化学发光技术培训.ppt

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1、化学发光免疫分析技术,培训教材,石家庄华洋分析仪器有限公司,公司简介,华洋分析仪器有限公司是一个集科研、生产、销售为一体的科技型高新技术企业。公司自创始以来，就立足于化学发光免疫分析仪系列产品的生产制造，并于2004年成功研制出第二代化学发光产品：一体化化学发光免疫分析仪。 华洋公司依靠强大的航天技术背景、全套美国进口试剂平台，产品远销欧洲、中东、东南亚等国 家和地区。 公司的宗旨：高新科技创造一流产品，优秀团队造就品牌企业。,公司背景,公司已与国内知名企业厦门万利达集团医学事业部天众达密切合作。万利达集团现已将化学发光事业定为企业重点开展项目，计划投资人民币壹亿七千万元用于该项目，目前已在厦

2、门建立了生产基地，并形成生产流水线。华洋公司与万利达集团强强联手势必创造发光行业奇迹!,一、化学发光免疫分析技术基础知识 、免疫学基础知识 、化学发光检测技术的起源 二、化学发光技术 、化学发光概念 2、化学发光原理 3、化学发光免疫分析技术的发展 、化学发光分析测定物质分类 5、化学发光物简介 、免疫反应的基本类型,主要内容,三、 各类免疫分析技术的比较 1、 放射免疫法缺陷 2、 酶标记免疫分析缺陷 3、 荧光免疫分析技术缺陷 4、 时间分辨荧光免疫分析技术缺陷四、化学发光免疫分析检测技术特点 五、化学发光免疫分析技术的应用 六、公司产品介绍 、仪器型号 、产品检测原理 、产品性能、特点

3、、软件功能,主要内容,七、配套试剂及临床应用 八、实验与操作 九、同类产品生产商介绍 十、与其它同类产品的比较 十一、全自动发光免疫分析产品了解,主要内容,免疫学基础知识,免疫学是一门新兴的学科。它是研究机体免疫系统的组织结构和生理功能的科学。 免疫immune的来源是拉丁字immunis，其原意是免税except from “charges”,引伸为免除疾病。 现代免疫的概念是指机体对“自己”或“非已”的识别，并排除异已的抗原性异物，对自身物质不发生免疫应答而形成免疫耐受性。 免疫系统的重要生理功能就是对“自己”和“非己”抗原的识别及应答。,化学发光免疫检测技术的起源 Halman在1977

4、年基于放射免疫分析的基本原理,将酶的化学发光与免疫反应结合起来,建立了化学发光免疫分析(CLIA)方法。,什么是化学发光,某些化合物可以利用化学反应产生的能量使其产物分子或反应中间态分子上升至电子激发态。当此产物分子或中间态分子衰退至基态时，以发射光子的形式释放能量（即发光）。 化学发光包括了酶联化学发光法；时间分辨荧光法；电化学发光免测定技术；直接化学发光法；偏振荧光法等。,化学发光原理,化学发光是在常温下由化学反应产生的光的发射。化学发光是一个多步骤的过程，其机制为某些化合物（发光剂或发光底物）可以利用一个化学反应产生的能量使其产物分子或反应中间态分子上升至电子激态。当此产物分子或中间态分

5、子衰退至基态时，以发射光子的形式释放能量（即发光）。化学发光系统分为两种类型：一种类型是利用酶产生化学发光信号；另一种类型是采用非酶直接化学发光标记。我们的属于酶促化学发光。,放射免疫分析因标记物的放射性在应用中存在不少问题。为替代这一测定方法，近年来创立了多种新的标记免疫技术。化学发光免疫测定具有明显的优越性：敏感度高，超过RIA；精密度和准确性远高于RIA方法；试剂稳定，无毒害；测定耗时短；测定项目多；已发展成全自动化测定系统。因此化学发光免疫测定在医学检验中不仅能取代RIA，而且可得到更为广泛的应用。,化学发光免疫分析技术的发展,化学发光分析测定物质分类,化学发光分析测定的物质对象可分为

