酶工程1(中国药科大学生物工程所有课件).ppt

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1、第三章 酶工程,酶工程简介 酶工程（Enzyme engineering）是指通过化学方法、酶学方法和DNA重组技术改善自然酶的形成、结构和性质，提高酶的催化活性、降低成本并在大规模工业化生产中应用。 主要内容： 1 酶的制备和酶与细胞的固定化 2 酶反应器的设计和放大 3反应条件的控制和优化 .,第一节 概 述,酶工程的分类,化学酶工程：通过对酶的化学修饰或固定化处理，改善酶的性质，提高酶的效率和降低成本，甚至通过化学合成法制造人工酶，也称为初级酶工程； 生物酶工程：用基因工程技术生产酶以及对酶基因进行修饰或设计性能稳定、具有新的生物活性及催化效率更高的酶，也称为高级酶工程。,一、酶的定义

2、酶是由生物体内活细胞产生的一种生物催化剂，按化学组成的不同主要分为核酸类酶（R酶）和蛋白质类酶（P酶）。,二、酶的分类与命名法 1 习惯命名法 底物名称： 淀粉酶、蛋白酶 催化反应性质：氧化酶、转氨酶 底物结合催化反应性质：胆固醇氧化酶、醇脱氢酶 来源：心肌黄酶、含铁酶 缺点：无系统性，一酶数名或一名数酶。,2 系统命名法与分类 国际生化联合会（IUB）酶学委会于1961年规定了酶的统一命名法及分类原则。 系统命名法：酶的名称由底物及反应类型两部分组成。 六大类：氧化-还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶和连接酶。,三、酶的结构和特性 1 酶的结构 酶的组成成分 单纯酶仅由蛋白质组成的酶。

3、结合酶除蛋白质外，还有非蛋白质的成分。 全酶=酶蛋白+辅因子 辅因子有两种：辅酶和辅基,根据酶的聚合状态，酶可以分为三类： 单体酶 寡聚酶 多酶复合体,酶的活性中心指酶分子中直接和底物结合，并和酶催化作用直接相关的部位。 组成： 由一些氨基酸残基的侧链基团组成。这些基团在一级结构上可能相聚很远，甚至可能不在一条肽链上，但在蛋白质空间结构上彼此靠近，形成具有一定空间结构的区域。 对于结合酶，辅因子常常是活性中心的组成部分。,酶活性中心的特点： 活性中心在酶分子总体积中只占相当小的部分（1-2%），相当于2-3个氨基酸。 都是酶分子表面的一个凹穴，有一定的大小和形状，但不是刚性的，而具有一定的柔性

4、。 活性中心为非极性的微环境，有利于与底物结合。 底物与酶通过形成较弱键力的次级相互作用并结合到酶的活性中心。 酶的活性部位并不是和底物的几何图形正好吻合，而是在酶与底物结合的过程中，底物分子或酶分子或它们两者的构想同时发生一定变化后才能相互契合，这时催化基团的位置也正好处于所催化底物的敏感化学键部位。,2 酶的特性 催化效率高 专一性强 反应条件温和 催化活性受到调节和控制,四、酶的来源 酶作为生物催化剂普遍存在于动物、植物和微生物中，可直接从生物体中分离提纯。 酶的生产方法可分为提取法发酵法以及化学合成法。 化学法仍在实验室阶段； 提取法是最早采用且沿用至今的方法，如从动植物组织液中提取胰

5、蛋白酶和菠萝蛋白酶； 发酵法是50年代以来酶生产的主要方法，如生成葡萄糖异构酶和枯草芽孢杆菌蛋白酶等。,五、酶促动力学 六、酶的分离纯化与酶的活力测定 1 酶的分离纯化 细胞外酶和细胞内酶 在生物细胞内除了目标酶还有很多其他的酶，因此需要分离和纯化的步骤。 基本步骤： 破碎细胞膜 抽提 纯化,比活力：纯度的量度，指每毫克质量的蛋白质中所含的某种酶的催化活力，一般用单位/毫克蛋白（U/mg蛋白质表示）。酶的比活力越高，酶的纯度也就越高。 纯化倍数=每次比活力/第一次比活力 产率%=每次总活力/第一次总活力,2 酶的活力测定 1个酶活力国际单位是指在特定条件下，1min内生成1mol产物的酶量（或

