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1、2005年中国肿瘤临床年鉴 应用DNA微阵列研究斑蝥酸钠诱导K562细胞凋亡前后的基因变化宋艳斌 马文丽 冯春琼 郑文岭南方医科大学基因工程研究所 广州 510515斑蝥是芫青科昆虫南方大斑蝥或黄黑小斑蝥的干燥全虫。我国很早就有关于斑蝥能抗肿瘤的记载1 。现代医学研究证明，斑蝥其有效成分是斑蝥素，即斑蝥酸酐，它是斑蝥体内提取的一种单萜类物质，可以抑制癌细胞的核酸代谢及蛋白质的合成，导致癌细胞死亡。但斑蝥素的不良反应较大，主要是泌尿道和消化道反应，使它的临床应用受到极大的限制。近来，人们合成了许多斑蝥素的衍生物，如斑蝥素与铂的络合物、去甲斑蝥素、斑蝥酸钠等2 ，以降低斑蝥素的不良反应，增强药物疗
2、效。我们应用DNA微阵列技术，观察了斑蝥酸钠诱导K562细胞凋亡前后细胞基因表达的改变，初步研究斑蝥钠诱导细胞凋亡的分子机制。一、材料和方法（一）材料RPMI1640细胞培养基、Super Script反转录酶购自Gibco RBL公司，小牛血清购于四季青公司，噻唑蓝（MTT）购于Sigma公司，二甲基亚砜（DMSO）购于上海生物工程公司，Trizol、DNA聚合酶（Taq酶）购于上海博彩生物工程公司，其它常用酶类购于宝生物工程公司。2预杂交溶液:25% 甲酰胺，5SSC，0.1% SDS;清洗溶液:2SSC，0.1% SDS;溶液:0.1SSC，0.1% SDS;溶液:0.1SSC。Pixs
3、ys 5500芯片打印仪购自Cartesian公司，Scan Array Lite芯片扫描仪及其分析软件Quantarray购自Gsi Lumonics公司，玻片及芯片杂交盒购自Corning公司。艾易舒注射液（0.1mg/10ml即斑蝥酸钠维生素B6注射液），贵州柏强制药有限公司提供，批号20030717。（二）方法1. 药物作用浓度的确定 依据静脉滴注药物的血浆峰值浓度公式：C=50D/50002（g/ml）D指每日的给药量（mg/d）以及艾易舒注射液在临床的使用药量（0.5mg/d），计算出艾易舒注射液的血峰浓度为2.5g/ml。艾易舒注射液处理的实验组依预实验结果，设立1.25g/ml
4、;2.5g/ml和5.0g/ml三个浓度。 2. 细胞培养及处理 人红白血病细胞K562培养于含10%小牛血清的RPMI1640培养基中，置于37，5% CO2 细胞培养箱中，常规培养。每3日换液1次。实验时，以1104 个细胞/ml接种，在细胞的对数生长期加入药物，使其浓度分别为:处理组（艾易舒注射液）1.25g/ml、2.5g/ml、5.0g/ml;阴性对照（生理盐水）0g/ml。 3.艾易舒注射液对K562细胞生长的抑制作用 K562细胞接种于24孔细胞培养板中，每孔接种1ml。细胞处理同前所述。培养20h后，加入MTT溶液，继续培养4h，参照文献3的方法，在570nm波长处测定A值。每
5、个浓度接种3个孔，绘制细胞增殖抑制曲线。 4.细胞凋亡的检测 细胞接种于24孔细胞培养板中，如上法加入药物，常规培养后，加入MTT溶液，镜下观察细胞的凋亡情况4。同时细胞接种在250ml细胞培养瓶中，培养24h后，提取细胞的DNA5 ，1.0%的琼脂糖凝胶电泳，恒压30V/cm。5样品制备 K562细胞培养基中加入艾易舒注射液，继续培养4h后，离心收获细胞，参照Trizol试剂盒的方法，提取细胞总RNA。取总RNA 40g，用Super Script反转录成cDNA第一链，分别用Cy3/Cy5标记对照组/处理组，PCR产物纯化试剂盒纯化后溶于30l TE中。真空抽干，重溶于5l水中。分别取出2
6、l，加入2杂交缓冲液2l，955min，14000r/min，离心2min，取出3.5l用于与微阵列杂交。 6. DNA微阵列探针的收集及芯片制备 常规培养的K562细胞，提取细胞的总RNA，合成cDNA第一链后，用RD技术3收集cDNA片段，与T载体连接后转入质粒中保种。PCR扩增插入片段，异丙醇纯化后，调整浓度为600ng/l，打印芯片。共收集了162个cDNA探针片段，以看家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为阳性对照，水稻基因组DNA为阴性对照，50%二甲基亚砜（DMSO）为空白对照，每个探针重复打印3个点，形成3018的阵列。打印好的芯片经紫外交联（能量为90mJ），80干烤2
