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1、低温/高盐双重胁迫及对其抗性效应初探,制 作 人：夏云剑 年 级： 02级 专 业：生物科学 指导老师：郝再彬，苍晶，史芝文教授,前 言,随着全球环境问题的日益突出，人类赖以生存的作物生产和粮食供应直接受到威胁，因而研究植物的逆境适应机理对指导作物栽培以及培育抗逆、高产、优质作物新品种具有重要的理论意义1。近年来，关于各种逆境因子（高温、干旱、冷害、冻害、盐碱等）影响和破坏植物正常代谢的表现和作用机制已有了大量较为深入的研究，但是对于双重或者多重胁迫影响植物生长的报道却很少。然而事实上植物在生长发育过程中往往同时受多种逆境的作用，如干旱与低温，低温与盐碱，水涝、盐碱与机械损伤（刮风）等。因而探
2、索双重胁迫对植物生长的影响以及双重胁迫与各个单一的胁迫间的关系，具有更大的理论意义和现实意义。 近年来对Ca2+的研究表明以Ca2+为核心的钙信使系统可能在植物对逆境的感受和适应中起中心作用，从而调节植物对逆境胁迫的一系列反应过程2。但是目前多数研究只针对Ca2+提高植物对某种单一胁迫抗性的影响，而外源Ca2+处理对植物多重抗逆性影响的研究还未见报道。 本实验分别采用水浸种和CaCl2浸种，研究了低温/高盐双重胁迫下甜玉米幼苗的各项生理指标的变化，并与单一低温、高盐胁迫相比较，初步探讨双重胁迫对甜玉米幼苗生长的影响，以及与各单一胁迫间的关系。同时研究了外源Ca2+处理对甜玉米抗低温、高盐和低温
3、/高盐双重胁迫能力的影响，试图为植物对多重胁迫间的交叉适应机制以及钙信使系统与植物抗逆性的关系的研究提供一些理论参考，并为“广谱”抗逆作物品种的选育以及甜玉米的推广种植提供理论依据。,1 材料与方法,1.1 实验材料： “甜研3号”玉米，由东北农业大学农学院育种实验室提供。 1.2 幼苗的培养及胁迫处理； 1.3 测定项目及方法。,幼苗的培养及胁迫处理：,挑选籽粒饱满的玉米种子，用75%的乙醇溶液浸泡10S，再用5%的Ca（ClO）2溶液消毒10min，分成两组，分别用蒸馏水和0.5%的CaCl2溶液在黑暗条件下浸种14hr。25恒温培养箱中催芽3d，转入光周期14小时的25恒温培养箱中用1/
4、2完全营养液培养。3d后去胚乳，换用完全营养液。从浸种起第14d，挑选长势较为一致的幼苗，平均分成8组，作如下处理：,表1 甜玉米幼苗经以下不同胁迫处理 Table1 Sweet Zea mays L seedlings under different stress treatments,测定项目及方法,叶绿素含量测定：722型分光光度计丙酮法3； 根系活力的测定：TTC法3； 外渗电导率测定： DDS-307电导仪法3； 脯胺酸含量测定：磺基水杨酸法3。,2 结果分析,2.1 CaCl2浸种对单一和双重胁迫下甜玉米幼苗叶绿素含量的影响： 2.2 CaCl2浸种对单一和双重胁迫下甜玉米幼苗脯氨
5、酸含量的影响： 2.3 CaCl2浸种对单一和双重胁迫下甜玉米幼苗相对外渗电导率的影响： 2.4 CaCl2浸种对单一和双重胁迫下甜玉米幼苗根系活力的影响：,表2 CaCl2浸种对甜玉米幼苗抗低温/高盐双重胁迫的影响 Effects of different stress treatments on Zea mays L seedlings,CaCl2浸种对单一和双重胁迫下甜玉米幼苗叶绿素含量的影响,由表2中可以看出，第3、5、7组三种胁迫处理均使甜玉米幼苗叶绿素含量降低，降低状况为735，相对于第1组（CK1）分别降低了67.93%、36.48%和26.32%。而第4、6、8组相对于第2组分