6、转化1 mol 底物的酶量）。,第二节 酶和细胞固定化,酶固定化技术发展史,20世纪60年代，以色列科学家发现酶的固定化现象。 1969年，千畑一郎等将固定化氨基酰化酶应用于生产L-氨基酸，开创了固定化酶应用于工业生产的先例； 1971年召开的第一届国际酶工程会议上，建议采用统一的英文名称Immobilized Enzyme； 1973年，固定化大肠杆菌菌体中的天冬氨酸酶连续生产L-天冬氨酸。 1986年，利用固定化原生质体发酵生产碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶等相继获得成功。,一、固定化酶的制备,固定化酶的定义： 固定化酶是指限制或固定于特定空间位置的酶，具体来说，是指经物理或化学方法处理，使酶变

7、成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。 广义的固定化酶包括： 固定化辅酶；固定化细胞；固定化细胞器 为了减少从微生物或者其他生物体中提取酶的麻烦，有时为了充分利用生物细胞的多酶系统，开发另外一种固定化催化剂的形式，固定化细胞。,固定化酶的特点 具有生物催化剂的功能，又有固相 催化剂的功能。 可重复使用，降低成本； 反应后，酶底物产物易分开，产物中无残留酶，易纯化，产品质量高。 稳定性提高，反复使用多次后，酶的活力无明显下降； 反应条件易于控制，可以自动控制，节约劳动力。,固定化酶的制备原则,（1）必须注意维持酶的构象，特别是活性中心的构象。 （2）酶与载体必须有一定的结合程

8、度。酶的固定化既不影响酶的原有构象，又能使固定化酶能有效回收贮藏，利于反复使用。 （3）固定化应有利于自动化、机械化操作。这要求用于固定化的载体必须有一定的机械强度，才能使之在制备过程中不易破坏或受损。 （4）固定化酶应有最小的空间位阻。 （5）固定化酶应有最大的稳定性。在应用过程中，所选载体应不和底物、产物或反应液发生化学反应。 （6）固定化酶的成本适中。,酶和细胞固定化方法 酶和细胞固定化方法 载体结合法 交联法 包埋法 网格型 微囊型 物理吸附法 离子结合法 共价结合法 热处理（细胞）,酶和细胞固定化模式,结晶法,使酶结晶从而实现固定化的方法。 载体是酶蛋白本身。 对于活性低的酶，可以提

9、高酶浓度和单位体积的活力。 局限性：在重复使用中，酶有损耗。,（ 1 ）吸附法,通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法，是固定化中最简单的方法。 吸附法又可分为物理吸附法和离子吸附法。,物理吸附法,物理吸附法(physical adsorption)是通过非特异性物理吸附作用将酶直接吸附在水不溶性载体表面上而使酶固定化的方法。包括范德华力、疏水相互作用、氢键。 物理吸附法常用的载体： 有机载体：纤维素、胶原、淀粉及面筋等； 无机载体：活性炭、氧化铝、皂土、多孔玻璃、硅胶、二氧化钛、羟基磷灰石等。,离子吸附法,离子吸附法(ion adsorption)是通过离子键使酶与含

10、有离子交换基团的水不溶性载体相结合的固定化方法。 阴离子交换剂： DEAE-纤维素，DEAE-葡萄糖凝胶等 阳离子交换剂： 羧甲基纤维素等 此法固定的酶有葡萄糖异构酶、糖化酶、-淀粉酶、纤维素酶等，在工业上用途较广。 1969年最早用于工业化生产的固定化氨基酰化酶：使用多糖类阴离子交换剂DEAE-葡萄糖凝胶固定化。,吸附法的优点： 操作简单，条件温和，吸附剂可再生反复使用。 吸附法的缺点： 酶和载体的吸附力比较弱，容易在不适宜的pH、高盐浓度、高底物浓度或高温条件下解析脱落，易导致催化活力的丧失和污染反应产物等后果。,（ 2 ）包埋法,包埋法（entrapment）是将酶包埋在高聚物的细微凝胶

