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1、第十五章 基因工程 Chapter 15 Genetic Engineering,基因重组(gene recombination)是指DNA片段在细胞内、细胞间，甚至在不同物种之间进行交换，交换后的片段仍然具有复制和表达的功能。 基因工程(genetic engineering）是指采用人工方法将不同来源的DNA进行重组，并将重组后的DNA引入宿主细胞中进行增殖或表达的过程，从而改变生物特性或创造新的生物类型的技术。,整合:外来DNA侵入宿主细胞，并与宿主细胞DNA进行重组，成为宿主细胞DNA的一部分，这一过程称为整合。 整合后的外来DNA仍然可随染色体DNA一起复制，并在适当的条件下进行表达
2、，但也可在相当长的一段时间内不表达。,基因工程的操作过程主要由以下步骤组成： 载体和目的基因的分离； 载体和目的基因的切断； 载体和目的基因的重组； 重组DNA的转化和扩增； 重组DNA的筛选和鉴定。,（一）载体：可以将目的基因运载进入细胞并进行复制和表达的DNA分子。 基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。 这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。,载体构建的条件：,1. 能在受体细胞中独立复制。 2. 分子量小，易于分离、纯化、导入 3. 有限制性
3、内切酶位点。 4. 有可供选择的遗传标志。 5. 易于导入受体细胞。,1质粒： 是存在于天然细菌体内的一种独立于细菌染色体之外的双链环状DNA，具有独立复制的能力，通常带有细菌的抗药基因。 最早使用的质粒DNA是人工构建的pBR322，该质粒分子大小为4.3kb，带有抗四环素和抗氨苄青霉素基因，含EcoR，BamH，Hind等单一的限制酶切点。,质粒pUC19的分子结构,2噬菌体：,l可通过转染方式将其DNA送入细菌体内进行增殖。常用的为人工构建的噬菌体载体。噬菌体两端的片段对于其包装是必需的，因而应予保留；而其中间部分则可进行改造或置换，使之具有某种单一的限制酶切点。目的基因与噬菌体DNA进
4、行重组时，可采用插入重组方式，也可采用置换重组方式。,3病毒： 常用的为SV40，通过感染方式将其DNA送入哺乳动物细胞中进行增殖。目前应用相对较少。,（二）目的基因： 目的基因的筛选和分离可采用以下方法进行： 1直接从染色体DNA中分离：仅适用于原核生物基因的分离，较少采用。,2人工合成： 根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。 适应于编码小分子多肽的基因。,l采用一定的方法钓取特定基因的mRNA，再通过逆转录酶催化合成其互补DNA（cDNA），除去RNA链后，再用DNA聚合酶合成其互补DNA链，从而得到双链DNA。这一方法通常可得到可表达的完整基因。,3
5、从mRNA合成cDNA：,4从基因文库中筛选： 将某一种基因DNA用适当的限制酶切断后，与载体DNA重组，再全部转化宿主细胞，得到含全部基因组DNA的种群，称为G文库(genomic DNA library)。 将某种细胞的全部mRNA通过逆转合成cDNA，然后转化宿主细胞，得到含全部表达基因的种群，称为C-文库(cDNA library)。C-文库具有组织细胞特异性。,基因组文库的制作,5利用PCR合成： l如已知目的基因两端的序列，则可采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术，在体外合成目的基因。但此法可能会造成克隆的目的基因碱基序列的改变。,二、
6、载体和目的基因的切断： 通常采用限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)，简称限制酶，分别对载体DNA和目的基因进行切断，以便于重组。限制酶目前已经发现400多种，所识别的顺序往往为4-8个碱基对，且有回文结构。 由限制酶切断后的末端可形成平端、3-突出粘性末端和5-突出粘性末端三种情况。形成粘性末端(cohesive end)者较有利于载体DNA和目的基因的重组。,三、载体和目的基因的重组（接） 即将带有切口的载体与所获得的目的基因连接起来，得到重新组合后的DNA分子。 （一）粘性末端连接法：当载体DNA和目的基因均用同一种限制酶进行切断时，二者即可带有相同的粘性
7、末端。如将载体与目的基因混合在一起，二者即可通过粘性末端进行互补粘合，再加入DNA连接酶，即可封闭其缺口，得到重组体。 较少的情况下，对产生的平端也可直接进行连接。,载体DNA与目的基因的连接,（二）人工接尾法： 即同聚物加尾连接法。当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断，无法得到相同得粘性末端时，可采用此方法。 此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的基因的3-端，如载体上添加一段polyG，则可在目的基因上添加一段polyC，故二者即可通过碱基互补进行粘合，再由DNA连接酶连接。,四、重组DNA的转化和扩增（转） 重组DNA
8、需导入宿主细胞才能进行增殖或表达。重组质粒可通过转化（transformation）方式导入宿主细胞，即将大肠杆菌用CaCl2处理，增加细菌细胞壁的通透性，再与重组质粒DNA短暂温育，质粒DNA即可导入宿主细胞。,如果是用噬菌体作为载体的重组体，则需要用外壳蛋白进行包装，使之成为具有感染能力的噬菌体，再通过转染(transfection)方式将重组噬菌体DNA导入大肠杆菌等宿主细胞。 重组DNA导入宿主细胞后，即可在适当的培养条件下进行培养以扩增宿主细胞。对于质粒DNA，还可通过在培养基中加入氯霉素，抑制细菌蛋白质合成及染色体DNA的复制，以单独扩增细胞中的质粒DNA。,五、重组DNA的筛选和
9、鉴定（筛） 由于重组体导入宿主细胞的比例通常较低，因此需要对含有重组体的宿主细胞进行筛选并作鉴定。可采用以下方法进行： （一）根据重组体的表型进行筛选： 对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用插入灭活法进行筛选。如pBR322中带有抗氨苄青霉素和抗四环素基因，当将目的基因插入抗四环素基因后，就可引起该基因失活，细菌对氨苄青霉素耐药，而对四环素敏感。在含氨苄青霉素的培养基上能够生长，而在含四环素的培养基上不能生长的细菌即为带重组体的细菌。,插入灭活法筛选重组体,（二）根据标志互补进行筛选： 当宿主细胞存在某种基因及其表达产物的缺陷时，可采用此方法筛选重组体。即在载体DNA分子中插入相应的缺陷基因，如宿主细胞重新获得缺陷基因的表达产物，则说明该细胞中带有重组体。,（三）根据DNA限制酶谱进行分析： 经过粗筛后的含重组体的细菌，还需进行限制酶谱分析进一步鉴定。将单一细菌进行扩增后分别提取其DNA，用重组时所用的同一限制酶进行酶切，再将其与不含目的基因的载体一起进行电泳比较分析，如发现出现目的基因片段的电泳带即证明重组体中带有目的基因。,（四）用核酸杂交法进行分析鉴定： l为了进一步鉴定重组基因体中的目的基因，可采用与目的基因部分互补的DNA片段作为探针，与含有重组体的细菌菌落进行杂交，经放射自显影，如结果为阳性，即可确定重组体中带目的基因。,