6、别降低了22.35%、16.35%和58.19%，表明双重胁迫对叶绿素含量的影响要超过单一胁迫的加和，两种胁迫间存在着相互促进的作用。 而经过CaCl2浸种的各组（第2、4、6、8组）的叶绿素含量均比对应的水浸组（第1、3、5、7组）要高（见图1），分别高出约1.04%、23.51%、14.71%和31.74%，表明CaCl2浸种能够明显提高甜玉米幼苗抵抗单一和双重胁迫的能力，且在一定范围内，胁迫强度越高，这种作用似乎越明显。,CaCl2浸种对单一和双重胁迫下甜玉米幼苗脯氨酸含量的影响,植物在逆境条件下积累脯氨酸是一种较普遍的现象,脯氨酸能调节细胞渗透压，保护酶和膜的结构,其积累也是细胞结构和
7、功能受损伤的表现4。 由表2可以看出，单一和双重胁迫均使甜玉米幼苗叶片中的脯氨酸含量增加。增加状况水浸种组为753，相对于第1组(CK1)分别增加了326.99%、221.65%和17.92%；CaCl2浸种组为864，相对于第2组(CK2)分别增加了554.36%、405.48%和48.92%。这表明双重胁迫处理的甜玉米幼苗细胞结构和功能受损伤的程度要比单重胁迫处理的更大，也超过了单一胁迫的加和，说明双重胁迫间很可能存在着相互促进的关系。 从图2可以看出，除第2组外，CaCl2浸种组的脯氨酸含量都比对应的水处理组要高，这表明CaCl2浸种组的植株受胁迫损害的程度反而更大，原因之一可能与CaC
8、l2浸种时Cl-的毒害作用有关，有待进一步细加研究。,CaCl2浸种对单一和双重胁迫下甜玉米幼苗相对外渗电导率的影响,由表2可看出，单一和双重胁迫下甜玉米幼苗的相对外渗电导率均升高，其中水浸种组升高状况为573，相对于CK1分别升高了344.90%、330.99%和49.01%；CaCl2浸种组升高状况为864，相对于CK2分别升高了301.67%、205.93%和28.80%。 外渗电导率的升高表明细胞内电解质外渗和细胞膜相对透性的增加。韩永华等报道，高温/渗透双重胁迫处理比单重处理的相对外渗电导率升高更多5 ，这与本实验CaCl2浸种组的结果相一致。而水浸种组的第7组反而略低于第5组，除了
9、实验可能的误差原因外，我们推测两种胁迫间可能存在着相互拮抗的关系。 比较水浸种组和CaCl2浸种组（图3），我们发现后者的相对电导率总体上大于前者，特别是双重胁迫处理组表现的最明显，表明CaCl2浸种组在受胁迫时细胞膜的透性变化反而更大，对逆境胁迫的抵抗能力有所降低。其原因可能也与Cl-的毒害作用有关。,CaCl2浸种对单一和双重胁迫下甜玉米幼苗根系活力的影响,根系活力可以反映根系生长发育的好坏和吸收能力的强弱。由表2可得，水浸种组和CaCl2浸种组在受胁迫时根系的活力均急剧下降。其中，前者的下降状况为753，相对于CK1分别减少了56.25%、50.00%和1.01%，其中第5、7两组下降达
10、50%以上，受胁迫伤害严重，当解除胁迫时幼苗已无法恢复生长；后者下降状况为864，相对于CK2分别减少了96.55%、51.72%和14.59%，第8组根系基本上已失活。 而从图4可以看出，CaCl2浸种组的根系活力总体上高于水浸种组，且随着胁迫强度的增加而逐渐减少差距，最后第8组的根系活力反而远小于第7组。表明CaCl2浸种能够在一定的胁迫强度内提高植物的抗逆性，但这种提高作用是有限的，当逆境胁迫超过一定的极限强度时，CaCl2浸种不但无法借助Ca2+提高植物的抗逆性，而且还会因为Cl-的毒害作用而加大胁迫强度。,3 讨论：,3.1 双重胁迫与各单一胁迫间的关系； 3.2 CaCl2浸种提高