6、三类： 第一类物质是化学发光反应中的的反应物； 第二类物质是化学发光反应中的催化剂，增敏剂或抑制剂; 第三类是偶合反应中反应物，催化剂，增敏剂等。 这三类物质还可以通过标记方式来测定人们感兴区的其他物质。这就拓展了化学发光分析的应用范围。,化学发光物简介,通过化学反应而发光的化学物质很多，经过筛适合化学发光免疫分析的化学发光物仅有几种。 化学发光免疫分析发光物必备条件： 1.发光效率高，能满足免疫分析对灵敏度的要求； 2.稳定性好，不受抗原、抗体及各种介质、pH值等的影响； 3.发光条件温和，自身和发光反应对抗体、抗原以及酶等的活性无破坏作用； 4.无毒害，对人体和环境无毒副作用和有害污染，分

7、子小且结构简单。,1、吖啶酯类 这类发光物是1983年由Wecks等合成并用于免疫分析，这类化学发光物质的分子结构中均有吖啶环，同过氧化酶离子作用而生成激发态中间体，当回到基态时而发出光子。 2、环1，2-二氧乙烷衍生物 化学发光底物主要是磷酸酯，在用碱性磷酸酶标记的免疫分析中作为发光底物使用。目前已实际应用的是AMPPD分子，在碱性磷酸酶的作用下，磷酸酯分解而生成AMPD中间体，此中间体再分解为不稳定的阴离子，当其回到基态时，则发出光子。,3、鲁米诺类 这类化学发光物主要有鲁米诺（luminol，3-氨基邻苯二甲酰肼）及异鲁米诺（4-氨基邻苯二甲酰肼）及其衍生物等，在过氧化酶（如HRP）催化

8、作用下，生成激发态中间体，回到基态时，则发出光信号。由于发光物是由半衰期为2-30分钟的中间体产生的，它所发出的光可持续几十分钟。属于稳定发光法，本系统采用此发光底物。,、过氧草酸盐（peroxalate）（酯） 与鲁米诺相比，过氧草酸盐化学反应的发光效率更高，可达到27%，且在较宽的酸度范围内(PH410)都能发光。 过氧草酸发光体系统可用于测定的物质有：（1）待测物质本身是荧光剂，可作为能量接受体和发光体;(2)待测物质某一反应可产生H2O2等氧化剂而间接被测定；可见过氧草酸盐类化学发光法的分析应用还赖于新荧光衍生剂的开发。,免疫反应的基本类型,1.竞争结合的原理 化学发光物质或酶标记的抗

9、原与未标记的抗原（待测物等）竞争结合形成有限量的特异性抗体复合物。 图示如下：,竞争法定量分析示意图,2.双抗体夹心法的原理,将抗体固定到固相载体的表面，与样品中的抗原反应后，抗原结合到固相抗体上，再加入与抗原另一个结合位点相结合的标记抗体，通过免疫反应，在固相表面生成抗体抗原标记抗体这种夹心式复合物。 图示如下：,夹心法定量分析示意图,1、 标记物和发光底物是什么？ 配套试剂的标记物为：辣根过氧化物酶 发光底物为： 鲁米诺类 2 、试剂发光特点：（稳定发光，平台期很长）,3 、发光底物的忧点： 最高的检测灵敏度 适用于检测各种分子量的物质 稳定的发光底物，检测结果稳定，重复性好 检测线性范围

10、宽 不需要特殊的发光底物-抗原/抗体连接物 方便，容易使用 可应用多种分析模式（夹心，竞争，抗体检测）,00 5 10 发光周期（分钟） 55 60,小结答疑,休息一下,各类免疫分析技术的比较,放射性物质对环境的污染和对身体的危害；半衰期短，导致试剂有效期短；被标记物稳定性差、操作烦琐、费时。,1、 放射免疫法缺陷：,酶标记免疫分析由来已久，但是始终没有能够替代放射免疫。最大优势在于避免了对环境的污染和人体的危害。其灵敏度，重复性不及放免，易造成漏诊和假阳性，一般用于定性检测。因酶的纯度和反应过程易受环境因素影响，导致稳定性不好。,2、 酶标记免疫分析缺陷：,荧光免疫分析原理是利用特定波长的入

