类分子内含有三嗪环的合成染料，与NAD的结合部位相同，又称为生体模拟色素（biom
8、imetic dye）。除脱氢酶和激酶外，三嗪类色素还与血清白蛋白、 干扰素、核酸酶和糖解酶 等具有很高的亲和力。 Cibacron Blue F3GA ：,7. 过渡金属离子 Cu2+，Ni2+，Zn2+和Co2+等过渡金属离子可通过与亚胺二乙酸（IDA）或三羧甲基乙二胺（TED）形成螯合金属盐固定在固定相粒子表面，用做亲和吸附蛋白质的配基。 这种利用金属离子为配基的亲和色谱一般称为金属螯合色谱（metal chelate chromatography）或固定化金属离子亲和色谱（immobilized metal affinity chromatography，IMAC）。,8. 组氨酸 组
9、氨酸可与蛋白质发生亲和结合作用：静电和疏水性相互作用均有可能参与亲和结合。 在盐浓度较低和pH约等于目标蛋白质pI的溶液中，固定化组氨酸的亲和吸附作用最强，随着盐浓度增大，亲和吸附作用降低。,9. 肝素 肝素（heparin）是存在于哺乳动物的肝、肺、肠等脏器中的酸性多糖类物质，分子量一般为5至30 kD，具有抗凝血作用。 肝素与脂蛋白、脂肪酶、甾体受体、限制性核酸内切酶、抗凝血酶、凝血蛋白质等具有亲和作用，可用作这些物质的亲和配基。 肝素的亲和结合作用在中性pH和低浓度盐溶液中较强，随着盐浓度的增大结合作用降低。,亲和色谱填料载体 亲和色谱的理想载体应具有下列特性： 不溶性； 渗透性； 高硬
10、度及适当的颗粒形式； 最低的吸附力； 较好的化学稳定性； 抗微生物和酶的侵蚀； 亲水性； 具有大量的供反应的化学基团。,常规的亲和色谱填料都是以软质凝胶，诸如葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等作为载体材料的。 近年来，为了满足快速高效分离的需要，以多孔硅胶和合成高分子化合物为载体的高效AFC色谱填料，得以迅速发展。 亲和色谱填料的制备过程一般包括：载体（carrier、support）的选择、载体的活化和配基的连接。,亲和吸附载体的种类,常用载体,1. 纤维素 活化后带电荷，非特异性吸附强，结构紧密， 小分子配基亲和位阻大, 分离与核酸有关的物质（oligo)dT- mRNA 2. 琼脂糖凝胶 Se
11、pharose 4B最佳，活性基团多，孔径大， 几乎无带电基团，交联后稳定性,3. 葡聚糖凝胶 孔径小，G-200通过105级，配基偶联后， 膨胀度，表面亲和病毒、细胞 4. 聚丙烯酰胺凝胶 较多酰胺基，配基偶联后网格缩小 pH2-11，理化稳定，避免接触强氧化剂 5. 多孔玻璃珠（Bio-Glass) 理化稳定，亲水性不强，非特异性吸附， 化学活性基团少 克服：商品连接氨烷基，葡聚糖包被,部分商品化的色谱填料,表5-2 部分商品化的色谱填料,影响亲和力的因素,配基浓度（解离常数） 配基浓度高有利, 低亲和力系统：配基浓度配体浓度 高亲和力系统: 配基浓度大不利,空间障碍,对于亲和力低，分子量
12、特大的亲和对，小分子配基， 加手臂 活化方法引入活性基团，起到间隔臂作用 C6烃链，C8亲和力下降,配基与载体结合位点 多肽、蛋白作配基，以最少键与载体连接 以-NH2表面，较低pH减少连接点，PH9.5位点多 胰岛素：pH9.5，2个-NH2连，亲和力1/10 pH6.5，1个-NH2连，,载体孔径 排阻限至少大于配体分子量1个数量级 配基和大分子（抗原抗体）亲和力高或配体很大 （细胞器、完整细胞），多孔不重要，在表面,微环境,化学作用：载体及手臂电性极性，避免引入含离子键的基团，配基与载体手臂的氢键,载体的活化和偶联,亲和吸附的载体通常是惰性的，往往不能直接与配基连接，偶联前需要先活化，活
13、化的方法主要有： 溴化氰活化法：琼脂糖、葡聚糖引入亚氨基碳酸盐； 高碘酸活化法：氧化多糖，生成烷基胺 环氧化法：多糖类载体与环氧氯丙烷作用生成环氧化合物，再与氨基偶联； 甲苯磺酰氯法： 双功能试剂法 二乙烯砜,载体的活化和配基的连接 1. 溴化腈活化法 用于多糖凝胶的活化，固定活性基团为氨基的配基（R-NH2）。溴化腈（CNBr）对多糖类载体的活化在碱性（pH10）条件下数分钟即可完成，之后的配基修饰亦需在碱性条件进行，一般使用碳酸盐缓冲液。反应过程为：,活化步骤 琼脂糖与等量水混合，溴化氰充分粉碎， 湿胶CNBr=10-20 1， 18-20，pH10.80.1，搅拌，8-12分钟,洗涤 大
