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1、第13章 基因组学,基因组学,1 基因组学概述 2 基因组图谱的构建 3 基因组测序 4 功能基因组学,本章教学时数：4学时。 本章重点：基因组计划的基本流程。 本章难点：分子标记和基因图谱； 研究基因功能的方法,1 基因组学概述,基因组（genome），又称染色体组 一个物种单倍体的染色体数目，物种全部遗传信息的总和 物种遗传信息的“总词典” 控制发育的“总程序” 生物进化历史的“总档案”,基因组学（genomics）,1986年提出，至今20年，已经发展成为遗传学中最重要的分支学科。 对物种的所有基因进行定位、作图、测序和功能分析,基因组学研究的最终目标,获得生物体全部基因组序列 鉴定所有
2、基因的功能 明确基因之间的相互作用关系 阐明基因组的进化规律,经典遗传学,在20世纪初，遗传学刚刚诞生的时候，遗传学家的工作主要是鉴别感兴趣的基因，确定这些基因在染色体上的位置。 第一个环节：寻找自发突变体，或者利用物理、化学因素诱发突变。 第二个环节：通过连锁分析确定新基因与已知基因的相互关系，绘制遗传连锁图。,几个代表物种的基因组大小,钓鱼 竭泽而渔,CREDIT: JOE SUTLIFF,Science, Vol 291: 1221.,Fishing in a More Effective Way!,基因组学的研究内容,结构基因组学 功能基因组学 蛋白质组学,结构基因组学（structu
3、ral genomics）,基因定位 基因组作图 测定核苷酸序列,功能基因组学（functional genomics）,又称后基因组学（postgenomics) 基因的识别、鉴定、克隆 基因结构、功能及其相互关系 基因表达调控的研究,蛋白质组学（proteomics）,鉴定蛋白质的产生过程、结构、功能和相互作用方式,人类基因组计划,1990，美国国立卫生研究所和能源部投资30亿，启动了人类基因组计划，预计15年时间完成人类基因组全部序列的测定 1996，完成标记密度为0.6cM的人类基因组遗传图谱，100kb的物理图谱 2000，完成草图 2001年2月，公布人类基因组图谱的修订版 200
4、2，完成测序工作,2 基因组图谱的构建,基因组计划的主要任务是获得全基因组序列 但是，现在的测序方法每次只能测8001000bp 大量的测序片段要拼接 要知道序列在Chr上的位置才能正确拼接 基因组计划的第一个环节： 构建基因组图谱,基因组图谱,遗传图谱（genetic map） 物理图谱（physical map）,遗传图谱（genetic map）,采用遗传分析的方法将基因或其它 DNA序列标定在染色体上构建连锁图。,遗传标记,有可以识别的标记，才能确定目标的方位及彼此之间的相对位置。 构建遗传图谱就是寻找基因组不同位置上的特征标记。 包括： 形态标记 细胞学标记 生化标记 DNA分子标记
5、,多态性（polymophism）,所有的标记都必须具有多态性！ 花色：白色、红色 株高：高、矮 血型：A、B、O型 淀粉：糯、非糯 所有多态性都是基因突变的结果！,形态标记,形态性状：株高、颜色、白化症等 又称表型标记 数量少 很多突变是致死的 受环境、生育期等因素的影响,最早建立的果蝇连锁图，就是利用控制果蝇眼睛的形状、颜色，躯体的颜色、翅膀的形状等形态性状作为标记，分析它们连锁关系及遗传距离，绘制而成的。 控制性状的其实是基因，所以形态标记实质上就是基因标记。,果蝇连锁图,细胞学标记,明确显示遗传多态性的染色体结构特征和数量特征 染色体的核型 染色体的带型 染色体的结构变异 染色体的数目
6、变异 优点：不受环境影响 缺点：数量少、费力、费时、对生物体的生长发育不利,生化标记,又称蛋白质标记 就是利用蛋白质的多态性作为遗传标记。 如：同工酶、贮藏蛋白 优点：数量较多，受环境影响小 缺点：受发育时间的影响、有组织特异性、只反映基因编码区的信息,DNA分子标记,简称分子标记 以DNA序列的多态性作为遗传标记 优点： 不受时间和环境的限制 遍布整个基因组，数量无限 不影响性状表达 自然存在的变异丰富，多态性好 共显性，能鉴别纯合体和杂合体,限制性片段长度多态性 （restriction fragment length polymorphism，RFLP）,DNA序列能或不能被某一酶酶切，
7、相当于一对等位基因的差异。 如有两个DNA分子（一对染色体），一个具有某一种酶的酶切位点，而另一个没有这个位点，酶切后形成的DNA片段长度就有差异，即多态性。 可将RFLP作为标记，定位在基因组中某一位置上。 人类基因组中有105个RFLP位点，每一位点只有两个等位基因。,RFLP分析,RFLP标记位共显性标记,微卫星（microsatellite）标记,微卫星又称为简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）。 这种重复序列的重复单位很短，常常只有2个、3个或4个核苷酸 如一条染色体TCTGAGAGAGACGC 另一染色体TCTGAGAGAGAGAGAGAGACGC，
8、就构成了多态性。,遗传图谱的构建方法,理论基础: 连锁与交换 基本方法: 两点测验法和三点测验法,植物遗传图谱的构建,选择研究材料（亲本） 构建分离群体 遗传标记检测 标记间的连锁分析,选择亲本,要求亲缘关系远，遗传差异大 但又不能相差太大以导致引起子代不育。 对备选材料进行多态(差异)性检测，综合测定结果，选择有一定量多态性的一对或几对材料作为遗传作图亲本。,构建作图群体,遗传标记的染色体定位,利用遗传学方法或其它方法将少数标记锚定在染色体上，作为确定连锁群的参照系。 常用的方法： 单体分析 三体分析 代换系分析 附加系分析,标记间的连锁分析,利用在两个亲本间有多态性的标记分析分离群体中所有
