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1、利用基因工程技术生产重组蛋白,从基因到蛋白的复制、转录和翻译过程,功能蛋白,组装,什么是基因工程,基因工程(Genetic Engineering)原称遗传工程。是指在分子水平上将一种或多种生物体(供体)的DNA片断（目的基因）与载体DNA分子（如质粒、病毒等）在体外进行拼接重组,产生新的自然界从未有过的重组DNA分子，然后转入另一种生物体(受体)内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状的技术。基因工程有时也称为重组DNA技术(DNA Recombination)或分子克隆技术(Molecular Cloning)。,什么是重组蛋白,重组蛋白是指将一种或多种生物体（供体）的基因导入另一种生物
2、体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出的蛋白质产物。,应用基因工程技术构建重组细胞并通过重组细胞培养，令其超量合成其它生物体内含量极微但却具有极高经济价值重组蛋白是现代生物技术中最活跃的研究方向之一，广泛应用于生产药用蛋白质及代谢工程等领域。 已经投放市场并正在研制开发的重组蛋白药物几乎触及到医药的各个领域，包括各种抗病毒剂、抗癌因子、抗AIDS药物、新型抗生素、重组疫苗、重组生长激素、重组干扰素、重组抗体、免疫辅助剂、抗衰老保健品、心脑血管防护急救药、生长因子以及诊断试剂等。,重组蛋白的生产包括 上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是外源基因重组、克隆和表达载体以及基因工程菌（
3、细胞）的设计与构建；而下游技术则涉及到含有重组外源基因的生物细胞（基因工程菌或细胞）的大规模培养以及外源基因表达的重组蛋白的分离纯化过程。,重组蛋白生产 基本流程图,重组蛋白的整个过程由工程菌(细胞)的设计构建（上游技术）和基因产物（重组蛋白）的生产（下游技术）两大部分组成，前者的单元操作过程如下: (1) 从供体细胞中分离出基因组DNA，用限制性核酸内切酶分别将外源DNA(包括外源基因或目的基因)和载体分子切开(简称切); (2) 用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段接到载体分子上，形成DNA重组分子(简称接); (3) 借助于细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞中(简称转); (4
4、) 短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中(简称增); (5) 筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞(简称检)。 由此可见，基因工程的上游操作过程可简化为:切、接、转、增、检。,The DNA containing the gene must be isolated away from its genomic context That should be simple but there are big problems,Gene of interest,Cloning can supply large quantities of r
5、ecombinant DNA,Single bacterium transformed with single copy of plasmid which is subsequently replicated,Growth to a colony,Provides several mg of recombinant DNA,Provides several mg of recombinant DNA,Inoculate into liquid broth,重组蛋白表达的典型穿梭载体。 MCS = 多克隆位点； Op = 细菌复制起始位点； Mp = 细菌中的选择性基因； ME = 真核生物中的
6、选择性基因； OE = 真核复制起始位点； PE = 真核启动子； TE = 真核中止子； hG = 表达的外源基因。,重组蛋白的表达系统,所谓重组蛋白的表达系统，是指生产重组蛋白的基因工程宿主菌或宿主细胞。 目前常用的表达系统宿主要有原核的细菌（主要是大肠杆菌，E. Coli.）和真核的酵母菌、昆虫细胞、动物细胞系以及近年发展起来的盘基网柄菌系统。,1、原核生物表达系统细菌 (E. coli.),2、真核生物表达系统酵母菌(Yeast),3、动物细胞,4、昆虫细胞,4、新型真核表达系统盘基网柄菌,盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)属于真菌界的粘菌亚界的聚粘霉纲(A
7、crasiomzcetes)。1869年真菌学家Oskar Brefeld首次描述了盘基网柄菌。盘基网柄菌属D. discoideum由Raper 1935年发现。在自然界中D. discoideum 通过吞噬土壤表面的细菌摄取营养和繁殖。,盘基网柄菌的生命周期,生长阶段 发育阶段 细胞聚集 细胞分化 移动 达到顶点 植物体,生长阶段 (growth phase),吞噬细胞 胞饮无菌培养基 (AX2, AX3 和 AX4) 丝足 伪足,吞噬细胞 (Phagocytosis）,细胞聚集 (Aggregation),细胞分化 (Cell differentiation),移动阶段 (Migrati
8、on phase),假原质团(Pseudoplasmodium) Prestalk cells (15 %) Prespores cells (75%) 固体表面,顶点 （Culmination）,植物体形成,不同表达系统的比较,重组基因工程菌的高密度培养,培养基组成的优化 流加 固定化 罐流床 微过滤,下 游,策 略,培养基组成的优化,碳源种类的选择,下游：培养基组成的优化,基因工程菌培养技术,流加培养,2L发酵罐中流加培养盘基网柄菌生产hFasL,基因工程菌的固定化培养,将基因工程菌固定在多孔载体上，可提高菌体密度，实现连续发酵，为利用其生产异源蛋白提供了有效途径。 多孔载体：多孔陶瓷、浮
9、石、片状硅胶泡沫和柱状硅胶泡沫等。,固定化培养基因工程菌细胞,载体表面和内部的细胞固定化电镜扫描照片,多孔陶瓷,浮石,生物微胶囊固定化,通过一层半透膜围成的微囊将细胞包埋，使目的蛋白细胞留在微囊中，而培养基营养成分和细胞分泌的小分子物质可以自由出入。,羧甲基纤维素钠海藻酸钙 （CMCALG）体系,恒流泵,针头,磁力搅拌器,SA溶液,CMC和CaCl2混和的菌悬液,罐流床反应器连续培养固定化细胞,利用微过滤实现工程菌高密度培养,采用新型陶瓷等微过滤模块,使之既能截流细胞,又能分离限制细胞密度的自分泌因子等抑制物,从而提高细胞密度及目标蛋白的产量,重组蛋白的分离纯化（下游技术） 生化分离工作的一般
10、过程,动、植物组织、体液等 胞外产物 提取 发酵液 预处理 c分离 c破碎 碎片分离 初步纯化 精制 制成品 培养液 加 热 沉 淀 匀 化 离 心 沉 淀 分子筛 无菌过滤 酶反应 调 pH 离 心 超 声 萃 取 吸 附 离 子 超 滤 絮 凝 过 滤 胞 溶 过 滤 萃 取 亲 和 冻 干 错流过滤 研 磨 错流过滤 超 滤 吸 附 喷 干 憎 水 结 晶 电 泳,重组蛋白的分离纯化（下游技术）,预处理及固液分离技术 细胞破碎 重组蛋白的包涵体处理技术 离心 膜分离技术 双水相萃取 反胶束提取纯化技术 超临界萃取技术,吸附（色谱）分离技术 活性炭 氧化铝 硅胶 滑石粉 硅藻土 大网格聚合物吸附,固相析出分离法 盐析法 有机溶剂沉淀法 等电点沉淀 其它沉淀法 水溶性非离子型聚合物沉淀剂 金属离子和络合物沉淀 离子型多聚物沉淀剂 亲和沉淀 结晶法,重组蛋白的色谱分离法 凝胶色谱/分子筛色谱 离子交换 亲和层析 电色谱,电泳分离技术 平板电泳 连续凝胶电泳 等电聚焦点用 毛细管电泳 连续流动电用 无载体连续流动电泳,Thank you for your attention !,