11、网格中或高分子半透膜内的固定化方法。 前者又称为凝胶包埋法，酶被包埋成网格型；后者又称为微胶囊包埋法，酶被包埋成微胶囊型。 基本原理：单体和酶溶液混合，再借助引发剂进行聚合反应，将酶固定于载体材料的网格或微囊中。,网格型：包埋在高分子凝胶细微网格中。 将块状聚合形成的凝胶切成小块，或直接包埋在珠状聚合物中，后者可以使固定化酶机械强度提高10倍，并改进酶的脱落的情况。 常用的材料： 聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏树脂等合成高分子物质 淀粉、明胶、胶原、海藻酸和角叉胶等天然高分子物质。,微囊型：包埋在高分子半透膜中。 膜既能形成类似细胞内的环境，又能阻止酶的脱落或直接与微囊外的环境接触； 小分子底物能

12、迅速通过膜与酶作用，产物也能扩散出来。,制备方法： 1 界面沉淀法：利用高聚物在水相和有机相的界面上溶解度极低而形成膜将酶包埋。 2 界面聚合法：将亲水性单体和疏水性单体利用界面聚合的原理包埋酶的方法。 3 纤维包埋法（二级乳化法）：酶溶液先在高聚物有机相中乳化分散，乳化液再在水相中分散形成次级乳化液，当有机高聚物溶液固化后，每个固体球内包含多滴酶液。,包埋法的优点 反应条件温和，不需要与酶的氨基酸残基进行反应，不改变酶的结构； 酶回收率高； 缺点： 包埋时发生化学聚合反应，酶容易失活（微囊型），要要巧妙设计反应条件。 由于高分子网格的扩散阻力，会改变固定化酶的动力学行为，降低酶活力。仅适用于

13、小分子底物和产物的酶。,（ 3 ）交联法,交联法（cross-linking）是使用双功能或多功能试剂使酶分子之间相互交联呈网状结构的固定化方法。 常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、异氰酸衍生物等。 戊二醛和酶蛋白中的游离氨基发生Schiff反应，形成薛夫碱，从而使酶分子之间相互交联形成固定化酶。,交联法的特点 反应条件比较激烈，固定化的酶回收率比较低，但是降低交联剂的浓度和缩短反应的时间有利于固定化酶比活力的提高。 交联剂一般价格昂贵，所得到的固定化酶活力较低，不易成型，一般作为其他固定方法的辅助手段，如与吸附法和包埋法联合使用，起到加固结合的作用。,（4 ）共价键结合法,共价键结合法(co

14、valent binding）是将酶与聚合物载体以共价键结合的固定化方法。 常用方法归纳起来有两类： 1 将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生偶联反应； 2 在载体上连上一个双功能试剂，然后将酶偶联上去。,酶蛋白上可供载体结合的功能基团,（1）酶蛋白N末端的-氨基或赖氨酸残基的-氨基。 （2）酶蛋白C末端的-羧基、天门冬氨酸残基的-羧基以及谷氨酸残基的-羧基。 （3）苯丙氨酸和酪氨酸残基的苯环。 （4）其他：半胱氨酸残基的巯基；丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的羟基；组氨酸残基的咪唑基；色氨酸残基的吲哚基。,参加和载体共价结合的基团必须不是活性中心的基团，也不是维持酶蛋白空间结构必须的基团。,共

15、价结合载体的特点,1 可以在温和条件下与酶蛋白发生偶联反应； 2 具有一定的机械强度和较大的表面积。 常用的载体有： 天然的高分子物质：纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖、淀粉及其他衍生物； 无机物：陶瓷、玻璃等； 人工合成的高聚物：甲基丙烯酸共聚物、顺丁烯二酸酐和乙烯的共聚物、氨基酸共聚物及聚苯乙烯等。,载体活化的主要反应,重氮法 叠氮法 溴化氰法 芳香烃化法,重氮法,重氮法是将酶蛋白与水不溶性载体的重氮基团通过共价键相连接而固定化的方法，是共价键法中使用最多的一种。 常用的载体有多糖类的芳族氨基衍生物、氨基酸的共聚体和聚丙烯酰胺衍生物等。,具有芳香族的水不溶性载体在稀盐酸和亚硝酸钠中进行反应，成为