9、个体的基因型 根据连锁交换的情况，确定标记之间的连锁关系和遗传距离 有计算机软件可以应用,水稻遗传图,1994年，水稻第一张高密度遗传图谱 927个位点， 1383个标记 1998年，1157个位点，2275个标记 2000年，3267个标记 高密度的遗传图谱为基因组测序和遗传研究奠定了坚实的基础。,人类遗传图谱的构建,不可能根据需要选择亲本，设计杂交组合，构建分离群体！ 只能检测现存家庭连续几代成员的基因型 家系分析法 资料有限、必须借助于统计学方法,现有的人类遗传图谱,122号染色体 8个家系134个成员 X染色体，12个家系170个成员 5364个SSR标记 2335个位点 标记间的平均
10、距离599kb,物理图谱的构建,用分子生物学方法直接检测DNA标记在染色体上的实际位置绘制成的图谱称为物理图谱。 有遗传图谱为什么还要构建物理图谱？,遗传图谱的缺陷,分别率有限 人类只能研究少数减数分裂事件，不能获得大量子代个体 测序要求每个标记的间隔小于100kb 实际是599kb,遗传图谱的缺陷,精确性不够 经典遗传学认为，交换是随机发生的 基因组中有些区域是重组热点 倒位、重复等染色体结构变异会限制交换重组,酵母遗传图与物理图比较,A 遗传图 B 物理图,物理作图的方法,1、限制酶作图 2、依靠克隆的基因组作图 3、荧光原位杂交 4、序列标签位点作图,限制酶作图（restriction
11、mapping）,限制酶作图（restriction mapping）,荧光原位杂交 （fluorescent in situ hybridization，FISH）,荧光原位杂交 （fluorescent in situ hybridization，FISH）,荧光原位杂交 （fluorescent in situ hybridization，FISH）,荧光原位杂交 （fluorescent in situ hybridization，FISH）,人类基因组物理图,1987年，RFLP图谱，403个标记，10Mb 1994年，5800个标记，0.7Mb 1996年，17000多个标记，10
12、0kb 完全适应全基因组测序的要求,遗传图与物理图的整合,有些标记既是遗传标记，又是物理标记 RFLP标记 SSR标记 某些基因序列 借助这些标记可以将遗传图和物理图整合起来,基因组测序策略,有了高密度的基因组图谱，就可以开始全基因组测序了 测序的技术飞速发展，现在可以全自动化 测序的策略有两个： 鸟枪法 克隆重叠群法,鸟枪法（shotgun sequencing）,鸟枪法的优缺点,优点： 不需要高密度的图谱 速度快、简单、成本低 缺点： 拼接组装困难，尤其在重复序列多的区域 主要用于重复序列少、相对简单的原核生物基因组,克隆重叠群法（clone contig）,将基因组DNA切割长度为0.1
13、Mb1Mb的大片段，克隆到YAC或BAC载体上 然后再进行亚克隆，分别测定单个亚克隆的序列 再装配、连接成连续的DNA分子。 这是一种自上而下（up to down）的测序策略 clone-by-clone method,两种基因组测序策略,The E.coli genome,A portion of the E.coli chromosome showing genes and operons. A dot indicates the promoter for each gene or operon. Arrows and color indicate the direction of tr
14、anscribtion: dark blue genes are transcribed left to right, light blue are transcribed right to left.Overlapping gene are shown in green.,功能基因组学,完成基因组测序，仅仅是基因组计划的第一步，更重要的工作在于弄清楚： 基因组序列中所包含的全部遗传信息是什么； 基因组作为一个整体如何行使功能。 就是对基因组序列进行诠释的过程，也就是功能基因组学的研究内容。,根据序列分析搜寻基因,查找开放阅读框（open reading frame, ORF） 开放阅读框都有
15、一个起始密码子，ATG，还要有终止密码子。 从ATG开始，然后向下游寻找终止密码子。 起始密码子和终止密码子之间的碱基数目要能够被3整除 每一条链都有3种可能的阅读框，2条连共计有6种可能的阅读框. 计算机可以很快给出结果。,同源查询,利用已经存入数据库的基因序列与待查的基因组序列比对，从中查找可以与之匹配的碱基序列及其比例，用于界定基因。 同源查询可以部分弥补ORF扫描的不足。,同源查询的依据,有亲缘关系的物种，基因组可能存在某种程度的相似性： 存在某些完全相同的序列； ORF的排列相似，如等长的外显子； ORF指令的氨基酸序列相似； 模拟的多肽链的高级结构相似，等。,基因功能研究,1、计算机预测基因功能 依据仍然是同源性比较。同源基因拥有一个共同的祖先基因，它们之间有许多相似的序列。 种间同源基因 种内同源基因,基因功能研究,2、实验确认基因功能 基因克隆 基因敲除（knock-out） 基因的超表达 反义RNA技术 RNAi 转座子插入突变,反义RNA（antisense RNA）技术,