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1、分子生物学技术,目前缺乏标准化的方法 WHite运用实时定量PCR方法对203例血液病患者全血标本进行曲霉检测，结果发现在确诊/高度拟诊的患者中，阳性率为92.3%;与G实验和GM实验及高分辨CT有良好的一致性,分子生物学技术,台湾学者运用液相芯片技术，基于所有真菌的高度保守序列如18S、28S和高度可变的内部转录间隔区(ITS) ，前者用于筛选真菌感染，后者用于菌种的确定，同时对64种真菌进行鉴定，敏感性和特异性均大于97% ， 1天内完成 J Clin Mic 2005,43:3760-3768,分子生物学技术,存在问题 1.外来的污染 2.不能有效地区分定植和感染 3.不能指导临床何时开
2、始及停止抗真菌治疗,真菌的病理检查,真菌的病理检查,PAS阳性的念珠菌菌丝,真菌的病理检查,HE染色 真菌菌丝,真菌的病理检查,肺隐球菌PAS阳性,组织病理学检查,侵袭性曲霉感染： 侵犯血管，引起病变部位的栓塞、出血及坏死 非特异性炎症、化脓性改变或肉芽肿形成,组织病理学检查,组织内曲霉： 镜下菌丝常呈45分枝、有隔、透明且粗细均匀,直径约36m ,有菌丝反复分枝现象，排列成放松射状或珊瑚状。 有些慢性损害中菌丝常呈不规则扭曲状 特征性的菌丝：诊断曲霉感染最可靠的依据,组织病理学检查,HE染色呈蓝色略带红色，PAS染色呈红色 嗜银染色呈黑色 菌丝横切面与孢子的鉴别： 孢子往往成群分布，直径小于
3、菌丝,曲菌菌丝,甲胺银染色:曲霉球 (烟曲霉),毛霉菌的实验室诊断,与外界相通部位分离出毛霉菌不一定有意义 无菌部位标本阳性培养有意义 支气管肺泡灌洗液直接镜检常用 分子生物学技术,真菌药敏判断标准解读,抗真菌药物敏感试验,过去试验方法及存在问题 液基稀释法(broth dilution) 微量液基稀释法(broth microdilution) 琼脂混合法（agar incorporation） （即过去广泛使用的药基法） 琼脂扩散法(agar diffusion) 问题：影响因素过多，结果重复性差,美国国家临床试验室标准委员会（NCCLS）方案,1982年起美国国家临床试验室标准化委员会（
4、NCCLS） 组织专家进行了一系列试验。 1992年：NCCLSM27P文件对念珠菌和隐球菌液基 稀释法提出药敏测试标准化方法，属建议性质。 1995年：NCCLSM27T文件，属试验性质。 1997年：NCCLSM27A文件，属确认性质，加入了微量稀释法 1998年： NCCLSM38P文件丝状菌微量液基稀释法提案,NCCLS M27-A方案,酵母菌的液基稀释法抗真菌药敏试验参考方案 （Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts） 已批准的标准方法，包括微量稀释法（microd
5、ilution) 主要适用于：念珠菌和新生隐球菌 2002年出版了M27-A2方案,NCCLS M38-P 方案,产孢丝状真菌的液基稀释法抗真菌药敏试验参考方案（Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Conidia-Forming Filamentous Fungi） 提出的标准方法，微量稀释法 主要适用于：如曲霉、镰刀菌、米根霉、波氏假阿利什霉、申克孢子丝菌（菌丝相）等。 我们已根据此法，进行了皮肤癣菌的药敏试验 2003年推出M38-A方案,M44-A方案,2004年CLSI出版了
6、使用美蓝MH琼脂平板，纸片为Rosco公司生产的各种抗真菌药物纸片,M27-A2药敏判读,对于酵母菌（念珠菌、新型隐球菌，不适用于其他真菌）： 氟康唑:35度、40-50h(隐球菌70-74h) ，与生长对照菌比较80%受抑制为判定点 如MIC8g/ml报告敏感， 64g/ml报告耐药， 16-32g/ml则是剂量依赖敏感 光滑、克柔不适用,M27-A2药敏判读,伊曲康唑的MIC定义同氟康唑 如MIC 0.125g/ml,提示受试黏膜感染的念珠菌敏感，如1g/ml报告耐药 0.250.5g/ml提示为剂量依赖敏感 目前无黏膜外的侵袭性念珠菌感染的折点判定标准,M27-A2药敏方案的临床意义1）
7、,耐药菌株的鉴定与监测： 念珠菌对FCZ的耐药问题日益严重 AIDS患者经FCZ治疗后出现较多白念珠菌的耐药株 MIC值升高，随FCZ剂量增大 分子生物学方法可证实同一菌株产生耐药,M27-A2药敏方案的临床意义(2）,拓展新的药敏试验方法： 微量稀释法、E-test法等均以M27-A为基 础，从不同角度为临床提供更简捷，易推 广的药敏试验技术,M27-A2药敏方案的临床意义(3),应用于抗真菌新药的研究 评估新的抗真菌药物的抗真菌效果 扩展到丝状真菌药敏试验 以此为基础，对曲霉、镰刀霉、根霉、波氏霉样真菌、孢子丝菌已形成M38-A方案（2003年），但皮肤癣菌还有待纳入,体外抗真菌药敏试验与