16、重氮盐化合物，然后再与酶发生偶合反应，得到固定化酶。 酶蛋白中的游离氨基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸中的酚基参与此反应。,叠氮法,即载体活化生成叠氮化合物，再与酶分子上的相应基团偶联成固定化酶。 含有羟基、羧基、羧甲基等基团的载体都可用此法活化。如CMC、CM-sephadex（交联葡聚糖）、聚天冬氨酸、乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物等都可用此法来固定化酶。其中使用最多的是羧甲基纤维素叠氮法。,溴化氰法,即用溴化氰将含有羟基的载体，如纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等，活化生成亚氨基碳酸酯衍生物，然后再与酶分子上的氨基偶联，制成固定化酶。 任何具有连位羟基的高聚物都可用溴化氰法来活化。,烷基化和芳基化法,

17、以卤素为功能团的载体可与酶蛋白分子上的氨基、巯基、酚基等发生烷基化或芳基化反应而使酶固定化。 此法常用的载体有卤乙酰、三嗪基或卤异丁烯基的衍生物。,对于无机载体，可用直接法和涂层法（用活化物的聚合物如白蛋白或葡聚糖涂层）。,共价结合法的优缺点,优点：共价键的键能高，酶和载体之间的结合相当牢固，即使用高浓度底物溶液或盐溶液，也不会使酶分子从载体上脱落下来，具有酶稳定性好、可连续使用较长时间的优点。 缺点：载体活化的难度较大，操作复杂，反应条件较剧烈，制备过程中酶直接参与化学反应，易引起酶蛋白空间构象变化。,二 辅酶和辅基的固定化,辅酶固定化原因,1）辅酶因子中特殊化学基团参与催化反应； 2）辅酶

18、因子流失，且不能再生； 3）辅酶因子价格昂贵； 工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生。,辅酶固定化的方法：,1. 固定化方法与酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亚胺法以及重氮偶联法等共价偶联，或将其进行适当的化学修饰后固定在超滤器中。 2. 辅酶固定化必须解决辅酶在多个酶之间传递的障碍。,需要辅酶的酶反应体系： 1 辅酶与酶均不固定化； 2 辅酶不固定而酶固定； 3 辅酶固定而酶不固定； 4 辅酶和酶分别固定； 5 辅酶和酶共固定； 6 辅酶与酶分子偶联形成辅酶-酶复合物的反应系统,（辅酶分子量小，难以截留）,反应的扩散阻力大,辅酶固定化的形式：,三 固定化细胞的制备,固定化细胞的定义 将

19、细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术。 固定化细胞就是被限制自由移动的细胞，即细胞受到物理化学因素的约束或限制在一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性并具有能被反复或连续使用的活力。, 固定化细胞的特点 有细胞特性，生物催化剂功能，固相催化剂特点。 优点： 无须进行酶的分离纯化 保持酶的原始状态，酶回收率高 比固定化酶稳定性高 细胞内酶辅助因子可再生 细胞本身含多酶体系 抗污染能力强,3 固定化细胞生理学特性,如上图所示： 第一类一般只适用于一种酶催化的反应。 第二类由一种辅酶或少数几种酶催化的反应。 第三类适用与多酶反应，特别是需要辅酶的反应。,4 固定化细胞的制备技术 理想

20、的固定化细胞的制备方法，应该具有如下特点： 1.能够控制固定化细胞的大小和孔隙度。 2. 方法简单、易行，应尽可能少损伤细胞。 3.具有良好的机械稳定性和化学稳定性。 4.单位体积的固定化细胞应该拥有尽可能多的细胞。,载体结合法 是将细胞悬液直接与水不溶性的载体 相结合的固定化方法。 涉及到酶或细胞的化学修饰，可能引起细胞破坏，应尽量在温和的条件下进行反应。 由于在使用中细胞间、细胞和载体之间的键不容易被破坏，所以操作的稳定性高。,包埋法 将细胞定位于凝胶网格内的技术。 实际使用中限制酶活力的因素较多，且只适合于小分子底物。 适合用于固定活细胞。,交联法 用多功能试剂对细胞进行交联的固 定化方

