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1、第五章 蛋白质的生物合成 翻译,主要内容,第一节 蛋白质合成体系的组成,一.基因与基因表达的一般概念 基因作为唯一能够自主复制、永久存在的单位，其生理学功能以蛋白质形式得到表达。DNA序列是遗传信息的贮存者，它通过自主复制得到永存，并通过转录生成mRNA，翻译生成蛋白质的过程控制所有生命现象。 编码链（coding strand）又称sense strand，是指与mRNA序列相同的那条链。非编码链（anticoding strand），又称antisense strand，是指那条根据碱基互补原则指导mRNA生物合成的DNA链。,Genetic information is perpetua
2、ted by replication（复制）in which a double- stranded nucleic acid is duplicated to give identical copies. 基因表达包括转录（transcription）和翻译（translation）两个阶段。转录是指拷贝出一条与DNA链序列完全相同（除了TU之外）的RNA单链的过程，是基因表达的核心步骤。翻译是指以新生的mRNA为模板，把核苷酸三联子遗传密码翻译成氨基酸序列、合成蛋白质多肽链的过程，是基因表达的最终目的。 只有mRNA所携带的遗传信息才被用来指导蛋白质生物合成，所以人们一般用U、C、A、G这4
3、种核苷酸而不是T、C、A、G的组合来表示遗传性状。所谓翻译是指将mRNA链上的核苷酸从一个特定的起始位点开始，按每3个核苷酸代表一个氨基酸的原则，依次合成一条多肽链的过程。,二. 遗传密码三联子,mRNA上每3个核苷酸翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸，这3个核苷酸就称为一个密码，也叫三联子密码。翻译时从起始密码子AUG开始，沿mRNA53的方向连续阅读直到终止密码子，生成一条具有特定序列的多肽链。 mRNA中只有4种核苷酸，而蛋白质中有20种氨基酸，若以一种核苷酸代表一种氨基酸，只能代表4种(41=4)。若以两种核苷酸作为一个密码（二联子），能代表42=16种氨基酸。而假定以3个核苷酸代表一个
4、氨基酸，则可以有43=64种密码，满足了编码20种氨基酸的需要。,50-60年代破译遗传密码方面的三项重要成果： （1）Paul Zamecnik等人证实细胞中蛋白质合成的场所。他们把放射性标记的氨基酸注射到大鼠体内，经过一段时间后收获其肝脏，进行蔗糖梯度沉淀并分析各种细胞成份中的放射性蛋白质。 如果注射后经数小时（或数天）收获肝脏，所有细胞成份中都带有放射性标记的蛋白质; 如果注射后几分钟内即收获肝脏，那么，放射性标记只存在于含有核糖体颗粒的细胞质成份中。,2）Francis Crick等人第一次证实只有用三联子密码的形式才能把包含在由AUGC四个字母组成遗传信息（核酸）准确无误地翻译成由2
5、0种不同氨基酸组成的蛋白质序列，实现遗传信息的表达。 实验1: 用吖啶类试剂（诱导核苷酸插入或丢失）处理T4噬菌体rII位点上的两个基因，使之发生移码突变（frame-shift），就生成完全不同的、没有功能的蛋白质。 实验2: 研究烟草坏死卫星病毒发现，其外壳蛋白亚基由400个氨基酸组成，相应的RNA片段长1200个核苷酸，与密码三联子体系正好相吻合。,实验3: 以均聚物为模板指导多肽的合成。 在含有tRNA、核糖体、AA-tRNA合成酶及其它蛋白质因子的细胞抽提物中加入mRNA或人工合成的均聚物作为模板以及ATP、GTP、氨基酸等成分时又能合成新的肽链，新生肽链的氨基酸顺序由外加的模板来决
6、定。 1961年，Nirenberg等以poly（U）作模板时发现合成了多聚苯丙氨酸，从而推出UUU代表苯丙氨酸（Phe）。以poly（C）及poly（A）做模板分别得到多聚脯氨酸和多聚赖氨酸。 实验4: 以特定序列的共聚物为模板指导多肽的合成。以多聚二核苷酸作模板可合成由2个氨基酸组成的多肽， 5UGU GUG UGU GUG UGU GUG3,不管读码从U开始还是从G开始，都只能有UGU（Cys）及GUG（Val）两种密码子。,实验5: 以共聚三核苷酸作为模板可得到有3种氨基酸组成的多肽。如以多聚（UUC）为模板，可能有3种起读方式： 5UUC UUC UUC UUC UUC3或 5UCU
