南开生化课件chapter1.ppt

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1、蛋白质化学,第 一 章,chemistry of Protein,本章的重点和难点 重点：掌握组成蛋白质的氨基酸的结构特点、分类、 三个字母代号及重要理化性质； 掌握蛋白质1-4级结构特点、作用力； 了解蛋白质结构与功能的关系； 了解蛋白质的重要理化性质。 难点：氨基酸结构特点、酸碱性质、等电点；蛋白质 各级结构的概念和特点、结构与功能的关系； 蛋白质重要理化性质的应用。,第一节 概 述,一、什么是蛋白质?,蛋白质是一切生物体中普遍存在的，由20种左右天然-氨基酸通过肽键相连形成的高分子含氮化合物；其种类繁多，具有一定的相对分子量、复杂分子结构和特定生物学功能；是表达生物遗传性状的一类主要物质

2、。,二、蛋白质在生命中的重要性,恩格斯曾指出：“生命是蛋白体的存在方式，这种存在方式本质上就在于这些蛋白体的化学组成部分的不断的自我更新。” 第一，蛋白体是生命的物质基础； 第二，生命是物质运动的特殊形式，是蛋白体的存在方式； 第三，这种存在方式的本质就是蛋白体与其外部自然界不断 的新陈代谢。,1.蛋白质是生物体内必不可少的重要成分，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。 蛋白质占干重 人体中（中年人） 人体 45% 水55% 细菌 50%80% 蛋白质19% 真菌 14%52% 脂肪19% 酵母菌 14%50% 糖类1% 白地菌 50% 无机盐7%,三、 蛋白质具有重要的生物学功能,2.蛋

3、白质是一种生物功能的主要体现者，它参与了几乎所有的生命活动过程。 1）作为生物催化剂（酶） 2）代谢调节作用 3）免疫保护作用 4）物质的转运和存储 5）运动与支持作用 6）参与细胞间信息传递 3.外源蛋白质有营养功能，可作为生产加工的对象。,Fireflies emit light catalyzed by luciferase（荧光素酶） with ATP,A few examples on protein diversity,Erythrocytes（红细胞） contain a large amount of hemoglobins（血红蛋白）, the oxygen-transpor

4、ting protein.,The protein keratin （角蛋白） is the chief structural components of hair, horn, wool, nails and feathers.,四、蛋白质的元素组成,1.主要有C、H、O、N和S，有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘。 碳 50 氢 7 氧 23 氮 16% 硫 0-3 其他 微量,（1）一切蛋白质都含N元素，且各种蛋白质的含氮量很接近， 平均为16；,（2）蛋白质系数：任何生物样品中每1g N的存在，就表示 大约有100/16=6.25g 蛋白质的存在，

5、 6.25被称为蛋白质 系数,100克样品中蛋白质的含量 ( g ) = 每克样品含氮的克数 6.25100,1/16%,2.蛋白质元素组成的特点：,凯氏定氮法测定粗蛋白含量,五、蛋白质的分类,（一）、依据蛋白质的外形分为球状蛋白质和纤维状蛋白质 1.球状蛋白质：外形接近球形或椭圆形，溶解性较好，能形成结晶， 大多数蛋白质属于这一类。 2.纤维状蛋白质：分子类似纤维或细棒。它又可分为可溶性纤维状蛋 白质和不溶性纤维状蛋白质。 （二）、依据蛋白质的组成分为简单蛋白和结合蛋白 1.简单蛋白：又称为单纯蛋白质；这类蛋白质只含由-氨基酸组成的 肽链，不含其它成分。 （1）清蛋白和球蛋白：广泛存在于动物

6、组织中，易溶于水，球蛋白 微溶于水，易溶于稀酸中。 （2）谷蛋白和醇溶谷蛋白：植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀 碱中，后者可溶于7080乙醇中。 （3）精蛋白和组蛋白：碱性蛋白质，存在与细胞核中。 （4）硬蛋白：存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织中，分为角 蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。,2.结合蛋白：由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成 （1）色蛋白：由简单蛋白与色素物质结合而成。如血红蛋白、叶绿蛋白和细胞 色素等。 （2）糖蛋白：由简单蛋白与糖类物质组成。如细胞膜中的糖蛋白等。 （3）脂蛋白：由简单蛋白与脂类结合而成。 如血清-、-脂蛋白等。 （4）核蛋白：由简单蛋白与核酸结合而成。