21、法。 没有良好的机械强度，不合适实际使用，细胞浓度较高。 无载体法 靠细胞自身的絮凝作用制备固定化细胞的技术。,选择性热变性法 专用于细胞固定化。是将细胞在适当的温度下处理使细胞膜蛋白变性，但不使酶变性而使酶固定于细胞内的方法。,5 固定化活细胞,将活细胞限制或定位于特定空间位置的方法。,无需进行酶的分离和纯化，减少酶的活力损失，同时大大降低了成本； 保持了酶的原始状态，比固定化酶的稳定性更高，对污染的抵抗力更强； 细胞本身含多酶系统，可催化一系列反应，且不需添加辅助因子； 细胞生长停滞时间短，细胞多，反应快等。,固定化活细胞的优越性,缺点 必须保持菌体的完整，需防止菌体的自溶，否则影响产物的

22、纯度； 必须抑制细胞内蛋白酶对目的酶的分解； 胞内多酶的存在，会形成副产物； 载体、细胞膜或细胞壁会造成底物渗透与扩散的障碍等。,制备方法,固定化完整细胞的方法很多，但是没有一种理想的通用方法；对于特定的应用，必须找到价格低廉、简便的方法，高活力保留和操作稳定性是评价固定化生物催化剂的先决条件。,四、固定化酶的形状与性质 固定化酶的形状 固定化酶的形式多样，依不同用途有颗粒状、纤维状、酶膜和酶管等形状。 其中颗粒占绝大多数，它和纤维状主要用于工业发酵生产，如装成酶柱用于连续生产，或在反应器中进行批式搅拌反应。,固定化酶的性质 酶活力的变化 固定化酶的活力在多数情况下比天然酶的活力低，其原因可能

23、是： 酶活性中心的重要氨基酸残基被载体结合； 高级结构和空间构象的改变； 空间位阻的影响； 内扩散阻力； 半透膜的隔离。 个别情况下，酶经固定化后其活力升高。,酶稳定性的变化 操作稳定性：体内半衰期 贮藏稳定性：低温放置 热稳定性：耐热性提高 对蛋白酶的稳定性：空间位阻 其他：对有机溶剂、pH、酶抑制剂等的稳定性均有提高。,酶学特性的变化 底物特异性：对高分子底物的活性明显下降； 最适pH：最适pH和pH曲线常会发生偏移； 最适温度：多数较游离酶高； 动力学常数：Km均增大，增大幅度视情况而定； 最大反应速度：与游离酶大多数是相同或相近。,五 评价固定化酶生物催化剂的指标,1 固定化酶(细胞）

24、的活力 定义：-固定化酶细胞催化策一特定化学反应的能力，其大小可用在一定条件下它所催化的某一反应的反应的速度来表示。 固定化酶（细胞）的单位可定义为每毫克干重固定化酶（细胞）每分钟转化底物（或生产产物）的量。mol.min-1 分批测定法 连续测定法,2 偶联率及相对活力的测定,固定化酶的活力回收是指固定化后固定化酶（细胞）所显示的活力占被固定的等当量游离酶(细胞）总活力的百分数。,偶联率1时表示反应控制好，固定化酶失活不明显； 偶联率时，扩散限制对酶活力有影响； 偶联率1时有细胞分裂或从载体排除抑制剂等原因。,3 固定化酶（细胞）的半衰期,操作稳定性是影响固定化酶（细胞) 实用的关键因素 半