7、 UCU UCU UCU UCU3或 5CUU CUU CUU CUU CUU3分别产生UUC（Phe）、UCU（Ser）或CUU（Leu）. 多聚三核苷酸为模板时也可能只合成2种多肽：5GUA GUA GUA GUA GUA3或5UAG UAG UAG UAG UAG3或5AGU AGU AGU AGU AGU3由第二种读码方式产生的密码子UAG是终止密码，不编码任何氨基酸，因此，只产生GUA（Val）或AGU（Ser）。 实验6: 以随机多聚物指导多肽合成。Nirenberg等及Ochoa等又用各种随机的多聚物作模板合成多肽。例如，以只含A、C的多聚核苷酸作模板，任意排列时可出现8种三联子
8、，即CCC、CCA、CAC、ACC、CAA、ACA、AAC、AAA，获得由Asn、His、Pro、Gln、Thr、Lys等6种氨基酸组成的多肽。,（3）氨基酸的“活化”与核糖体结合技术。 如果把氨基酸与ATP和肝脏细胞质共培养，氨基酸就会被固定在某些热稳定且可溶性RNA分子（transfer RNA，tRNA）上。现将氨基酸活化后的产物称为氨基酰-tRNA（aminoacyl-tRNA），并把催化该过程的酶称为氨基酰合成酶（aminoacyl-tRNA Synthetase）。 以人工合成的三核苷酸如UUU、UCU、UGU等为模板，在含核糖体、AA-tRNA的反应液中保温后通过硝酸纤维素滤膜，
9、只有游离的AA-tRNA因相对分子质量小而通过滤膜，而核糖体或与核糖体结合的AA-tRNA则留在滤膜上，这样可把已结合与未结合的AA-tRNA分开。,当体系中带有多聚核苷酸模板时，从大肠杆菌中提取的核糖体经常与特异性氨基酰-tRNA相结合。如果把核糖体与poly（U）和Phe-tRNAPhe共温育，核糖体就能同时与poly（U）和Phe-tRNAPhe相结合。,4种核苷酸组成61个编码氨基酸的密码子和3个终止密码子，它们不能与tRNA的反密码子配对，但能被终止因子或释放因子识别，终止肽链的合成。由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象称为简并（degeneracy），对应于同一氨基酸的密码子称为
10、同义密码子（synonymous codon）。,一个氨基酸可以有几个不同的密码子的特性。 同义密码子：编码同一个氨基酸的一组密码子。 注意：Trp 和 Met只有一个密码子。Leu、Arg、Ser 均有6个密码子。,ATG CGG三.遗传密码的特点 AAA TGG CCG AAT GAT,三.遗传密码的特点,（1） 密码的无标点性、无重叠性,（2）密码子的简并性,密码子的通用性是指生物细胞共同使用同一套遗传密码字典。只有在一些线粒体中使用的遗传密码与通用密码有所区别。所以说遗传密码基本通用，但非绝对通用。,（3）密码子的通用性和例外,( 4 ) 起始密码子和终止密子,在64个密码子中，有3个
11、密码子不编码任何氨基酸，从而成为肽链合成的终止信号，称为终止密码子或无义密码子，它们是UAA、UAG、UGA。其余的61个密码子均编码不同的氨基酸，其中AUG既是Met的密码子，又是肽链合成的起始信号，称为起始密码子。,（5）密码子的摆动性,密码子的专一性主要是由前两位的碱基决定，而第三位碱基有较大的灵活性。,四、参与蛋白质合成的三类RNA及核糖体,1.rRNA 与蛋白质一起构成核糖体蛋白质合成“工厂” 核糖体结构组成 核糖体的基本功能 结合mRNA，在mRNA上选择适当的区域开始翻译 密码子（mRNA）和反密码子（tRNA）的正确配对 肽键的形成 存在 核糖体可游离存在，真核中，也可同内质网
12、结合，形成粗糙的内质网。原核中，与mRNA形成串状多核糖体,原核生物核糖体组成,真核生物核糖体组成,2. tRNA 结合氨基酸：一种氨基酸有几种tRNA携带，结合需要ATP供能,氨基酸结合在tRNA3-CCA的位置。 反密码子：每种tRNA的反密码子，决定了所带氨基酸能准确的在mRNA上对号入座 。 反密码子与mRNA的第三个核苷酸配对时，不严格遵从碱基配对原则,3. mRNA 携带着DNA的遗传信息，是多肽链的合成模板 在原核细胞内，存在时间短，在转录的同时翻译 在真核细胞内，较稳定 蛋白质合成时，mRNA结合于核糖体小亚基上，大亚 基结合带氨基酸的tRNA，tRNA的反密码子与mRNA密码
