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1、粗糙链孢霉的杂交,一、实验目的：,三、实验材料：,四、操作步骤：,五、结果分析：,二、实验原理：,六、参考文献：,一、实验目的：,通过对粗糙孢霉的赖氨酸缺陷型的野生型杂交所得后代的表现型的分析，了解顺序排列的四分体的遗传学分析方法，进行有关基因的着丝粒距离的计算和作图。,二、实验原理：,粗糙链孢霉(Neurospora crass)属于真菌中的子囊菌纲。它是进行顺序排列的四分体的遗传学分析的好材料。粗糙链孢霉的菌丝体是单倍体(n=7)，每一菌丝细胞中含有几十个细胞核。由菌丝顶端断裂形成分生孢子。分生孢子有两种，小型分生孢子中含有一个核，大型分生孢子中含有几个核。分生孢子萌发成菌丝，可再生成分生
2、孢子，周而复始，这是粗糙链孢霉的无性生殖过程。,粗糙链孢霉的菌株有两种不同的接合型(mating type)，用A、a或mt+、mt-表示，它们受一对等位基因控制。不同接合型菌株的细胞接合产生有性孢子，这过程称为有性生殖。有性生可以通过两种方式进行：,二、实验原理：,1当菌丝在有性生殖用的杂交培养基上增殖时，就会产生许多原子囊果，内部附有产囊体，若另一接合型的分生孢子落在这原子囊果的受精丝上时，分生孢子的细胞核进入受精丝，到达原子囊果的产囊体中，形成接合型基因的异核体。进入产囊体中的分生孢子的核发生分裂，并进入产囊菌丝中，被隔膜分成一对细胞形成钩状细胞，亦称原子囊。钩状细胞顶端细胞的二个核形成
3、合子，合子核再进行减数分裂，成为四个单倍体的核，就是四分体，再进行一次有丝分裂，变成八个核，顺序地排列在一个子囊中。原子囊果在受精后增大变黑，成熟为子囊果。一个子囊果叶集中着三十到四十个子囊，成熟的子囊孢子呈橄榄球状，长30-40微米，比3-5微米的分生孢子要大得多。子囊孢子如经60处理30-60分钟，便会发芽，长出菌丝，再度开始无性繁殖（图10-1）。,二、实验原理：,图10-1,二、实验原理：,2不同接合型的菌标的菌丝连接，两种接合型的细胞核发生融合形成合子，产生子囊果。粗糙链孢霉的于囊孢子是单倍体细胞，由它发芽长成的菌丝体也是单焙体。所以一对等位摹因决定的性状在杂交子代中就能分离。在粗糙
4、链孢霉中；一次减数分裂产物包含在一个子囊中，所以很容易看到一次减数分裂所产生的四分体中一对基因的分离，这就直观地证明基因的分离，并证明基因在染色体上。同时由于8个子囊孢子顺序地排列在子囊中，这就可以测定着丝粒距离并发现基因转变(gene conversion)。若两个亲代菌株有某一遗传性状的差异，那么杂交所形成的每一子囊，必定有4个子囊孢子属于一种类型，4个子囊孢子属于另一类型，它们的分离比倒是1：1，而且子囊孢子按一定顺序排列。如果这一对等位基因与予囊孢子的颜色或形状有关，那么在显微镜下可以直接观察到子囊孢子的不同排列方式。,二、实验原理：,本实验用赖氨酸缺陷型（记作Lys-）与野生型（记作
5、Lys+）杂交，得到的子囊孢子分离为4个黑的（+），4个灰的（）。黑的孢子是野生型的，赖氨酸缺陷型孢子成熟迟，所以呈灰色。根据黑色孢子和灰色孢子在子囊中的排列顺序，可有6种子囊类型。,二、实验原理：,子囊型（1）和（2）的产生如图。第一次减数分裂（M1）时，带有Lys+的两条染色单体移向一致，而带有Lys-的两条染色单体移向另一极。Lys+/ Lys-这对基因在第一次减数分裂时分离，称第一次分裂分离（first division segregration）。第二次减数分裂（M2）时，每一染色单体相互分开，形成四分体，顺序是+或+，再经过一次有丝分裂，成为（1）和（2）子囊型。形成这两种子囊型时
6、，在着丝粒和基因对Lys+/ Lys-间未发生过交换，是第一次分裂分离子囊。,二、实验原理：,下图表示子囊型（3）和（4）的形成。由于Lys基因与着丝粒间发生了一个交换，Lys+/ Lys-在第一次减数分离时没有分离，到第二次减数分裂（M2）时，带有Lys+的染色单体才和带有Lys-的染色单体相互分开，所以称为第二次分裂分离（second division segregration）。然后再经一次有丝分裂，形成4个孢子对，顺序是+或+。这是第二次分裂分离子囊。,二、实验原理：,（5）和（6）子囊型的形成与（3）和（4）类似，也是两个染色单体发生了交换，不过交换不是发生在第2条染色单体与第3条染