7、如细胞核中的核糖核蛋白等。 （5）磷蛋白：由简单蛋白质和磷酸组成。如胃蛋白酶、酪蛋白、角蛋白、弹性 蛋白、丝心蛋白等。 （三）、按功能分为活性蛋白和非活性蛋白 （四）、按营养价值分为完全蛋白和不完全蛋白 蛋白质的互补作用,第 二 节 氨基酸化学（重点）, 组成蛋白质的基本单位,存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种，且均属 L-氨基酸（甘氨酸除外）。,一、氨基酸的结构与分类,(2). 除甘氨酸外，其它所有氨基酸分子中的-碳原子都为不对称碳原 子。 A. 氨基酸都具有旋光性； B. 每一种氨基酸都具有D-型和L-型两种立体异构体。目前已 知的天然蛋白质中氨基酸都为L

8、-型。,（一）氨基酸的结构 氨基酸是蛋白质水解的最终产物，是组成蛋白质的基本单位。从蛋白质水解物中分离出来的氨基酸有二十种，除脯氨酸和羟脯氨酸外，这些天然氨基酸在结构上的共同特点为：,(1). 分子中同时含有羧基和氨基，且与羧基相邻的-碳原子上都有一 个氨基，因而称为-氨基酸。,COOH H2N CH -碳原子基团 R R基团,-氨基酸基本结构通式,这些基本术语要清楚？,-碳原子 不对称碳原子 旋光性 D-型和L-型两种立体异构体,（二）氨基酸的分类,* 20种氨基酸的英文名称、缩写符号及分类如下:,中性AA （1）按R基团的酸碱性分 酸性AA 碱性AA （2）按R基团的疏水性和亲水性分 疏水

9、性R基团AA 亲水性R基团AA,（3）按R基团的化学结构分 脂肪族A 芳香族AA 杂环族AA,甘氨酸 glycine Gly G 5.97,丙氨酸 alanine Ala A 6.00,缬氨酸 valine Val V 5.96,亮氨酸 leucine Leu L 5.98,异亮氨酸 isoleucine Ile I 6.02,苯丙氨酸 phenylalanine Phe F 5.48,脯氨酸 proline Pro P 6.30,（非极性）疏水性氨基酸,色氨酸 tryptophan Try W 5.89,丝氨酸 serine Ser S 5.68,酪氨酸 tyrosine Try Y 5.6

10、6,半胱氨酸 cysteine Cys C 5.07,蛋氨酸 methionine Met M 5.74,天冬酰胺 asparagine Asn N 5.41,谷氨酰胺 glutamine Gln Q 5.65,苏氨酸 threonine Thr T 5.60,2. 极性（亲水）中性氨基酸,天冬氨酸 aspartic acid Asp D 2.97,谷氨酸 glutamic acid Glu E 3.22,赖氨酸 lysine Lys K 9.74,精氨酸 arginine Arg R 10.76,组氨酸 histidine His H 7.59,3. 酸性氨基酸,4. 碱性氨基酸,由两种酸性

11、氨基酸衍生的两种酰胺,Gln（谷氨酰胺） Asn（天门冬酰胺）,脂肪族氨基酸： 中性aa：甘、丙、缬、亮、异亮、丝、苏 酸性aa及酰胺：谷氨酸、谷氨酰胺、天门冬氨酸 及天门冬酰胺 碱性aa：精、赖、组 芳香族aa： 苯丙、色、酪 杂环aa： 脯、组 课后自己总结： 含S的aa？ 含酚羟基的aa? 含羟基的aa? 含酰胺基的aa? 含二硫键的aa?,（三）人体所需的八种必需氨基酸 赖氨酸(Lys) 缬氨酸(Val) 蛋氨酸(Met) 色氨酸(Trp) 亮氨酸(Leu) 异亮氨酸(Ile) 苏氨酸(Thr) 苯丙氨酸(Phe) 婴儿时期所需: 精氨酸(Arg)、组氨酸(His) 早产儿所需：色氨酸