11、射光将分子转换到激发态，然后分子回到基态并发射光子。 但有以下干扰因素： 血清样本中存在内源性荧光带，会增强非特异性本底荧光； 样本对荧光光信号的散射也干扰实验结果。,3、 荧光免疫分析技术缺陷：,4、 时间分辨荧光免疫分析技术缺陷： 时间分辨荧光免疫分析技术并没有完全解决上述问题，并且由于其试剂价格较贵、保质期短、试剂易受环境影响不稳定，因此这种技术目前尚处于成熟期。化学发光技术是免疫分析最稳定、有效的方法，完全可以替代常规放射免疫分析方法。,化学发光免疫分析检测技术特点,1灵敏度高：这是化学发光最突出的优越性，其灵敏度可达10-15mol/L（RIA为10-12mol/L）。又如化学发光底

12、物（如AMPPD）可检测出的碱性磷酸酶的浓度比显色底物要灵敏5105倍。 2宽的线性动力学范围：发光强度在46个量级之间与测定物质浓度间呈线性关系。这与显色的酶联免疫分析吸光度（OD值）为2.0的范围相比，灵敏度优势非常明显。虽然RIA也有较宽的线性动力学范围，但放射性限制了其应用。,3光信号持续时间长：辉光型（glow type）的CLIA产生的光信号持续时间可达数小时甚至一 天。简化了实验操作及测量。 4分析方法简便快速：绝大多数项目的测定均为只需加入一种试剂（或复合试剂）的一步法模式。 5. 结果稳定、误差小：样品系直接发光，不需要任何光源照射，免除了各种可能因素（光源稳定性、光散射、光

13、波选择器等）给测试结果带来的影响，使分析结果灵敏、稳定、可靠。,6. 试剂保持期长、浪费少： 试剂货架期长达1年，定标后可2点矫正标准曲线，节约试剂成本。 7. 检测速度快：约3分钟完成96个测试，一个测试大概需时2秒。 8. 缺点：仪器价格较贵，试剂成本较高，目前有些检测项目正在开发中。,化学发光免疫分析技术的应用,一、疾病的防治,传染性疾病：包括病毒性肝炎、肺结核、艾滋病及其它性病、SARS、禽流感以及其它尚未发生而且必有发生的更为可怕的传染病等，在预防传染病方面，使用化学发光免疫分析技术检测献血员血液能有效阻断因输血传染的各种疾病。 肿瘤防治：由于目前尚缺乏肿瘤基层普查的技术和方法，化学

14、发光具有的高度敏感性很适合用于肿瘤的基层普查，通过基层普查，就可以作用于肿瘤的早发现、早手术、早治疗，从而降低肿瘤患者的死亡率，造福于人民。,肥胖性疾病 包括心脑血管病、糖尿病及肾功能疾病，这三类疾病总发病率占到总人口数的67%。由于糖尿病及其病变的特殊性，严重影响了患者的健康和生活质量，已成为了严重的社会问题，因此使用化学发光免疫分析测定血中INS、C肽的含量，对判断胰岛B细胞的生理功能及糖尿病、胰岛素瘤和胰岛素抵抗综合征等有关疾病的早期诊断、疗效观察、发病机理以及临床和基础研究都非常重要。,内分泌疾病 包括甲状腺功能紊乱、性腺激素等系列。以甲状腺为例，通过血清学并配合化学发光免疫检验方法，

15、可以判断甲状腺功能异常的患者的病因和部位，及时的掌握甲状腺激素水平，诊断甲状腺功能低下或亢进。,优生优育,化学发光法可以筛选智商低下的新生儿，如不及时发现和治疗智商低下的新生儿，可造成新生儿不可挽回的终生智商低下。,二、人口素质 预防性体检,由于化学发光检验方法具有很高敏感度，所以能够及时发现人体免疫系统的细微变化，从而从源头上控制对各种疾病或缺陷的发生，因此在预防性体检、优生优育方面、遗传性缺陷控制方面将起到积极的作用。,控制遗传缺陷 DNA也叫脱氧核糖核酸，是存在于细胞核内携带遗传密码的物质，有什么样的DNA就产生什么样的物种和生物个体。因此对DNA的诊断在物种和个体鉴定、疾病诊断、基因研