25、衰期-在连续测定条件下，固定化酶（细胞）的活力下降为最初活力一半所经历时间，以t1/2表示。 半衰期是衡量稳定性的指标,固定化酶（细胞）活力随时间成指数关系，半衰期： KD=-2.303/tlg(E/E0) E/E0 是时间t后酶活力残留的百分数,一 酶反应器,各种反应器的示意图,酶反应器的类型,间歇式搅拌罐反应器 连续流动搅拌罐反应器 填充床反应器 流化床反应器 连续搅拌罐-超滤膜反应器，连续流动搅拌罐反应器/连续搅拌罐 循环式反应器,这类反应器结构简单，造价较低，传质阻力很小，反应能迅速达到稳态，主要应用在饮料和食品工业中。其缺点是操作麻烦，在反复回收过程中固定化酶容易损失，所以工业规模的

26、固定化酶很少采用。常用于游离酶。,间歇式搅拌罐反应器,间歇式搅拌罐反应器,这种反应器在运转过程中，底物以恒定的流速流入反应器，与此同时，反应液则以同样的流速流出反应器。反应桶内装有搅拌器，使反应组分与固定化酶颗粒混合均一，出口处有过滤膜，可使不断补充新鲜底物与反应液流量维持动态平衡。,连续流动搅拌罐反应器,连续流动搅拌罐反应器,优点：反应液混合良好，各部位的成分相同，并与流出液的组成也一致。连续流动搅拌罐反应器的开放结构使得调换固定化酶比较容易，而且有利于控制温度和调节pH，还能够处理胶态或不溶性底物，受底物抑制的固定化酶采用连续流动搅拌罐反应器有较高的转化率。 缺点：由搅拌产生的剪切力较大，

27、易打碎磨损固定化酶颗粒。需改良的连续流动搅拌罐反应器。,填充床反应器,填充床反应器,又称固定床反应器。可填充多向异性半透性中空纤维制成管状，内部填充酶膜、酶片等。 在填充床反应器内，底物在一定方向上以恒定的速度通过固定化酶柱，以近似活塞式流动反应器（Plug Flow Reactor，PFR）运转。,流化床反应器,流化床反应器,流化床反应器种装有较小颗粒的垂直塔式反应器。反应时，底物溶液以足够大的流速，从反应器底部向上通过固定化酶柱床，便能使固定化酶颗粒始终处于流化状态。其混合程度介于连续流动搅拌罐反应器的全混型和填充床的平推流型之间。由于反应器内混合程度高，因此，传热、传质情况良好，可处理粘

28、性大、含有固体颗粒的底物。,连续搅拌罐-超滤膜反应器，连续流动搅拌罐反应器,连续流动搅拌罐反应器,连续流动搅拌罐反应器UF结构是连续流动搅拌罐反应器与超滤装置联用的酶膜反应器。在连续流动搅拌罐反应器出口处设置一个超滤装置，通过超滤装置，酶可以循环使用。该超滤器中的半透性超滤膜只允许小分子产物通过，不允许大分子酶和底物通过。 该反应器适用于颗粒较细的固定化酶、游离酶和细胞以及小分子产物与大分子底物。,循环式反应器,外循环反应器,内循环反应器,循环操作仍能为底物与酶提供足够的接触机会，以达到所需的转化率。这种反应器可用于难溶或者不溶性底物的转化反应。,酶反应器的选择依据,根据固定化酶的形状： 溶液

29、酶：间歇式搅拌罐反应器 颗粒状和片状：连续流动搅拌罐反应器、填充床反应器 膜状和纤维状：填充床反应器 容易变形、易粘结、颗粒细小：流化床反应器 根据底物的物理性质 溶解性和浊液性底物：任何类型 颗粒状和胶状底物：连续流动搅拌罐反应器、流化床反应器、循环式反应器,二 酶固定化对其动力学特性的影响,酶固定后，酶本身的结构必然受到扰动，同时酶固定后，由于扩散限制效应、空间位阻作用以及载体性质等因素必然对酶的性质产生影响。,、 固定化酶的活力,酶活力表现率一般降低(Km ),Tab1 M-constant of free E and immobilized E,、 固定化酶的稳定性,热稳定性普遍提高,