12、(Trp)、半胱氨酸(Cys),必需氨基酸 生命活动所必需的，但人体自身不能合成，必须从食物中摄取的氨基酸。 半必需氨基酸 在人体内合成速度很低，特别是新生儿或患病期，但又需要给予补充的氨基酸。 非必需氨基酸 人体自身能够合成的氨基酸。,（四）几种特殊的氨基酸,脯氨酸 （唯一的亚氨基酸） 什么是亚氨基酸？, 半胱氨酸,胱氨酸,氨基酸衍生物,课后思考！,非蛋白质氨基酸有哪些？ 什么是天然氨基酸？ D-型氨基酸的存在？,二、氨基酸的重要理化性质,1. 两性解离及等电点,氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。,等电点(isoelectric point, pI) 在某一pH的溶液中，

13、氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。,pH=pI,pHpI,pHpI,氨基酸的兼性离子,阳离子,阴离子,氨基酸等电点的计算,侧链不含离解基团的中性氨基酸：pI = (pK1 + pK2 )/2 酸性氨基酸：pI = (pK1 + pKR-COO- )/2 碱性氨基酸：pI = (pK2 + pKR-NH2 )/2,An acidic amino acid pI=(pK1+pKR)/2,A basic amino acid pI=(pKR+pK2)/2,2. 紫外吸收,大多数蛋白质含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸这三种氨基酸残基，

14、所以在280nm有最大吸收，测定蛋白质溶液的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。,芳香族氨基酸的紫外吸收,氨基酸与水合茚三酮共热，发生氧化脱氨反应，生成NH3与酮酸。水合茚三酮变为还原型茚三酮； 加热过程中酮酸裂解，放出CO2，自身变为少一个碳的醛。水合茚三酮变为还原型茚三酮； NH3与水合茚三酮及还原型茚三酮脱水缩合，生成蓝紫色化合物。,3. 与茚三酮的反应,反应要点： A. 该反应由NH2与COOH共同参与，-氨基酸特有的反应； B. 茚三酮是强氧化剂； C. 该反应非常灵敏，可在570nm测定吸光值； D. 测定范围：0.550g/mL； E. 脯氨酸与茚三酮直接生成黄色物质

15、，在440nm测定（不释放NH3），谷氨酰胺和天门冬酰胺与茚三酮直接生成棕色物质。 应用： A. 氨基酸定量分析（先用层析法分离） B. 氨基酸自动分析仪： 用阳离子交换树脂，将样品中的氨基酸分离，自动定性定量，记录结果。,蛋白质的水解性质,酸水解：可以获得除Trp外的全部氨基酸 碱水解：目的是测定Trp，消旋 酶水解：慢，但不破坏任何氨基酸 课后比较三种水解方法的优缺点？,蛋白质的分子结构包括： 一级结构(primary structure) 二级结构(secondary structure) 三级结构(tertiary structure) 四级结构(quaternary structur

16、e),第三节、蛋白质的分子结构,（一）基本概念 * 肽键(peptide bond)是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键。,一、肽(peptide),+,甘氨酰甘氨酸,肽键,* 肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。,* 两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽,* 肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基(residue)。,* 由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽(polypeptide)。,N 末端：多肽链中有自由氨基的一端 C 末端：多肽链中有自由羧基的一端 多肽

17、链的表示方法：从N端开始到C端 可用aa中文第一个字或英文连字体或单字母 中间用 “”或”-”连接,多肽有两端：,多肽链(polypeptide chain)是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。 氨基酸顺序是指在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列。,N末端,C末端,牛核糖核酸酶,环状肽：指没有自由的-氨基端和- 羧基 端的肽。,（一）定义 蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序，指蛋白质的aa组成和排序、二硫键数目、肽链数目、末端aa的种类等等。,二、蛋白质的一级结构,主要的化学键 肽键，有些蛋白质还包括二硫键。,目 录,（二）、多肽链中氨基酸序列分析,分析已纯化蛋白质的氨基酸残