14、量0.1M NaHCO3(pH8.5-9.5)洗涤、抽滤 冷、快（5-10分钟） 偶联 非质子化氨基NH2-P，环境pH氨基pK 4，4-24h(6h)，后用氨基化合物（乙醇胺） “中和”或“封闭”残存活化基团,2. 环氧基活化法 可用于固定分子结构为R-NH2、R-OH和R-SH的配基。常用的活化试剂为1,4-丁二醇-二缩水甘油醚（BGE）和环氧氯丙烷。,环氧化法,表氯醇,3. 硅胶的活化 活化硅胶常采用硅烷化试剂，如-氨丙基三甲（乙）氧硅烷和环氧丙基三甲基硅烷等，反应为： 引入活性氨基或环氧基后，在酸性溶液中环氧基可发生二醇化反应：,4. 间隔臂 当配基较小时，将其直接固定在载体上，会由于
15、载体的空间位阻，配基大分子不能发生有效的亲和吸附作用。 这时，需要在配基 与载体之间连接一 个“间隔臂（spacer）”， 使其发生有效的亲 和结合。,图5-2 间隔臂的作用,在上述配基固定化方法中，环氧基活化法中的双环氧化合物起间隔臂的作用。 事实上，除CNBr活化法外，其他活化法都引入了不同的活性基因，这些活性基团如果有适当的长度，都可起到间隔臂的作用。 利用CNBr活化法固定小分子配基时，一般需先引入-氨基已酸或1,6-二氨基已烷后再用相应的方法固定配基。 引入间隔臂的长度是有一定限制的，当间隔臂超过一定长度时，配基与目标分子的亲和力又会减弱。,配基偶联方法,载体经活化后，就可以进行与配
16、基的偶联反应。具体方法如下： 碳二亚胺缩合法 酸酐法 叠氮化法 重氮化法,吸附和洗脱,一、影响吸附的条件 平衡缓冲液 平衡固定相，保持pH，I 平衡流动相，接近生理条件 洗涤，洗脱 近中性pH、低I或添加辅因子 吸附温度 10 样品 1. 吸附容量 图 因素：吸附剂、条件 吸附容量一般小于配基浓度1/100 前沿分析法,2. 样品浓度 亲和力大，浓度不重要，太浓影响扩散，专一性下降 亲和力小，浓度亲和效果峰集中 一般蛋白3% 吸附平衡的流速 大分子配体与配基的吸附平衡需较长时间 高温数小时，低温数天 操作：先平衡、低流速10ml/ch 亲和力大，流速快，抗原抗体 亲和力小，流速慢，抑制剂、底物
17、类似物与酶 非特异性吸附：离子效应、疏水基团,二、清洗 清洗：与吸附操作相同的缓冲液，确定时间,非特异性洗脱法 非特异性洗脱通过调节洗脱液的pH值、离子强度（NaCl%) 、离子种类或温度等理化性质降低目标产物的亲和吸附作用，是使用较多的洗脱方法。 纯化几个酶 抗原抗体降低缓冲液极性（加乙二醇） 加蛋白变性剂，洗脱后稀释透析,亲和色谱洗脱方法,特异性洗脱法 利用含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合作用的小分子化合物溶液为洗脱剂，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合，脱附目标产物。 例如：Lys和Arg均为t-PA的抑制剂，利用固定化Lys为配基亲和分离t-PA时，可用Arg溶液进行洗脱。 “正
18、洗脱” 常用游离配基抑制剂、辅酶、底物、结构类似物,利用con A为配基的目标产物可用葡萄糖溶液洗脱。 特异性洗脱法的洗脱条件温和，有利于保护目标产物的生物活性，另外，由于仅特异性洗脱目标产物，对于特异性较低的亲和体系（例如，用三嗪类色素为配基时）或非特异性吸附较严重的物系，特异性洗脱法有利于提高目标产物的纯度。,“负洗脱”：酶必须先结合A才能结合B，一般选A 作配基，若选B作配基，流动相含A， 洗脱时不含A 如NADH使乳酸脱氢酶吸附在固定化丙酮酸类似物上，洗脱液中不含NADH，脱氢酶被洗脱,再生,通常无需再生 非特异性吸附由于变性蛋白沉积，用6mol/L脲 提纯t-PA、干扰素 干扰素：细
19、胞诱导产生，杂蛋白多，(NH4)2SO4 沉淀，凝胶过滤，离交，电泳，产率10% 亲和层析，一步提纯3600倍，活力回收率高,应用举例,1. t-PA的纯化 组织纤溶酶原激活剂（t-PA）是一种糖蛋白，具有激活纤溶酶原、促进血纤维蛋白溶解的作用，是治疗血栓等心脑血管疾病的蛋白药物。 赖氨酸、精氨酸、氨基苄脒和纤维蛋白与t-PA具有亲和结合作用，常用做亲和色谱纯化t-PA的配基。 图5-3是利用精氨酸-Sepharose 4B亲和色谱法纯化猪心组织t-PA的结果。原料为猪心丙酮粉经醋酸钾抽提、硫酸铵沉淀。,图5-3 精氨酸- Sepharose 4B 亲和色谱,2. 干扰素的纯化 干扰素（interferon，IFN） 对癌症、肝炎等疾病具有特殊疗效。 IFN主要分、和三种类型，可通过动物细胞培养或重组DNA大肠杆菌发酵大量生产。 色素亲和色谱、固定化金属离子亲和色谱和免疫亲和色谱可用于IFN的纯化。 如图5-3是利用单抗免疫亲和色谱法纯化源于大肠杆菌的重组人白细胞干扰素（rhIFN- ）的操作条件和结果。rhIFN- 的比活提高了1150倍，收率达95。,图5-4 单抗免 疫亲和色谱法 纯化rhIFN-,1凝胶层析的原理是什么？ 2 亲和层析的原理是什么？ 3例举三种以上亲和作用的分子对。,