16、究和应用中具有十分重要的意义，由于能得到绝对的特异性，所以能够以化学发光的方法进行检测。,三、其他 化学发光免疫分析是目前最先进的超微量分析技术，对于病毒、病菌、蛋白质、基因、有机小分子，细胞等均可测定。因此，其应用范围除了医学各科外，在社会的其它方面也有广泛应用。 如： （1）环境检测：农药和工厂排放有害物在水源或土壤中的残留。 （2）饮食行业、农药残留物等的检验。,为什么选择化学发光分析分析仪？ 1敏感度高，超过酶免，荧光免疫，放免等 2试剂稳定，无放射性污染或生物毒性 3测定耗时短，能快速提供结果报告 4测定项目齐全 5已经发展成为全自动的测定系统,小结答疑,公司产品介绍：,半自动化学发

17、光免疫分析仪ECLIAII型,一体化化学发光免疫分析仪 ECLIA-IIM型,产品工作原理,化学发光免疫分析仪是通过检测患者血清从而对人体进行免疫分析的医学检验仪器。将定量的患者血清和辣根过氧化物（HRP）加入到固相包被有抗体的白色不透明微孔板中，血清中的待测分子与辣根过氧化物酶的结合物和固相载体上的抗体特异性结合。分离洗涤未反应的游离成分。,产品检测原理,然后，加入鲁米诺Luminol发光底物液，利用化学反应释放的自由能激发中间体，从基态回到激发态，能量以光子的形式释放。 此时，将微孔板置入分析仪内，通过仪器内部的三维传动系统，依次由光子计数器读出各孔的光子数。样品中的待测分子浓度根据标准品

18、建立的数学模型进行定量分析。最后，打印数据报告，以辅助临床诊断。,样品室,样品池,化学发光测试仪原理示意图, 先进的测定方法：采用高灵敏酶促化学发光 高效的集成设计：精密三维传动，低损耗光纤传动，优良的机器性能及高信噪比运行 灵活的工作模式：单板多项功能测定，适合批量及小型医院或急诊情况随机测试 严格的质量控制：经特殊处理的光吸收表面和最优反射系统。最大限度排除孔间干扰 全面的定量分析：利用两点定标方式校正出厂曲线 精湛的数据处理：中文Windows系统平台，人机对话软件界面。,产品性能,产品特点,化学发光免疫定量分析技术 独有的孔到孔的管理，直观操作精度保证 内置恒温振荡系统，确保检测结果的

19、准确性 自适应量程控制 单点或两点定标方式校正标准曲线，高性能低成本,技术优势：, 独家专利设计，保证邻孔光干扰小于万分之一，避免假阳性样品出现。 独家专利设计，仪器线性量程达到：101600万个相对发光单位（同类产品测量上限只能达到200万）。 单次检测HCG浓度范围：0.1 mIU/ml200000 mIU/ml。即孕妇检测HCG等项目不需稀释血清，方便准确。如果使用线性量程200万的仪器测量，则此类项目大部分均会饱和。 独家内置产前筛查程序，可实现孕妇的唐氏综合征的同期筛查（AFPFree_HCGFreeE3）。,软件功能,多种分析方法选择设定 多板数据及病历联合打印 系统自动错误问题检

20、测，自动报告 检测后设有全盘分析结果预览表，可更直观的观察 历史数据的完全再现功能 单仪器多板操作存储功能 方便的病历信息单杯、整排的多种操作 全中文、人性化的操作界面及提示信息,先进的技术原理： 稳定化学发光的标记技术，单光子计数测试，多元数 据综合处理。 硬件特点： A、采用日本精工的精密传动轨道，精度高、无噪音、 寿命长； B、专利传动机构设计无需维护； C、设置珀莫合金屏蔽层确保适应各种工作环境； D、专利微光检测系统确保测试精度；,1、 产品的技术特点？,小结答疑,E、美国军用光纤信号传输，保证系统高灵敏度； F、军用微波信号处理电路确保系统稳定； G、独家使用三维传动系统，保证测试