18、基组成,测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基,把肽链水解成片段，分别进行分析,测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法,一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然 后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序结果。,蛋白质顺序测定的基本战略,测定N末端AA的方法,DNFB法 PITC法 DNS-氯法,反应特点: A. 为- NH2的反应； B. 氨基酸- NH2的一个H原子可被烃基取代(卤代烃)； C. 在弱碱性条件下，与DNFB发生芳环取代，生成二硝基苯 氨基酸。 应用： 鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸，首先由Sanger应用，确定了胰岛素的一级结构，肽

19、分子与DNFB反应，得DNP-肽，水解DNP-肽，得DNP-N端氨基酸及其他游离氨基酸，分离DNP-氨基酸。,(1) 与2，4-二硝基氟苯（DNFB）反应,Edman 降解法（苯异硫氰酸酯法）:氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。 肽链（N端氨基酸）与PITC偶联，生成PTH-氨基酸，分离PTH-氨基酸。 氨基酸自动测序仪就是根据这个原理设计的。,(2) 与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应,用DNS-氯(二甲基萘磺酰氯)测定N端氨基酸 水解后的DNS-氨基酸不需分离，可直接用电泳或层析法鉴定，由于DNS有强烈荧光，灵

20、敏度比DNFB法高100倍，比Edman法高几到十几倍，可用于微量氨基酸的定量。,(3) DNS-氯法,C末端测定法,肼解法 羧肽酶法（重点） 羧肽酶A 羧肽酶B,常用的断裂多肽链的方法,溴化氰裂解法： 专一性水解Met的羧基端； 胰蛋白酶水解法： 专一性水解Lys、Arg的羧基端； 胰凝乳蛋白酶水解法： 专一性水解Tyr、Phe、Trp的羧基端； 胃蛋白酶水解法： 专一性断裂键两端都是疏水氨基酸； 金黄色葡萄球菌蛋白酶水解法：专一性水解Glu、 Asp的羧基 端； 梭状芽孢杆菌蛋白酶水解法： 专一性水解Arg的羧基端；,用于氨基酸顺序分析的其他颜色反应,坂口反应-Arg 米伦反应-tyr 福

21、林反应- tyr 乙醛酸反应-trp 半胱氨酸反应-cys Pauly反应- tyr,his 例如：p70第5题,三、蛋白质的二级结构,主要的化学键： 氢键,（一）肽单元,参与肽键的6个原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，C1和C2在平面上所处的位置为反式(trans)构型，此同一平面上的6个原子构成了所谓的肽单元 (peptide unit) 。,组成肽键的原子处于同一平面； 肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转； 在大多数情况下，以反式结构存在。,肽键的特点,几个基本概念,肽单位：指多肽链上从一个a-碳原子到相邻的a-碳原子之间的结构，它是肽链主链骨架中的重复结构。 肽平

22、面：由于肽键具有部分双键的性质，因而不能自由旋转，使得肽键所连接的6个原子处于同一个平面上。这个平面称为肽平面。 a-碳原子的二面角：多肽链中C-N和C-C之间都是单键，可以自由旋转，其中C-N旋转角度由表示。 C-C间旋转角度由表示，它们被称为a-碳原子的二面角。 肽单位的三个显著特征：肽平面、a-碳原子的二面角、反式结构。 一级结构的最小单位是aa残基，高级结构的最小单位是肽单位。,（二）、蛋白质二级结构的主要形式,-螺旋 ( -helix ) -折叠 ( -pleated sheet ) -转角 ( -turn ) 无规则卷曲 ( random coil ),1. -螺旋,（1） 什么是

