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1、第一章第一章 菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养 1 1 微生物工业用菌微生物工业用菌 2 2 种子扩大培养种子扩大培养 2.1 2.1 工业微生物的培养方法工业微生物的培养方法 2.2 2.2 影响种子质量的因素影响种子质量的因素 2.3 2.3 种子扩培的实例种子扩培的实例 q 诱变育种：诱变是工业发酵稳产高产的重要保证； q 从自然界分离：目前土壤中已分离的微生物不到总数 的1%，微生物的多样性仍然是以后若干年的研究重点； q 基因重组：基因定向改造技术大大加快了生物产品开 发的进程。 从自然界中分离菌种的一般过程 采样 预处理 培养 菌落的选择 产品的鉴定 抗生素生产有关的微生物 放
2、线菌（链霉素四 环素；红霉素等） 真菌（青霉素、头孢等） 一些产芽孢的细菌 植物或动物来源 氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚， 代谢途径比较简单 谷氨酸发酵的菌种： 其它氨基酸生产菌： 棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小 杆菌属的棒型细菌 常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌 选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯 草芽孢杆菌 氨基酸生产有关的微生物 食品工业微生物 包括：酿造业，酶制剂等 食品用的微生物需经过严格的毒理试验，目前已同意 使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。 淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌 和地衣牙孢杆菌 q 能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成 产物 q 有
3、关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的 可操作性要强 q 遗传性能要相对稳定 q 不易感染它种微生物或噬菌体 q 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病 菌无关） q 生产特性要符合工艺要求 种子：将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产 菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐 级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯 种培养物称为种子。 种子扩培的目的 q 接种量的需要 q 菌种的驯化 q 缩短发酵时间、保证生产水平 种子的要求： q 总量及浓度能满足要求 q 生理状况稳定，个体与群体 q 活力强，移种至发酵后，能够迅速生长 q 无杂菌污染 实
4、验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等 实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室 完成，因此将其称为实验室阶段的种子培养。 培养基：保证培养基的质量，有利于菌体的生长 减少传代次数 孢子培养时注意湿度，子斜面使用一般不超过1个月 生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工厂归发 酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。 培养基：控制成本，驯化；营养比发酵培养基丰富。 种子扩培的两个阶段 静置培养法：嫌气发酵，如酒精、丙酮、丁醇、乳酸等 通气培养法 深层 浅层 固体 液体 液体 固体 解释特点适用范围 固体培 养 即曲法培养，源于传 统制曲技术 酶活力高 可调
5、温湿度 酿造业 液体深 层培养 液体培养，深层通风可调节各种环境因素： 营养物浓度，温湿度等 ；无菌操作要求高 几乎所有好气 发酵：如有机 酸、氨基酸等 载体培 养 可重复使用的多孔材 料，严格控制营养条 件，结束后挤压培养 液抽提产物 兼具固体培养法与液体 培养法的优点 可培养霉菌、 酵母、放线菌 等 两步法 液体深 层培养 将营养生长期与生产 期分开，分别控制不 同条件 工艺可达到最优 过程繁琐 氨基酸生产 2.3 种子扩大培养举例 例一、谷氨酸生产的种子制备 斜面菌种 一级种子培养二级种子培养 发酵 1、斜面 (AS1.299) 培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化钠 0.5 琼脂 2
6、%， pH 7.0-7.2 培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细 培养条件：32，生长18-24小时 生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过 3次 2. 一级种子（摇瓶） 培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200-250ml,32培 养12小时。 培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆 2.5%， K2HPO4 0.1% 培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基 本接近于发酵培养基 3. 二级种子(种子罐) 培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%）， 32培养7-10个小时 培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替 ，浓度为2.5% 培养基的特点：长菌
7、体，更接近于发酵培养基 种子的质量要求： 108-109个/ml 大小均匀，呈单个或八字排列 PH 7.0-7.2时结束，6.887.0-7.2 活力旺盛 二、青霉素生产的种子制备 安培管 斜面孢子 大米孢子 一级种子 二级种子 发酵 一、斜面孢子 培养基：甘油、 葡萄糖、 蛋白胨等 培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细 培养条件：25、7天, 注意湿度50%左右 二、大米孢子 培养基：大米及氮源（玉米浆） 培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表 面积和氧的传质，营养适当（要求大米 的白点小）有利于孢子的生长。 培养条件：25、7天，控制湿度 大米孢子的要求：1粒米含1.4*106个
8、孢子 3、一级种子 培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆 目的：长菌体 培养条件：27，40小时 接种量：200亿孢子/吨 4、二级种子 培养基：同上 培养条件：27、10-14小时 接种量：10% 种子的质量要求 菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于 期 青霉素发酵菌丝体的生长共分为6个期，1-4为年青期 ，4-6期合成青霉素的能力最强 种龄 种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐 或发酵罐时的培养时间。 种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。 原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较 大，但是最终由实验结果定。 接种量的确定 移入种子的体积 接种量 接种后培养液的体积
9、过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为7- 15%。但是一般认为大一点好。 双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。 倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。 发酵级数的确定 一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第 一级种子罐开始计算发酵级数 确定依据： 发酵规模、菌体生长特性、接种量 级数大，难控制、易染菌、易变异，难管理，一般2-4级 谷氨酸的三级发酵： 一级种子（摇瓶）二级种子 （小罐）发酵 青霉素的三级发酵： 一级种子 （小罐）二级种子（中罐）发酵 小节： 常见工业微生物的种类和用途 生产菌种的来源与保护 控制种子质量的基本方法和手段 问题： 在生产过程中如何控制种子质量？ EndEnd Thanks!Thanks!