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1、培养基的配制、分装和灭菌,一. 实验目的,明确培养基的配制原则； 掌握配制培养基的一般方法和步骤； 了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围； 掌握高压蒸汽灭菌技术，了解几种常用灭菌方法。 熟悉分离、培养微生物前的有关准备工作及操作方法。,二. 实验材料,药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂等。 仪器：高压蒸汽灭菌器、恒温干热灭菌箱。,其它：天平、牛角匙、电炉、1N NaOH、pH试纸、 刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻棒、 带玻璃珠的三角瓶、带棉塞的无菌试管、 无棉塞的空试管、培养皿、吸管、 各种包装纸、防水纸、绳索、棉花、标签等,（一）培养基的制备 （1）培养基是人工按一定比例配制的供微生物生
2、长繁殖和合 成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材 料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。根据微 生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和 配制方法。 （2）制备流程： 称量溶解蒸煮调pH分装包扎灭菌,三. 实验原理,(3)操作步骤： 1）称药品 按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放人热水中，牛肉膏便与称量纸分离，立即取出纸片。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。 2）加热溶解 在烧杯中加入少于所需要的水量，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体
3、培养基，则将称好的琼脂放入已溶解的药品中，再加热融化，此过程中需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。,3）调pH 检测培养基的pH，若pH偏酸，可滴加1滴1molL-1NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用1molL-1HCl进行调节。pH的调节通常放在加琼脂之前。应注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。 4）过滤 液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利结果的观察。但是供一般使用的培养基，该步可省略。,固体分装,5）分装 披实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用漏斗以免使培养基沾
4、在管口或瓶口上面造成污染。 分装量：固体培养基约为试管高度的15，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜。半固体培养基以试管高度的1/3为宜。灭菌后垂直待凝。,液体分装,试管,三角烧瓶,试管,三角烧瓶,1/3,1/4,1/2,1/5,1/2,6）加棉塞 试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞。棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。要使棉塞总长约35塞入试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的通气，则可用8层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。 7）包扎 加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛
5、皮纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。 8）培养基的灭菌时间和温度，需按照各种培养基的规定进行，以保证灭菌效果和不损培养基的必要成份。培养基经灭菌后，必须放37温室培养24h，无菌生长者方可使用。,培养基分装,斜面制作,包扎成捆挂标签,（4）关键步骤及注意事项 要严格按配方配制。 调pH不要过头。 干热灭菌要注意物品不要堆放过紧，注意温度的时间控制，70C以下放物、取物。 高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零取物。,（二）灭菌 灭菌：用物理或化学的方法杀灭物体上一切微生物。 （1）干热灭菌法：把待灭菌的物品均匀地放入烘箱中，升温 至160C，恒温1小时即可。此法适用于玻璃皿、金
6、属用 具等的灭菌。 （2）高压蒸汽灭菌法（一般121C，30min，适用培养基）： 把待灭菌的物品放在一个可密闭的加压蒸汽灭菌锅中进 行的，以大量蒸汽使其中压力升高。由于蒸汽压的上 升，水的沸点也随之提高。在蒸汽压达到1.055 公斤/厘 米2时，加压蒸汽灭菌锅内的温度可达到121C。在这种 情况下，微生物（包括芽孢）在1520 分钟便会被杀 死，而达到灭菌目的。如灭菌的对象是砂土、石蜡油等 面积大、含菌多、传热差的物品，则应适当延长灭菌时 间。,高压蒸汽灭菌法 1加水 将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的 水，以水面与三角架相平为至。 2装料 将装料桶放回锅内，装入待灭菌的物品。装有培
7、养基的容器放置时要防止液体溢出，瓶塞不要紧贴桶 壁，以防冷凝水沾湿棉塞。 3加盖 将盖上与排气孔相连接的排气软管插人内层灭菌 桶的排气槽内，摆正锅盖，对齐螺口，然后以同时旋紧 相对的两个螺栓的方式拧紧所有螺栓，并打开排气阀； 4排气 加热。待水煮沸后，水蒸汽和空气一起从排气孔 排出。一般认为，当水沸后约5min，表明锅内空气已排 净。 5升压 当锅内空气排净时，即可关闭排气阀，压力开始 上升。,6保压 当压力表指针达到所需压力刻度时，控制热源。 开始计时并维持压力至所需时间。本实验用121， 20min灭菌。 7降压 达到所需灭菌时间后，关闭热源，让压力自然下 降到零后，打开排气阀。放净余下的
8、蒸汽后，再打开锅 盖，取出灭菌物品，倒掉锅内剩水。 8无菌检查 将已灭菌培养基于37培养24h，无杂菌生 长，即可待用。,注意事项：使用灭菌锅应严格按照操作程序进行，避免发生事故；灭菌时，操作者切勿擅自离开，务必待压力下降到零后，才可打开锅盖。,（3）间歇灭菌法：待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，每天 蒸煮1次，每次煮沸1h，连续3d 重复进行。在每两次蒸 煮之间，将物品（指培养基）放在37C恒温条件下培养 过夜，这样可以使每次蒸煮后未杀死残留的芽孢萌发成 营养体，以便下次蒸煮时杀灭。 （4）巴氏灭菌法：有些食物会因高温破坏营养成分或影响质 量，如牛奶、酱油、啤酒等，所以只能用较低的温度来 杀死其中的病原微生物，这样既保持食物的营养和风 味，又进行了消毒，保证了食品卫生。该法一般在 62，30分钟既可达到消毒目的。此法为法国微生物学 家巴斯德首创，故名为巴氏消毒法。,