13、子配对，ATP供能，合成蛋白质。,四. 核糖体,核糖体像一个能沿mRNA模板移动的工厂，执行着蛋白质合成的功能。它是由几十种蛋白质和几种核糖体RNA（ribosomal RNA，rRNA）组成的亚细胞颗粒。一个细菌细胞内约有20000个核糖体，而真核细胞内可达106个，在未成熟的蟾蜍卵细胞内则高达1012。核糖体和它的辅助因子为蛋白质合成提供了必要条件。,1.核糖体的组成 原核生物核糖体由约2/3的RNA及1/3的蛋白质组成。真核生物核糖体中RNA占3/5，蛋白质占2/5。核糖体是一个致密的核糖核蛋白颗粒，可以解离为两个亚基，每个亚基都含有一个相对分子质量较大的rRNA和许多不同的蛋白质分子。
14、 大肠杆菌核糖体小亚基由21种蛋白质组成，分别用S1S21表示，大亚基由33种蛋白质组成，分别用L1L33表示。真核生物细胞核糖体大亚基含有49种蛋白质，小亚基有33种蛋白质。,2.核糖体的功能 核糖体包括至少5个活性中心，即mRNA结合部位、结合或接受AA- tRNA部位（A位）、结合或接受肽基tRNA的部位、肽基转移部位（P位）及形成肽键的部位（转肽酶中心），此外还有负责肽链延伸的各种延伸因子的结合位点。小亚基上拥有mRNA结合位点，负责对序列特异的识别过程，如起始位点的识别和密码子与反密码子的相互作用。大亚基负责氨基酸及tRNA携带的功能，如肽键的形成、AA- tRNA、肽基- tRNA
15、的结合等。A位、P位、转肽酶中心等主要在大亚基上。,核糖体可解离为亚基或结合成70S/80S颗粒。翻译的起始阶段需要游离的亚基，随后才结合成70S/80S颗粒，继续翻译进程。体外反应体系中，核糖体的解离或结合取决于Mg2+离子浓度。在大肠杆菌内，Mg2+浓度在10-3mol/L以下时，70S解离为亚基，浓度达10-2mol/L时则形成稳定的70S颗粒。细胞中大多数核糖体处于非活性的稳定状态，单独存在，只有少数与mRNA一起形成多聚核糖体。它从mRNA的5末端向3末端阅读密码子，至终止子时合成一条完整的多肽链。mRNA上核糖体的多少视mRNA的长短而定，一般40个核苷酸有一个核糖体。,多肽链合成
16、的起始 多肽链的延伸 多肽链终止和释放,一、原核生物蛋白质合成的分子机制,第二节、蛋白质生物合成的机理,（1）、70S核糖体的解聚 （2）、30S核糖体IF1.3复合物的形成 （3）、 30S核糖体起始复合物的形成 （4）、 70S核糖体起始复合物的形成,（一）原核生物中多肽链的起始,1、起始事件,2、多肽链起始事件的顺序过程,起始RNA,甲酰甲硫氨酸-tRNA转移酶以N10-甲酰基四氢叶酸为甲基供体催化甲酰甲硫氨酸-tRNA的甲酰化,可被E.coli 核糖体识别的不同S-D序列,mRNA识别与对准,（1）、氨基酸的进位 （2）、转肽 （3）、移位,3、多肽链的延伸,（1）、氨基酸的进位,E.
17、coli 核糖体中多肽链延伸事情的循环图解,(2)、肽基转移,使70S核糖体与mRNA复合物返回到延伸循环起点的三个 骤： 脱酰基tRNA自P位点的脱离 肽基-tRNA从A位点移到P位点,（3）、移位,23SRNA是实质的肽基移位酶,23SRNA的肽基转移中心 核糖体向后移动，使下一密子进 入A位点 该过程需要EFG的帮助,结合状态模型,肽基转移与移位中核糖体两tRNA分子相对位置模型,GTP水解刺激核糖体构象的改变进而实施其功能,蛋白质合成的能量消耗为每个氨基酸至少需四个高能磷酸键，此外还需两个GTP，运于氨酰-tRNA合成中氨基酸的活化,4、肽链的终止,肽链终止事件,核糖体的生活周期,多聚
18、核糖体是蛋白质合成的活跃结构,多核糖体的电子显微图,E.coli色氨酸操纵子,原核生物中转录与转译间的关系,真核mRNA的特征结构,二、真核细胞的蛋白质合成,43S前起始复合物的形成 43S起始复合物与mRNA的结合及40S核糖体亚基迁移 至正确的起始密码子AUG 80S起始复合物的形成,1、真核蛋白质起始的过程,真核生物中，延伸循环与原核生物中非常相似。三个真核延伸因子称作eIF1、eIF、eIF2,它们具有与相应的细菌延伸因子EF-Tu、EF-Ts、EF-G 类似的功能。,2、真核生物中肽链的延伸,真核生物中一个称为eIF的释放因子识别所有的三个终止密码子,3、真核肽链的终止,真核细胞中转