7、色单体之间，而是发生1，3或2，4两条染色单体之间，如下图。,二、实验原理：,从上面的分析可知，第二次分裂分离子囊的出现，是由于有关的基因和着丝粒之间发生了一次交换的结果。第二次分裂子囊愈多，则有关基因和着丝粒之间的距离愈远。所以由第二次分裂分离子囊的频度可以计算某一基因和着丝粒之间的距离，称为着丝粒距离。因为交换在两条染色单体之间发生而与另外两条无关，而每发生一次交换，产生一个第二次分裂分离子囊，所以，求出第二次分裂分离子囊在所有子囊中所占的比例，再乘以0.5，就可以决定某一基因与着丝间的重组值。,着丝粒和基因间的重组值,重组值除去%，即作为图距,某基因的着丝粒距离,三、实验材料：,1粗糙孢
8、霉野生型菌株，Lys+，接合型。,2粗糙链孢霉赖氨酸缺陷型菌株，Lys-，接合型a。,器具： 显微镜，钟表镊，解剖针接种针， 载玻片，试管，培养皿,培养基 ：,(1)基本培养基（野生型可生长，缺陷型不能生长）：50倍浓缩度的贮存液。 柠檬酸钠2H2O（Na3C6H5O72H2O） 125克 KH2PO4 250克 NH4NO3 100克 MgSO47H2O 10克 CaCl22H2O 5克 生物素溶液（5毫克/100毫升） 5毫升,三、实验材料：,微量元素溶液 柠檬酸2H2O 5.00克 ZnSO47H2O 5.00克 Fe(NH4)2(SO4)26H2O 1.00克 CuSO45H2O 0.
9、25克 5毫升 MnSO4H2O 0.05克 H3BO3 0.05克 Na2MoO42H2O 0.05克 蒸馏水 100毫升 氯仿 1毫升 蒸馏水 1000毫升 氯仿（防腐） 2-3毫升,用前稀释贮存液，再加1.5%的蔗糖，PH5.8。如加2%琼脂，即成本基本固体培养基。,三、实验材料：,（2）补充培养基：在基本培养基上补加一种或多种生长物质，如氨基酸、核酸碱基、维生素等。氨基酸用量一般是100毫升基本培养基中加5-10毫克。,本实验所用的补充培养基只要在基本培养基中加适量的赖氨酸，赖氨酸缺陷型菌株就能生长。,（3）完全培养基,基本培养基 1000毫升 酵母膏 5克 麦芽汁（亦可不加） 5克
10、酶解酪素 1克,三、实验材料：,维生素混合液 硫胺素 10毫克 核黄素 5毫克 吡哆醇 5毫克 泛酸钙 50毫克 对-氨基苯甲酸 5毫克 10毫升 菸酰胺 5毫克 胆碱 100毫克 叶酸 1毫克 蒸馏水 1000毫克 蔗糖 20克 肌醇 100毫克 (为获得大量分生孢子，可用1的甘油代替蔗糖。) 如加2%琼脂，即为完全固体培养基。,三、实验材料：,(4)麦芽汁培养基：可以代替完全培养基，配方简单。8波美麦芽汁2份，蒸馏水1份，再加2琼脂。,(5)马铃薯培养基：也可以代替完全培养基。将马铃薯洗净去皮，切碎，取200克，加水1000毫升，煮熟，然后用纱布过滤，弃去残渣，滤下的汁加2琼脂，20克蔗糖
11、，煮融，分装到试管中。也可将马铃薯切成黄豆大小的碎块，每支试管放34粒，再加入融化好的琼脂、蔗糖。,上述培养基都需分装到试管后，在8磅压力下消毒30分钟，取出斜摆，成为斜面备用。,(6)杂交培养基：,将玉米在水中浸软，破碎，每试管放2-3粒，加入少量琼脂(01克左右)，再放入一小片经多次折叠的滤纸、伥约34厘米)，加上棉塞，消毒即成，不需摆斜面。,三、实验材料：,(7)杂交培养基：,KH2PO4 1.0克 MgSO47H2O 0.5克 KNO3 1.0克 NaCl 0.1克 CaCl22H2O 0.13克 生物素 20微克(或5毫克100毫升溶液04毫升) 微量元素溶液 1毫升 (成分同基本培
12、养基中微量元素液配成4倍浓度的溶液稀释使用) 蒸馏水 1000毫开 蔗糖 20克 pH6.5 加2琼脂即成固体培养基。,四、操作步骤：,1.菌种活化：为使菌种生长得更好，先要进行菌种活化。将野生型和赖氨酸缺陷型菌种从冰箱中取出，分别接在两支完全培养基试管斜面上，28温箱培养5天左右。培养到菌丝的上部有分生孢子产生。,2杂交：接种亲本菌株，可采用下述方法。,(1) 同时在杂交培养基上接种两亲本菌株的分生孢子或菌丝，25温箱进行混合培养。注意要贴上标签，写明亲本菌株及杂交日期。在杂交后57天就能看到许多棕色的原子囊果出现，以后原子囊果变大变黑成子囊果(图6-5 左)，在714天左右，就可在显微镜下