30、保存期t1/2增1倍; 热稳定性比溶液提高10倍以上,(空间结构坚固，加热不易变型),二、影响固定化酶动力学的因素,1、空间效应（包括构象和屏蔽）,酶，三维空间结构；固定化，由于E与载体的相互作用，引起酶活性部位发生扭曲变形，改变活性部三维结构，减弱了结合力，称构象效应。,载体的存在使酶分子不易与酶活性部位接触，对酶活性部位造成空间障碍，使酶活下降，称屏蔽效应（位阻效应）,1、空间效应（包括构象和屏蔽）,图、固定化酶的结构改变和屏蔽效应,2、分配效应,含固定化酶的多种载体示意图,几个概念 构成多相体系； 微环境（固酶附近） 主体溶液 分配效应(SP浓度不同的现象),3、扩散效应,几个概念 酶固

31、定酶浓度不均匀,S均匀S向活性扩散,反应后P向溶液扩散 ； 内扩散（固酶内表面向微孔内酶活性中心） 外扩散(溶液主体向固定化酶表面) 反应和扩散的关系,内扩散效应和外扩散效应?,固定化酶与液相反应物系相接触的反应过程为:,第一步：底物由液相主体扩散到载体的外表面,第二步：底物在载体的外表面进行反应,第三步：产物由外表面扩散到液相主体,传质过程,反应过程,第五节 固定化技术的应用,微主物细胞固定化后,受载体影响，只用于生产各种能够分泌到胞外产物 。 一、利用固定化微生物生产各种产物 （1）酒精、酒类。生产酒精、啤酒、葡萄酒。 （2）氨基酸。谷氨酸、赖氨酸、精氨酸等。 （3）有机酸。苹果酸，柠檬酸

32、葡萄糖酸衣康酸。 （4）酶和辅酶。淀粉酶糖化酶；蛋白酶等。 （5）抗生素。,二、利用固定化微生物细胞(酶)制造生物传感器,生物传感器是由固定化生物细胞或酶与各种能量转换器，密切结合而成的传感装置 通常由感受器；换能器和电子线路三部分组成。 当待测物质通过传感器时固定在感受器上亲和配基与待测生物分子相互作用的瞬间发生能量的转栘。经过换能器，以电或光等物理讯号,方式输出，经过电子系统放大处理显示,就可以测出物质的量.,生物传感器的发展应用,生物传感器的理论研究近几年才取得突破性进展产生一些新的分析检测装置 目前市售有:葡萄糖检测仪，免疫分析检测早孕；乙肝和尿糖试纸等。,三、药物控释载体,新的药物不

33、断问世，但应用于临床却不顺利,其可能原因: （1）很多药物尤其是蛋白类药物，口服很容易被胃酸破坏或沉淀。 （2）单纯注射后瞬时血药浓度升高，但马上被肝脏及血液中的酶系统所清除。 （3）蛋白质类药物容易引起免疫反应。（4）很多药物稳定性差，不耐贮存。,药物的新剂型,药物的新剂型特点-合理给药体系，即是从时间和空间分布上控制药物的释放。 药物的新剂型包括：聚合的修饰、凝胶包埋、微球、脂质体及免疫导向等； 控释体系将药物与聚合物载体偶联或固定于某种聚合物载体上，称为载体药物。,1聚合物修饰 多用于蛋白质类药物；这类药物半衰期短,免疫原性强,可用适当水溶性高分子聚合物加以改善其性能。例如，用甲基壳聚糖

34、对天冬酰胺酶的修饰及聚乙二醇对原核表达重组人血小板生成素分子的修饰等，均可起到降低毒性；延长半衰期的作用,2、凝胶包埋 希望药物能够较长时间维持一个稳定的血药浓度,可采用凝胶包埋法，即用生物相容性好的高分子聚合物与药物混合制正含有药物的凝胶.植入体内特定部位以达到缓释给药的效果,3 微球制剂 用高聚物微球包埋或比学偶联药物可制成微球制剂，它具有靶向性缓冲性及减少抗药 性等特点；微球与靶细咆接触，可以通过胞饮进入胞内发生作用不影响细胞膜通透性.不会产生 产生抗药性，早期使用的微球制剂不被生物降解，多为口服制剂,4脂质体 脂质体是磷脂双分子层在水溶液中,自发形成超微中空小泡，它同微球制剂一样都有靶