19、译起始的三个步骤示意图,6、蛋白质合成的抑制剂 抗菌素对蛋白质合成的作用可能是阻止mRNA与核糖体结合（氯霉素），或阻止AA-tRNA与核糖体结合（四环素类），或干扰AA-tRNA与核糖体结合而产生错读（链霉素、新霉素、卡那霉素等），或作为竞争性抑制剂抑制蛋白质合成。 链霉素是一种碱性三糖，干扰fMet-tRNA与核糖体的结合，从而阻止蛋白质合成的正确起始，并导致mRNA的错读。若以poly（U）作模板，则除苯丙氨酸（UUU）外，异亮氨酸（AUU）也会掺入。对链霉素敏感位点在30S亚基上。,嘌呤霉素是AA-tRNA的结构类似物，能结合在核糖体的A位上，抑制AA-tRNA的进入。它所带的氨基与A
20、A- tRNA上的氨基一样，能与生长中肽链上的羧基生成肽键，这个反应的产物是一条3羧基端挂了一嘌呤霉素。 青霉素、四环素和红霉素只与原核细胞核糖体发生作用，从而阻遏原核生物蛋白质的合成，抑制细菌生长。氯霉素和嘌呤霉素既能与原核细胞核糖体结合，又能与真核生物核糖体结合，妨碍细胞内蛋白质合成，影响细胞生长。因此，前3种抗生素被广泛用于人类医学，后两种则很少在医学上使用。,第三节、氨基酸及功能蛋白质合成后的修饰,1.蛋白质刚刚被合成时，都以fMet（原核）或Met（真核）开始，多肽合成后，N端的formyl group、Met残基，有时还包括N揣多个残基或C端的残基都会被切除。50%的真核蛋白中，N
21、-端残基的氨基酸会被N-乙基化。 2.切除信号肽。许多蛋白质都带有15-30个残基的signal peptides，负责指导蛋白质在细胞中的精确定位。 3.特定氨基酸的修饰。,4.氨基酸的糖苷化,5.氨基酸的异戊烯化（Addition of Isoprenyl Groups）,6.有些蛋白质还要与辅基(prosthetic groups)相结合； Cytochrome C只有与血红素（heme）相结合才有功能。此外，Acetyl-CoA羧化酶常与Biotin分子相结合。有些蛋白质必须经蛋白酶切割后才有功能。有些蛋白质只有在形成二硫键之后才有功能。,第四节、蛋白质的运输和降解,1、绝大部分被运入
22、ER内腔的蛋白质都带有一个Signal peptide。该序列常常位于蛋白质的氨基末端，长度一般在13-36个残基之间，有三个特点： （1）一般带有10-15个疏水氨基酸； （2）常常在靠近该序列N-端疏水氨基酸区上游带有1个或数个带正电荷的氨基酸； （3）在其C-末端靠近蛋白酶切割位点处常常带有数个极性氨基酸，离切割位点最近的那个氨基酸往往带有很短的侧链（Ala或Gly）。,研究发现，信号肽把Ribosome牵引到ER上。蛋白质合成之初，一旦信号肽序列的N端暴露在核糖体外，该序列（包括核糖体）就迅速与SRP（signal recognition particle）相结合，诱发SRP与GTP相
23、结合，停止新生肽的进一步延伸（此时新生肽一般长约70个残基左右）。 受位于ER外膜上的SRP-receptor及ribosome-receptor的牵引，这个复合物（GTP-SRP-ribosome-mRNA-新生肽）立即向ER外膜靠拢，并通过peptide transport complex进入ER内腔。,5.Rough ER上的蛋白质常常通过运转载体将经过修饰的蛋白质送入高尔基体，再分别送到各个亚细胞位点。,6.蛋白质中的核定位序列一般不被切除。,蛋白质的核定位是通过多个蛋白的共同作用来实现的。Importin (,亚基)的作用有点像SRP受体。NLS蛋白-Importin复合物停留在核孔上，并在Ran-GTPase的作用下通过核孔。,细菌细胞内也存在类似的蛋白质运转系统。,7、蛋白质降解是一个有序的过程。 在大肠杆菌中，许多蛋白质的降解是通过一个依赖于ATP的蛋白酶（称为Lon）来实现的。当细胞中存在有错误或半衰期很短的蛋白质时，该蛋白酶就被激活。每切除一个肽键要消耗两分子ATP。 在真核生物中，蛋白质的降解需要Ubiquitin，一个有76个氨基酸残基组成极为保守的蛋白参与。与Ubiquitin相连的蛋白将被送到一个依赖于ATP的蛋白质降解系统（Proteasome，Mr. 1106）。,成熟多肽N-端第一个残基对蛋白质的稳定性有重要影响 。,