8、体内疗效 的一致性,NCCLS M27-A 90-60原则MIC值与临床疗效 药敏试验敏感菌株：90%对治疗有效 药敏试验耐药菌株：60%对治疗有效,NCCLS对药敏结果的解释,MIC不是一个物理或化学的指标 在实际临床治疗中，宿主因素往往比药敏试验结果更为重要 体外药敏结果敏感并不预示治疗成功 体外的耐药常预示治疗失败,产孢丝状真菌抗真菌药敏试验NCCLS方案 M38A简介,M38-A，微量肉汤稀释法适用于曲霉属、镰刀霉属、结合菌、赛多孢属、孢子丝菌等丝状真菌。 该方案仅对试验条件和判读标准进行 了统一，并没有给出M IC的判定折点,药敏判读,在终点判读时，将伊曲康唑由原方案的 生长抑制改为
9、生长抑制，即读数为 时的最低药物浓度 新型三唑类药物的MIC值定义也是如此 原因是伊曲康唑和其他新型三唑类药物，与氟 康唑和酮康唑不同，判读终点时不存在拖尾 质控菌株增加了： -黄曲霉ATCC204304 -烟曲霉ATCC204305,药敏判读,丝状真菌对两性霉素B 的M IC 值一般在0.15-2 mg/L,但是部分真菌(如:土曲霉、枝顶孢霉、尖端赛多孢霉、足分支霉) MIC 可能超2mg/L。 一般认为,MIC 2 mg/L,两性霉素B治疗有可能失败。 丝状真菌通常对5-FC和氟康唑不敏感,MIC往往大于64 mg/L。 丝状真菌常侵袭组织, MIC和药物组织浓度的关系对于临床治疗指导意义
10、更大,药敏判读,因此,目前对于丝状真菌的体外诊断,更有 意义的不是药敏试验,而是仔细地将致病 真菌鉴定到种 举例说明:如果分离到土曲霉、尖端赛多 孢霉、足分支霉,就知道这些真菌通常对 两性霉素B耐药,纸片扩散法,将含有一定量抗真菌药物的纸片置于接种有一定量真菌的平皿中，在一定的温度 经过一定时间孵育后，通过测量抑菌圈的 大小来判断受试真菌对于该药物的敏感性 该方法简单直观，已有商品化 缺点：不能精确量化,酵母菌纸片扩散法敏感试验 (CLSI)M44-P,M44-P 酵母菌纸片扩散法敏感试验方案，制定了氟康唑(fluconazole)和沃尔康唑(voriconazole)质控株的参考范围及氟康唑
11、的抑菌环解释标准 研究证实氟康唑对酵母菌药敏试验有较好的重复性，可准确地检测酵母菌对氟康唑的敏感性,ROSCO 酵母菌纸片扩散法,改良Shadomy琼脂或RPMI 1640琼脂加热溶解后倒入9cm平皿（20ml） 新鲜具活力的纯化的酵母菌落以生理盐水制成5*105FU/ml(配制成0.5麦氏浊度后再以生理盐水对倍稀释) 接种：平皿先置35干燥2025分钟，倾注0.5ml菌液于平皿表面，均匀涂布，用移液管吸除多余的菌液 35干燥15分钟后贴上药物纸片 培养：35 1824小时，如未见明显生长，再放24小时。隐球菌：30 4248小时,结果判读,氟康唑、酮康唑、氟胞嘧啶： 20mm 敏感 12-1
12、9mm 中介11 耐药 两性霉素B 、伊曲康唑、制霉菌素: 15mm 敏感 10-14mm 中介 无抑菌圈 耐药,E-test法,是一种商品化的抗真菌药物敏感性方法 采用被不同量的抗真菌药物包被的特殊试 剂条，受试药物包括氟康唑、伊曲康唑和 两性霉素B等 该方法操作简单、直观，与NCCLS法有较好 的一致性 缺点：结果判定需有一定经验，价格昂贵,E-test法,基本原理：用特殊技术将抗菌药物在一 试剂条上形成一个定量连续梯度,其培养 基、菌接种浓度、培养温度及时间等条 件基本按照M-27方案所推荐的条件 E-test法已被用于某些霉菌如曲霉属、镰 刀菌属和根霉属的药敏检测,E-test法,E-
13、test抗真菌药敏试条： 二性霉素B(AP) 5氟胞嘧啶(5-FC) 酮康唑(KE) 伊曲康唑(IT) 氟康唑(FL) 起始浓度:32mg/L终末浓 度:0.002mg/L,丝状真菌的E-test药敏试验,流式细胞检测法,原理:检测不同药物浓度作用下各药物浓度管的荧光强度，根据荧光强度的梯度变化趋势，判定药物抗菌活性的一种方法 对流动液体中排列成单列的细胞和颗粒进行检测，分析其光散射和荧光，从体积、内部结构等物理及化学特征判断真菌活力和功能状态。,深部真菌感染存在的问题总结,真菌广泛定殖于人体的各个部位及存在于周围环境中，在免疫缺陷者引起感染。 临床医师诊断困难：没有典型症状和体征 缺乏良好的检查方法，或检查的价格昂贵 临床医师送检的标本不注重真菌的监测 送检的标本不合乎真菌检验的要求 实验室的检测阳性率不高，如血培养（30-50%） 实验室的结果在临床上难以解释：污染？定植？致病？,曲霉菌的生长速度非常快， 更迫切需要早期、及时的诊断治疗,1-2 mm/小时,原来照片位置,