13、观察。,四、操作步骤：,图6-5 左: 子囊果图. 小者为未成熟子囊果, 大者为成熟子囊果 右:子囊果压破后可见子囊内各种子囊孢子的绯列形式,四、操作步骤：,(2)在杂交培养基上接种一个亲本菌株，25培养57天后即有原子囊果出现。同时准备好另一亲本菌株的分生孢子，悬浊于无菌水中(近于白色的悬浊液)，将此悬浊液加到形成原子囊果的培养物表面，使表面基本湿润即可(每支试管约加05毫升)，继续在25培养。原子囊果在加进分生孢子1天后即可开始增大变黑成子囊果，7天后即成熟。,3显微镜观察：,(1)在长有子囊果的试管中加少量无菌水，摇动片刻，把水倒在空三角瓶中，加热煮沸，以防止分生孢子飞扬。,(2)取一载
14、玻片，滴12滴5次氯酸钠，然后用接种针挑出子囊果放在载玻片上(若附在子囊果上的分生孢子过多，可先在5次氯酸钠中洗涤，再移到载玻片上)，用另一载玻片盖上，用手指压片，将子囊果压破置显微镜下。,四、操作步骤：,显微镜 (10X15倍)检查，即可见到3040个子囊。观察子囊中子囊孢子的排列情况(图6-5右)。这里用载玻片盖上压片而不用盖玻片，是因为子囊果很硬，用盖玻片压，盖玻片会破碎。也可在显微镜下用镊子把子囊果轻轻夹破，挤出子囊。如发现3040个子囊象一串香蔗一样，可加一滴水，用解剖针把子囊拨开。此过程无需无菌操作，但要注意不能使分生孢子散出。观察过的载玻片、用过的镊子和解剖针等物都需放入5的石碳
15、酸中浸泡后取出洗净，以防止污染实验室。操作步骤见图6-6。,4实验步骤说明,(1)实验所用的赖氨酸缺陷型，有时接种在完全培养基上，也长不好，需要加适量赖氨酸。 (2)杂交后培养温度要控制在25；30以上即抑制原子囊果的形成。,四、操作步骤：,图6-6 链孢霉杂交实验步骤,五、结果分析：,1观察一定数目的子囊果，记录每个完整子囊的类型，计算Lys基因的着丝粒距离。,2绘一显微镜下观察的杂交子囊的图。,3说明粗糙链孢霉中基因分离现象和高等动物、高等植物中因分离的主要区别。,4用图表示第六种子囊类型的形成。,五、结果分析：,5实验结果说明：,(1)赖氨酸缺陷型的子囊孢子成熟较迟，当野生型的子囊孢子已
16、成熟而呈黑色时，赖氨酸缺陷型的子囊孢子还呈灰色，因而我们能在显微镜下直接观察不同的子囊类型。但是如果观察时间选择不当，就不能看到好的结果。过早，所有子囊孢子都未成熟，全为灰色；过迟，赖氨酸缺陷型的子囊孢子也成熟了，全为黑色，就不能分清各种子囊类型。所以在子囊果形成期间，要预先观察子囊孢子的成熟情况，选择适当时间进行显微镜观察。,(2)有时观察到的子囊孢子的排列为+，+，+，+， 即为6：2或2：6的分离比和5：3或3：5的分离比。排除上面第(1)点说明的原因外，这样的情况的出现是由于基因转变造成的(图6-7)。基因转变的频率因基因位点不同而异，但一般在1：6左右。,图6-7 根据Hollida
17、y的重组模型表示基因转换的一种可能分子机制,五、结果分析：,图6-7 根据Holliday的重组模型表示基因转换的一种可能分子机制。A. 一个四分体四个染色单体的DNA双螺旋, B. 只表示第2和第3染色单体.并表示5和3端, 核酸内切酶将两个DNA分子的一条链切开,并且发生互换,C. 互换的结果 D. 外切酶切除未重组链上未配对的核苷酸DNA, 一条链上有缺口, E. DNA多聚酶合成新的DNA填补空缺, 产生异源双链。F. 重组染色单体分开,形成每一单体的杂种DNA分子, G. 左: 四个第二次减数分裂后产生的DNA分子: 右: 减数分裂后产生的8个子囊孢子。,(3)本实验用的赖氨酸缺陷型菌株为Lys5，Lys5基因座位于第六连锁群，着丝粒距离约为148图距单位。可供实验结果计算时参考。,六、参考文献：,1盛祖嘉，1981，微生物遗传学，科学出版社。 2J.R.S. Fincham，PRDayandARadford1979FungalGenetics4th edBlackwell Scientific Publications.,