23、a-螺旋结构?,定义 指肽链主链骨架围绕中心轴盘绕折叠所形成的有规则的结构，每圈螺旋含3.6个aa残基。螺旋的螺距为0.54nm，结构的稳定是靠链内的氢键。 结构特征 * 类似棒状结构，紧密卷曲的多肽链构成了棒的中心部 分，侧链R伸出到螺旋的外面，完成一个螺旋需3.6个氨 基酸残基，螺旋每上升一圈，螺距为0.54nm，相邻两个 氨基酸残基之间的轴心距为0.15nm； * a-螺旋结构的稳定主要靠链内氢键，氢键形成于第一个 氨基酸残基的羧基与线性顺序中的第五个氨基酸的氨 基，氢键环内包含13个原子，因此a-螺旋通常的表示法为 ns(n为每螺旋中包含的氨基酸残基数，s为氢键环内包含的 原子数）；

24、* 大多数蛋白质中的a-螺旋为右手螺旋。,* 有些结构不易形成a-螺旋,Gly和Pro不易形成a-螺旋； 多聚大侧链aa； 多聚相同电荷aa。,2.-折叠,什么是 -折叠结构？,定义 指是由两条或两条以上几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间氢键交联而成。肽链的主链成锯齿状折叠构象。 结构特征 在 -折叠中，-碳原子总是处于折叠线上，氨基酸的侧链都垂直于折叠片平面，交替地分布在片状平面的上面或下面，以避免R基团的空间障碍； 相邻两个氨基酸之间的轴心距为0.35nm； 几乎所有肽键都参与链内氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直。有链内氢键和链间氢键； -折叠有两种类型。一种为平行式，即所有肽链的N-

25、端都在同一边。另一种为反平行式，即相邻两条肽链的方向相反。,3. -转角和无规则卷曲,-转角,无规则卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。,b turn (b -bend or hairpin发卡 turn) is also a common secondary structure found where a polypeptide chain abruptly reverses its direction.,Relative probabilities that a given amino acid will occur in the three common types of se

26、condary structure.,(三) 超二级结构和结构域 （）超二级结构 在蛋白质分子中，由若 干相邻的二级结构单元组合 在一起，彼此相互作用，形 成有规则的、在空间上能辨 认的二级结构组合体。几种 类型的超二级结构： ； ； Rossmann卷曲 在球状蛋白质中，常见两个聚集体连在一起，形成 结构。, ,（）结构域 对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个或两个以上相对独立的三维实体缔合而成三级结构。这种相对独立的三维实体就称结构域。 结构域通常是几个超二级结构的组合，对于较小的蛋白质分子，结构域与三级结构等同，即这些蛋白为单结构域。 结构域一般由100200个氨基酸残基组成，氨

27、基酸可以是连续的，也可以是不连续的 结构域之间常形成裂隙，比较松散，往往是蛋白质优先被水解的部位。酶的活性中心往往位于两个结构域的界面上 结构域之间由“铰链区”相连，使分子构象有一定的柔性，通过结构域之间的相对运动，使蛋白质分子实现一定的生物功能。,纤连蛋白分子的结构域,Structural domains in the polypeptide troponin (肌钙蛋白) C, two separate calcium-binding domains,（3）分子伴侣(chaperon),分子伴侣通过提供一个保护环境从而加速蛋白质折叠成天然构象或形成四级结构。,* 分子伴侣可逆地与未折叠肽段

28、的疏水部分结合随后松开，如此重复进行可防止错误的聚集发生，使肽链正确折叠；,* 分子伴侣也可与错误聚集的肽段结合，使之解聚后，再诱导其正确折叠；,* 分子伴侣在蛋白质分子折叠过程中二硫键的正确形成起了重要的作用。,四、蛋白质的三级结构,整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。,（一） 定义,亚基之间的结合力主要是疏水作用，其次是氢键和离子键。,五、蛋白质的四级结构,蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。,有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基 (subunit)。,血