21、结果的 准确性。 H、独家采用外壳、内部部件模具批量生产， 保证产品的一致性及高质量 J、系统配置液晶屏显示，关照操作人员健康、 免受辐射。,2、 产品的性能特点 高特异性： 单克隆抗体技术 经典免疫学原理 先进的化学发光免疫分析技术 高灵敏度 采用最灵敏、最稳定的微波信号处理放大系统 采用最持久最稳定的发光剂, 高准确度 超灵敏光电倍增管接收发光信号 发光稳定后，记录10次/s，取均值为结果 系统自动质量控制管理 高稳定性 稳定，持久，保质期超过1年 标准曲线有效期长达28天以上 系统性能自动诊断、自动校正，保证结果的稳定性,休息一下,配套试剂,美国进口试剂平台，国产价格； 两点定标方式，有

22、效节约成本； 试剂3年内可达50降价空间； 仪器试剂高性价比，试剂项目齐全；,试剂特点： 高质量美国原厂配套试剂，无需预处理； 试剂稳定，持久，有效期超过1年； 标准曲线有效期长达28天以上 采用两点定标方式，节约成本 试剂品种齐全：10类40多个品种全部高品质现货提供 试剂所有技术参数条型码管理，防止人为因素错误,化学发光技术的临床应用,1、甲状腺功能类：T3、T4、TSH、FT3、FT4、TG、T-PO 新生儿筛查：T4 s-TSH,化学发光免疫分析,临床意义概述： 甲状腺是人体一个重要的内分泌腺，也是最大的内分泌腺体，甲状腺疾病也是目前最常见最多发一种内分泌疾病，对人体的正常功能可产生明

23、显影响，甚至危及生命。 以上各项目的联合检测，为临床医生对病患者甲状腺功能的评价提供更基础、全面的依据。,2、性腺激素类：HCG、-HCG、FSH、LH、E2、E3、PRL、P、T、GH等,常见疾病的诊查 女性: （1）性早熟： LH, FSH, E2, P （2）青春期发育延迟： LH, FSH, E2, P （3）原发性、继发性闭经： LH, FSH, E2, P 男性： （1）性早熟： LH, FSH, T （2）青春期发育延迟： LH, FSH, T （3）性腺机能减退：FSH, LH, PRL, T （4）乳腺过度发育：，2，PRL （5）精子缺乏： FSH, LH, T,化学发光免

24、疫分析,临床意义概述 性激素是由性器官或肾上腺皮质分泌的，维持和调节机体内正常生命，生理活动和生殖功能的一类甾体激素。 检测这些激素的含量对于生殖生理的研究、疾病的诊断、治疗、随访及计划生育工作的开展具有重要的意义。,3、肝炎类：HBeAg、 HBsAg、 HBe、HBs、HBc,化学发光免疫分析,临床意义概述： 为乙型肝炎临床早期诊断和治疗提供病原学依据 能动态观察疗效和监测病情，对乙肝疫苗免疫力的评价和高危人群预防免疫具有重要意义,相关疾病的诊查 （1）肝肿瘤4项：CEA,AFP,SF,CA19-9 （2）乳腺肿瘤：CEA, CA15-3, CA50, SF （3）卵巢肿瘤：AFP，hCG

25、，CA12-5 （4）肺 癌：SCC，NSE，CK （5）胃部肿瘤：CEA，CA19-9，CA724 （6）前列腺癌：ACP，PACP，PSA，f-PSA （7）结 直 肠：CEA，CA19-9，CA50 （8）大 肠 癌：CEA，CA242,4、肿瘤类：AFP、CEA、 PSA、 PAP、 FPAP、 CA125 CA153、 CA199、 NSE等。,化学发光免疫分析,临床意义概述： 肿瘤标志物（Tumor Markers,TM)是指示体内肿瘤存在并反映其一定的生物特性的生化物质。通过测定其存在或含量，对于肿瘤可辅助诊断，分析病情，指导治疗，监测复发或转移及判断预后等。对现有TM项目进行综

26、合分析、多元分析，筛选出有价值的TM，确定一个最佳组合方式具有极大的临床意义,5、糖尿病及代谢：胰岛素、C-肽、 血清C肽降低见于：1型糖尿病(IDDM)患者。 血清C肽增高见于：胰岛细胞瘤、服用类固 醇激素患者、胰岛素抵抗状态。 6、心血管：CK-MB、BNP、Tn-I、Myoglobin 7、贫血类：铁蛋白、Vite B12、叶酸,优生优育系列（Torch）, 弓形虫抗体TOXO 风疹病毒Rubella 巨细胞抗体CMV 单纯性疱疹病毒抗体I型HSV I 单纯性疱疹病毒抗体II型HSV II,、现有试剂的品种？ 甲状腺激素（甲功7项）； 生殖激素（7项）； 贫血（4项）； 心血管系统（4项