35、向性；长效性并且可以通过胞饮作用向胞内释放药物从而避免抗药性.,5导向药物 导间药物具有主动靶向性；将针对肿瘤细胞的单克隆抗体与化疗药物交联，直接作用于肿瘤细胞产生杀伤作用，并且降低全身毒性但是抗体药物复合物与肿瘤细胞结合数目有限，难于有效手伤肿瘤细胞。因而用毒性强烈的毒素取代化疗药物制备免疫毒素，具有更强烈的杀伤效果,免疫毒素还可用于骨髓移植中，供体骨髓中T细胞的选样性杀伤以避免栘植物抗宿主病的发生.,四、酶的结构与功能研究,1阐明酶反应机理 对于葡萄糖生成3磷酸甘油醛反应，中间要经过己糖激酶磷酸葡萄糖异构酶磷酸果糖激酶醛缩酶的作用将这些酶固定后装柱让葡萄蹭依次过柱果然可得3磷酸甘油醛,这说

36、明了 每一个酶的作用证明了该酶反应的反应机制。,2、提示酶原激活机理,有时酶原激活并不涉及蛋白水解；酪氨酸酶原固定化后不需肽链水解就可活化至天然酶的20%-30%活力。荧光技术证明活化酶原在结构上与固定化酪氨酸酶类似，证明了结构重排在酶原激活中的重要性。,3、酶亚基性质的研究,比较亚基与全酶的催化性质,对了解酶结构功能有重要意义。 比较亚基与全酶的催化性质?村了解酶结陶功能有重要意义；正常条件下无法比较因为亚基不易分离固定化可解决这一问题，由于载体的空间限制，脱落的亚基不能再与载体上的亚基重新结合，醛缩酶有4个亚基，控制条件使酶分子只有一个亚基通过价键与活化的琼脂糖凝胶结合当用浓度为8mol/

37、L 的尿素使蛋白变性后,未被固定的亚基被透析除去,只有固定化的亚基保留,这样就可以对单亚基进行研究。,4研究蛋白质核酸分子结构 对于研究蛋白质的三级结构来说X射线分析是有力的手段。,五、其他方面的应用,固定化细胞在工业的各个方面都显示出广阔的应用前景，在食品；制药等轻工,化工领域域的一些用途不胜枚举。 在化学分析方面，进行酶法分析，主要用于化学分析扣临床诊断。固定化酶在临床治疗方面有应用人体某种酶缺失或异常将导致某种疾病。给人体相应酶的补充可以冶疗疾病或缓解症状；这称为”酶疗法”。 固定化酶也可以用于环境中微量有毒物质的含量测定进行环境监测。,第六节 共固定化技术,共固定化是将酶,细胞器和细胞

38、同时固定同一载体中,形成共固定化细胞系统. 这种系统稳定，可使几种不同功能的酶细胞器和微生物细胞协同作用. 共固定化技术是在混合发酵和固定化技术的基础上发展起来叫-种新技木.综合了混合发酵和 固定化技术的优点，与用遗传工工程构建的细胞相比更有希望在短时间内生产.,共固定化的形式：有细胞与细胞，细胞与酶，细胞器与酶 用交联剂(戊二醛和单宁)；将死或活的微生物完整细胞，连同根据需要另外补加的酶-起世行固定化处理制得固定化单酶或多酶生物催化剂。 如将米曲霉产生的乳糖酶与酿酒酵母一起加以固定化，用于连续发酵乳酸产生酒精；,另一种酶与细胞固定化的方法是利用细胞作力辅酶的再生系统，以提供酶的作用例如,利用大肠杆菌的呼吸电子链再作NAD氧化型可在共固定化细菌和乙醇脱氧酶系统连续地将乙醇转化力乙醛 共固定化技术开创了一种新的可能性，但是,进行固定化时，也会出现-些问题。共固定化系统中各种成分比例最佳条件的确定问题,固定化细胞法生产6-氨基青霉烷酸 1.技术路线 E.Coli 斜面 细胞 固定化细胞 青霉素G 转化液 滤液 6-APA 粗品,培养,固定,转化,过滤,抽提,青霉素酰化酶转化流程图,