29、红蛋白的四级结构的测定由佩鲁茨 1958年完成，其结构要点为： 球状蛋白，寡聚蛋白，含四个亚基 两条链，两条链，22 链：141个残基； 链：146个残基 分子量65 000 含四个血红素辅基 亲水性侧链基团在分子表面，疏水性基团在分子内部,蛋白质分子中的结构层次: 一级结构二级结构超二级结构结构域三级结构亚基 四级结构,目 录,维系蛋白质分子的一级结构：肽键、二硫键 维系蛋白质分子的二级结构：氢键 维系蛋白质分子的三级结构：疏水相互作用力 氢键 范德华力 盐键 维系蛋白质分子的四级结构：范德华力、盐键,第四节 蛋白质结构与功能的关系,（一）一级结构决定其空间结构,一、蛋白质一级结构与功能的关

30、系,天然状态，有催化活性,尿素、 -巯基乙醇,去除尿素、 -巯基乙醇,非折叠状态，无活性,如何证明？- Anfinsen的实验,Anfinsen的实验,有活性球状分子核糖核酸酶（氢键、二硫键）8M尿素、巯基乙醇变性为伸展的分子，生物活性消失透析除去变性剂和还原剂酶的活性大部分恢复，伸展的多肽链重新折叠，二硫键正确配对；还原后的核糖核酸酶8M尿素重新氧化无活性错乱的核糖核酸酶微量巯基乙醇有活性核糖核酸酶（二硫键正确配对）。,说明什么问题？,A：蛋白质的变性是可逆的，变性蛋白质在一定条件下是 可以恢复活性的； B：恢复的原因是在一定条件下可自身折叠成天然构象； C：前两项根源是蛋白质之所以能形成复

31、杂的三级结构， 所需要的全部信息都包含在一级结构中； D：一级结构决定它的高级结构。,（二）一级结构与功能的关系,1、同源蛋白质的研究：也叫同功能蛋白质，有助于研究生物进化。 A、同源蛋白质的概念： 是指在不同生物体中实现同一功能的蛋白质。它的一级结构中有许多位置的aa对所有种属来说都是相同的，称为不变残基。其他位置的aa差异较大，称为可变残基。这种aa顺序中的相似性称为顺序同源现象。 B、举例： 如细胞色素c，120个物种，28个aa位置不变，是维持构象上发挥功能的必要部位。可变残基随进化而变异，亲缘关系越近，aa差异越小（绘出进化树）。,2、一级结构相同，功能相同，一级结构的细小变化导致功

32、能完全不同。 A、分子病的概念：由于遗传基因的突变导致蛋白质分子 结构的改变或某种蛋白质缺乏引起的疾病。 B、例如：镰刀性贫血病,Mutation and molecular interactions changes,二、蛋白质空间结构与功能的关系,蛋白质具有特有的空间构象，因而就有相应的生物学功能。 举例说明：不同的aa顺序可以产生相同的空间构象，因而执行相同的生物学功能。,（一）肌红蛋白与血红蛋白的结构 与功能,1、结构 肌红蛋白： 一条肽链。一个血红素辅基，75%为-螺旋，内部为非极性aa，血红素在表面，通过His93和His64与内部相连，His64存在于第六位配位键上，可避免Fe2+

33、氧化。 血红蛋白： 四条肽链。2条链，2条链，4个血红素辅基，每条1个，由4个原卟啉和1个铁原子组成，形成6个配位键，4个与原卟啉的N原子结合，1个与His93结合，另1个可与O2或水结合，当未与O2结合时。Fe2+处于高自旋状态，使这种6位结合形成一个“圆屋顶”，Fe2+高出屋顶，不稳；当与O2结合后，Fe2+变为低自旋状态，Fe2+落入环中而不稳。构象改变也影响其它亚基结合O2。,2、氧合曲线不同，血红蛋白的结合O2曲线为S型， 肌红蛋白为双曲线，也就是血红蛋白与O2结合具 有协同性，为什么？ 血红蛋白由四个亚基组成，脱氧时，四条链的C端均参与盐桥的形成，多个盐桥的存在使它处于高度约束状态