11、植物抗逆性的机理,关于双重胁迫与各单一胁迫间关系的猜想 由于多重胁迫对植物生长的影响方面的参考文献报道较少，我们这儿暂且用“猜想”一词。先看一些近似的研究： 宰学明等报道，大豆种子萌发前经低温预处理能有效提高种子的萌发活力，有利于种子的萌发和幼苗的生长6 ，表明逆境锻炼在一定程度上对植物的生长是有利的。 龚明等研究发现，热激（非致死性高温胁迫）处理能够提高植物抗盐碱胁迫的能力。并进一步指出，植物对不同逆境胁迫间存在着交叉适应的机制，即当植物经受某种胁迫后，不仅对这种胁迫的抗性提高，而且对其他胁迫的抵抗也增强7 。这一研究虽未阐明交叉适应的机制，但从侧面证明多重胁迫间可能有着相互抑制的关系，即多
12、重胁迫效果应小于各单一胁迫效果的加和，甚至小于各单一胁迫。 而韩永华等研究了高温/渗透双重胁迫对大豆某些生理反应的影响，结果表明双重胁迫在致使叶片含水量降低、电解质外渗和膜脂过氧化损伤方面的效应是单一胁迫的累加，并推测多重胁迫对作物的伤害应比单一胁迫要大得多5 。这一结论恰好与前两者相反。,从我们的实验结果中可看出，虽然双重胁迫效应总体上比单一胁迫更明显，但与各单一胁迫的累加效应间的关系并不确定，因此也难以确定上述结论哪个正确。然而多重胁迫效应是各单一胁迫的累加应该是事实，但这一累加不能理解为简单的加和，而应该类似于数学上的矢量运算和物理上的波的叠加原理。 我们可以联系影响酶的两大主要因素温度
13、和pH值。它们与酶的活性分别满足如下图象关系：,这一问题有待研究，我们暂且不讨论.,反应速率,温度/pH值,但是，当温度和pH值同时作用时，图象又是什么样的呢？,由酶的活性我们回到胁迫效应。一般情况下，胁迫强度越大，植物受伤害的程度越大，则体内酶活性越低，而且胁迫处理还要考虑时间长短的问题，那么胁迫强度对植物生长的影响可以用右图关系表示：,t,t,t,从以上的讨论我们可以猜想，这种累加效应可能与机械振动的叠加效应相似，应同时考虑振源、频率和振幅。 在植物体中，对各种逆境胁迫作出反应的细胞功能部位，或者说是控制各种抗逆蛋白表达的基因序列，可看作是振源；植物对各种胁迫的反应速度可看作是振动频率；而
14、植物对逆境的反应强度可以看作是振幅。由这三个基本参数是否可以建立一个计算多重胁迫叠加效果的数学关系式呢？ 或许我们可以采用不同的植物，进行不同的处理方法、处理强度、处理时间以及处理顺序，根据得出的数据来研究多重胁迫与单一胁迫间的关系。,同样我们会问:当低温和高盐两种胁迫同时作用时，图象又是什么样的呢？,t,如果条件允许，我们希望在这一方面作进一步深入的研究。,CaCl2浸种提高植物抗逆性的机理,Ca2+作为植物生长的必需营养元素之一，不仅具有稳定膜结构和某些酶分子结构的作用，而且还作为第二信使在植物体对外界信号的感受、传递和反应过程中起着中心环节的作用。 龚明等研究指出，通常细胞质基质中的Ca
15、2+要比细胞外和细胞器中低，约相差103104数量级，所以细胞外Ca2+的进入和细胞器中Ca2+的释放均能引起细胞质中Ca2+较大的升高。当达到阈值时，Ca2+ 和CaM形成Ca-CaM复合物。此复合物作用于靶酶或引发蛋白质磷酸化等，激活某些酶类，最终启动各种生理生化反应机制2 。其过程可由右图表示：,环境胁迫诱导基因的转录表达示意图,用CaCl2浸种时，Ca2+进入细胞间隙，大大提高了玉米种子细胞外的Ca2+含量，此时种子代谢活力弱，细胞处于“钝化”状态，外界高浓度的Ca2+也难以进入细胞内，仅与膜相互作用，提高膜的稳定性，为逆境胁迫下抵抗膜的伤害做准备。 当玉米种子萌发后，因活细胞内外巨大