27、）； 肿瘤标志物（9项）； 糖尿病（2项）； 感染性疾病(7项) ； 肾上腺/垂体（3项）； 过敏性疾病（1项） ； 血液病毒（乙肝5项定量）。,小结答疑,实验与操作,样本的收集和准备 样本应该是不同类型的血清，而且应该注意在 静脉抽取时的预防。通过精确的对比以建立正常值， 样本一般为空腹的晨血。收集的样本应该放在促凝管 或者普通的离心管里，里面不要加任何添加剂或胶状 滤物。让血液凝结成块状。然后离心样本，从全血中 分离出血清。 样品在28最长可以保存48小时（甲功类24 小时）。如果48小时内不能出检测结果，就应该放置于 -20，时限是30天。,在做实验之前，应把所使用的试剂、血清、质控放于

28、室温（1827）平衡15分钟。 1.设计好微孔板上标准品以及待测样本的位置及数量。 （把没有用过的微孔板用铝袋，密封，放回28的冰箱） 2.吸取定量的标准品及样品，加入到按照事先设计好 顺序的微孔板里 。 3.每孔加入相应的酶标记物。 4.用封条密封，轻轻地振荡2030秒以便混匀。,实验步骤,5.合适的温度下温育30-60分钟 6.倾倒或抽取微孔板的内容物并弃掉，如果手工洗板，要用滤纸拍干孔内的残留物 。 7.加300L漂洗缓冲液，严格按照说明书洗板。 8.加100L的底物液到所有的孔内。 （ 加样时一定要按照同一顺序加注，以缩小不同孔反应时间的差异） 9. 室温/避光放置5-10分钟，检测每

29、孔的发光值。测试结果应在加入底物后30分钟内完成,说明： 半自动分析仪和一体化分析仪只具备自动检测光子信号功能， 前面几步采用手工完成，增加系统测试的灵活性。 全自动设备全部检测过程自动化,检测步骤示意图：,1.如果是双抗体夹心法检测的样本（即光强度（RLU）随浓度增大而升高），分析方法应该用：四参数夹心法或样条曲线。,结果分析,2.如果是竞争结合法检测的样本（即光强度（RLU）随浓度增大而减小），分析方法应该用： 四参数竞争法或样条曲线,注意事项 1.过期试剂盒严禁使用。 2.以上试剂96孔板专用，不能用于人或动物的内服外用 3.加样器加样时尽量准确，加样时避免产生气泡。 4.试验时,可根据

30、实际情况去除标准中不符合曲线趋势的点.但是,6个标准中至少4个符合曲线的趋势。 6.结果最好在530分钟内检测。 7.检测结果在正常参考值范围的上下限左右时， 要根据临床症状进行诊断，或重新检测。,1、 每个项目的检测时间？ 准备工作时间：30分钟60分钟 测试时间：96个样本测试只需要3分钟,小结答疑,、每板加样时间要求？ 每板首末标本加样时间总长不能超过1分钟。,本仪器一经售出，将实行终生跟踪终生负责制，我们对每台售出产品建立档案，以便跟踪服务。我们在全国每省设有总经销代理商，要求每个代理至少设有三到四位产品技术服务工程师，并对每位工程师进行强化训练，以便及时为客户服务。 产品承诺保修三年，终生维护，二十四小时之内上门服务，一年内仪器出现质量问题二次以上免费更换新仪器。,三、售后服务与承诺,我们始终坚信极致的产品和优良的品质是以“我们始终坚信极致的产品和优良的品质是以“人才为本、科技领先、 管理创新、人性化设计和满意化服务”为基石的；我们忠于自己忠于消费者，不遗余力；我们深信，付出忠诚就能获得信赖。,总经理郝书顺先生与土耳其外商签订协议,总经理与外商密切交流,外商对本公司新产品的关注,谢谢再见,