34、，当一个氧分子冲破某种阻力与血红蛋白的一个亚基结合后，这些盐桥打断，使亚基构象发生改变，而引起邻近亚基的构象发生改变，这种变化易于和O2的结合，并继续影响第三个和第四个亚基与O2的结合。由此Monod提出了蛋白质的变构作用。,Hb与Mb一样能可逆地与O2结合， Hb与O2结合后称为氧合Hb。氧合Hb占总Hb的百分数（称百分饱和度）随O2浓度变化而改变。,肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线,* 协同效应(cooperativity),一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。 如果是促进作用则称为正协同效应 (positi

35、ve cooperativity) 如果是抑制作用则称为负协同效应 (negative cooperativity),血红素与氧结合后，铁原子半径变小，就能进入卟啉环的小孔中，继而引起肽链位置的变动。,什么是波尔（Bohr）效应？,它主要描述pH值或H+浓度和CO2分压的变化对血红蛋白结合氧能力的影响，在pH值一定的情况下，CO2分压升高，血红蛋白对氧的结合能力降低；降低pH值（H+浓度升高），促进血红蛋白释放氧，此现象由丹麦科学家C. Bohr发现，因此称为Bohr效应。,Bohr效应的生理意义,A：当血液流经组织，特别是代谢旺盛的组织如肌肉 时，这里的pH较低，CO2浓度较高，氧合血红蛋

36、白释放O2，使组织获得更多O2，供其需要，而O2 的释放，又促使血红蛋白与H+与CO2结合，以缓 解pH降低引起的问题。 B：当血液流经肺时，肺O2升高，因此有利于血红蛋 白与O2结合，促进H+与CO2释放，CO2的呼出又有 利于氧合血红蛋白的生成。,为什么2，3-二磷酸甘油的存在可以降低血红蛋白与O2的亲和力，有何生理意义？,A：BPG是红细胞在无氧或缺氧情况下的代谢产物。Hb与BPG结合后，氧曲线向右移，降低了血红蛋白与O2的结合能力，释放O2供组织需要。它在血液中与血红蛋白等摩尔存在。 B：BPG只影响Hb与O2的结合，不影响Hb O2与O2的亲和力。 C：为什么？ *血红蛋白四个亚基中

37、央有一个孔穴，BPG就结合在这个孔穴中，在生理条件下，BPG带负电荷，可与血红蛋白两条链上带正电荷的碱性aa形成盐键，加上原来的八个盐键，使血红蛋白结构十分稳定，不易结合O2(脱氧情况下)。 *氧合情况下，O2的结合已经打断了盐键，使链相互接近，中央孔穴变小，无法再容纳BPG分子，同时构象变化使BPG无法与链上碱性aa形成盐键，因此BPG无法结合进入Hb O2分子内。,第五节,蛋白质的理化性质与分离,（一）蛋白质的两性电离,一、理化性质,蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。,* 蛋白质的等电点( isoelec

38、tric point, pI) 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。 * 处于等电点的蛋白质溶解度最低.,（二）蛋白质的胶体性质,蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1100nm，为胶粒范围之内。,* 蛋白质胶体稳定的因素 双电层 水化层,蛋白质胶体性质,由于蛋白质分子量很大，在水溶液中形成1-100nm的颗粒，因而具有胶体溶液的特征。可溶性蛋白质分子表面分布着大量极性氨基酸残基，对水有很高的亲和性，通过水合作用在蛋白质颗粒外面形成一层水化层，同时这些颗粒带有电荷，因而蛋

39、白质溶液是相当稳定的亲水胶体。,蛋白质胶体性质的应用 透析法:利用蛋白质不能透过半透膜的的性质，将含有小分子杂质的蛋白质溶液放入透析袋再置于流水中，小分子杂质被透析出，大分子蛋白质留在袋中，以达到纯化蛋白质的目的。这种方法称为透析（dialysis）。 盐析法:在蛋白质溶液中加入高浓度的硫酸铵、氯化钠等中性盐，可有效地破坏蛋白质颗粒的水化层。同时又中和了蛋白质表面的电荷，从而使蛋白质颗粒集聚而生成沉淀，这种现象称为盐析（salting out）。,（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固,* 蛋白质的变性(denaturation) 在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构