16、的电化学梯度，Ca2+被动扩散进入细胞，同时利用代谢加强后提供的能量通过主动运输进入。因此CaCl2浸种通过增加外源Ca2+来提高细胞内Ca2+水平，使之更接近阈值。当低温、盐碱等胁迫信号被感知时，引发整个Ca-CaM相偶联的生理生化机制，使得细胞及早启动逆境适应机制，尽量避免或减轻伤害。 水浸种处理的幼苗，因为Ca2+水平升高缓慢而使抗逆机制启动延迟，或者因胁迫强度过大使膜结合Ca2+大量脱离，以及细胞内游离Ca2+积累过多直接造成膜结构损伤和细胞内Ca2+毒害，从而引起细胞内生理生化反应紊乱，致使毒害发生2。,CaCl2浸种提高植物的抗逆性的原因,需要指出的是，CaCl2浸种对提高细胞内C
17、a2+水平进而提高植物的抗逆性的作用是有限的。我们认为当植物所受胁迫强度过大，特别是在多重胁迫同时作用，超过植物的致死胁迫强度时，外源Ca2+处理不一定能够起到保护的作用，甚至还可能会加重对植物的伤害。 要从根本上解决植物抗逆性问题，可以通过植物基因工程技术培育耐盐植物新品种，这是当前国际上的热门研究课题之一。 国内有相关报道，如东北林业大学盐碱地生物资源环境研究中心在国内首次提取植物耐盐碱基因，转入该基因后的植物具有较强的耐盐碱能力，有望在碳酸钠或碳酸氢钠盐碱地上长出蔬菜瓜果。 山东师范大学的赵彦修教授和张慧教授从盐生植物碱蓬中成功地克隆出一种耐盐关键基因，把该基因转移到植物拟南芥中，在1/
18、2海水浇灌条件下，拟南芥能完成生活史；在盆栽条件下，15天不浇水，复水后仍能恢复生长并结实，而对照株均死亡。据张慧介绍，在所有已知公开发表的资料中，中国科学家培育的转基因植物耐盐性是最强的。 我校在这方面也有深入的研究。,关于植物抵抗逆境胁迫的机制，我们还有一个问题，即： 植物对逆境胁迫的适应是通过细胞质中的一系列生理生化反应就可以实现还是必须得通过基因水平的调节来实现？ 从基因决定性状的角度，我们相信植物对逆境的适应肯定与基因有关。而且通过外源基因导入获得抗逆植物品种的事实，也证明了抗逆基因在植物抵抗逆境胁迫中的重要作用。但是，植物通过基因水平对逆境胁迫作出调节显然在时间上不算优化，不如直接
19、通过细胞质中的反应调节更为快速有效。因此我们有理由猜测植物细胞是否存在离一套逆境反应机制，即： 基因为植物体提供了一套感知逆境胁迫信号并作出反应的系统，当逆境信号被植物感知时，这套系统可以不经过基因直接完成调节任务。 我们可以打个比方，基因好比是一位能干的总经理，上任后在公司中设立了一个特殊的职能部门，当遇到突发事件时，这一部门可以不通过经理直接解决问题，显然这比先请示经理再行解决更有效。当然这一部门到底是由经理设立的，所以最终要对经理负责。 以上论述，大多尚且停留在猜想阶段，有待更多的实验研究来论证。,致 谢,本实验的设计、操作和课件制作得到了史芝文教授、郝再彬教授、苍晶教授的悉心指导；也得
20、益于生物学021班全体同学的团结协作和热情支持在此表示感谢！,参 考 文 献,1武维华植物生理学，北京：科学出版社，2003 2郭丽红等氯化钙浸种对玉米幼苗抗逆性的影响及谷胱甘肽还原酶的关系，云南植物研究，2004,26(1):111-117 3张达植物生理学实验指导，东北农业大学立项教材，2004 4王艳青等植物抗逆中的渗透调节物质及其转基因进展，北京林业大学学报，2001，23(4):66-70 5韩永华等高温渗透双重胁迫对大豆某些生理反应具有累加效应的初报，大豆科学，2001,20(1):41-44 6宰学明等低温预处理对大豆萌芽活力及其活性氧代谢的影响，大豆科学，2001,20(3):163-166 7龚明等钙对玉米幼苗热激诱导抗盐性的影响，植物生理学通讯，2004，40(1):19-21,敬 请 各位老师、同学多多提供宝贵意见!,