40、变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。,造成变性的因素 如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等 。,变性后蛋白质的特征,处于伸展状态，溶解度降低，易酶解，分子的不对称性增加。,应用举例 临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。 此外，防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。,若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation) 。,天然状态，有催化活性,尿素、 -巯基乙醇,去除尿素、 -巯基乙醇,非折叠状态，无活性,* 蛋白质沉淀 在一定条件下，蛋白质疏水侧链暴露

41、在外，肽链会 相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变性的蛋白质 易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。,可分为两种类型： 可逆性沉淀作用：蛋白质发生沉淀后，用透析等方法除去 沉淀剂，可使蛋白质重新溶于原来的溶 液中。 不可逆性沉淀作用：蛋白质发生沉淀后，不能用透析等方法 除去沉淀剂使蛋白质重新溶于原来的溶 液中。,主要沉淀因素及机理： 无机盐类：如硫酸铵，破坏其双电层，使蛋白质失去 电荷而析出。 重金属盐类：在碱性条件下，蛋白质带负电荷，可以 与重金属离子结合，形成不溶性重金属 蛋白盐沉淀，如醋酸铅、硫酸铜等。 有机溶剂：破坏水化层，使蛋白质分子间静电作用增 加而聚焦沉淀，如乙醇、丙酮等。

42、 生物碱试剂：在酸性条件下，蛋白质带正电荷，与生 物碱试剂结合形成溶解度极小的盐类， 如三氯乙酸、单宁酸等。,（四）蛋白质的含量测定方法,（1) 紫外吸收法 （2）考马斯亮蓝G-250法 （3）Folin法,（五）蛋白质的呈色反应, 茚三酮反应(ninhydrin reaction) 蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。, 双缩脲反应(biuret reaction) 蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。,双缩脲反应,蛋白质在碱性溶液中也能与硫酸铜发生相同反应，产生红紫色络合物,红紫色络合物,(硷性

43、溶液),Cu2+,二、蛋白质的分离和纯化,（一）、 一般步骤 1、材料的预处理 2、破碎细胞 3、蛋白质的粗提（与杂质分开） 4、将蛋白质沉淀出来（等电点、盐析法、 有机溶剂法） 5、粗制品的纯化（凝胶过滤法、纤维素柱 色谱法、亲和层系法）,Protein Purification,Selection of a protein source,Homogeniza-tion and solubilization,Ammonium sulfate precipitation,Dialysis,Further purification,Ultracentrifugation,Electrophore

44、sis,Chromatography,（二）、蛋白质的纯化方法,（1）透析及超滤法,* 透析(dialysis) 利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。,* 超滤法 应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。,（2）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀,*使用丙酮沉淀时，必须在04低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。,*盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。,* 免疫沉淀法：

45、将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。,（3）电泳,蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳(electrophoresis) 。 根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。,几种重要的蛋白质电泳 *SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。 *等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。 *双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术。,Native PAGE

46、SDS-PAGE,（4）层析,层析(chromatography)分离蛋白质的原理 待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。,蛋白质分离常用的层析方法 离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。 凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。 亲和色谱法原理：是根据许多蛋白质对特定的化学基团具有专一性结合的原理，将配基颗粒装入一定规格的玻璃管中制成亲和柱，当蛋白质溶液经过时，与之特异结合到

47、柱上，不能结合者就洗脱下来，然后采用一定的pH和离子强度的洗脱条件，将与配基结合的特异性蛋白质洗脱下来达到纯化的目的。,Gel filtration chromatography,Ion exchange chromatography,Affinity chromatography,（5）超速离心,* 超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。,*蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentation coefficient, S)表示，沉降系数与蛋白质的密度和形状相关 。,Ultracentrifugation,因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。,三、蛋白质分子量测定方法,1.凝胶过滤法：分子量对数对洗脱体积作图，并用标准分子量蛋白质作对照，从图中就可以查得未知蛋白质的分子量。 2.SDS-PAGE电泳法： 电泳：带电颗粒在电场中向着与之所带电荷相反的电极方向移动的现象。在电