7、h，避光保存备用。 7 .DNA微阵列的杂交检测及数据处理DNA微阵列在42杂交18h，取出，分别用清洗溶液、洗涤，空气干燥。扫描仪扫描每个探针的荧光强度，用ScanArray软件进行分析，根据以下两个条件作为判断基因差异表达的标准:（1）两者的荧光强度之比Cy5/Cy32或500.0。 （二）结果1. 艾易舒注射液对K562细胞生长的抑制作用 从图1 K562细胞加药后的生长曲线来看，加入艾易舒注射液的K562细胞，生长明显变缓，药物浓度达到5g/ml时，细胞生长基本上完全受到抑制；加入浓度为2.5g/ml时，细胞生长也受到较大的抑制。图1 K562细胞加药后的细胞增殖抑制曲线对照组指加入生
8、理盐水，1.25g/ml、2.5g/ml、5.0g/ml指加入艾易舒注射液后的终浓度。2.细胞凋亡的检测 分别提取艾易舒注射液作用细胞前后的DNA，1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。可看到对照组和艾易舒注射液浓度为1.25g/ml时，电泳只检测到一条清晰的基因组条带，而当艾易舒注射液的浓度达到2.5g/ml和5.0g/ml时，可看到呈明显拖尾的凋亡电泳带（图2）应用MTT染色在普通光学显微镜下观察凋亡，可看到对照组细胞形态圆整，细胞内形成的蓝紫色结晶较多，分布也比较均匀;而加入艾易舒注射液的处理组细胞，细胞皱缩，胞体变小，蓝紫色结晶在细胞中呈团块状聚集，在细胞边缘形成块状或星月状的致密浓染区域，也
9、可见凋亡细胞以类似出芽的方式形成带有部分胞质和染色质碎块的凋亡小体，呈蓝紫色小球，分布在细胞邻近。3. DNA微阵列的杂交检测 艾易舒注射液处理前后的样品分别用Cy5和Cy3荧光素标记，与微阵列杂交后经扫描仪扫描，从荧光扫描图可以明显看出，艾易舒注射液处理K562细胞后，细胞的基因表达整体下调。再将Cy5和Cy3的扫描图像完全重叠，得到双色荧光杂交图，其中红色点表示低表达，绿色点表示高表达，黄色点表示表达水平无改变，见图3所示。图4DNA微阵列杂交的双色荧光图 图中DNA微阵列的第14行第13、79、1315 是GAPDH的阳性对照;第46、1012、1618点是水稻基因片段的阴性对照;第15
10、行18个点均行50% DMSO的空白对照;第30行的第13、79点是GAPDH的阳性对照;第46、1012、1618点是水稻基因片段的阴性对照。图3经软件分析后，得到微阵列杂交的散点图（图4）。每个点的X轴表示Cy3的杂交信号的相对强度;Y轴表示Cy5杂交信号的相对强度。45角直线（实线所示）上的点Cy5/Cy3的比率为1，表示无差异表达，远离45角直线的点为差异表达，离的越远，表示差异越大（图5）。图5 DNA微阵列的散点图（空）对DNA微阵列杂交图的进一步分析发现有37个基因表达下调（Cy5/Cy30.5），列表如下：Down-regulated genes in K562 cells i
11、nduced by Sodium CantharidateGenebank IDGene nameNM_002696.1polymerase（RNA）（DNA directed）polypetide G (POLR2G),mRNAXM_048058.2polymerase（RNA）（DNA directed）polypetide CBCO06498ribonucleotide reductase M1 polypetideAY032628.1mitochondria solute carrier protein （MSCP） mRNANM_016070.2mitochondrial ribos
12、omal protein S23（MRPS23），nuclear gene encoding mitochondrial protein， mRNAHUMCD53 GLYCD53 glycoprotein mRNA，complete cdsAFO75242tumor transforming protein 1 （TUTR1） mRNANm_053967.3Enhancer of zeste homolog2（Drosophila）（EZH2）， mRNANM_004361.115 kDa selenoprotein（SEP15）， mRNAXM_057125.1guanine nucleot
13、ide binding protein（G protein），beta polypetide 2-like 1BCO27178.1Formin binding protein 3HSU17899chloride channel regulatory protein mRNA， complete cdsBCO04155ringer protein 5BCO00517threonyl-tRNA synthetaseXM_018001.1alanyl-tRNA synthetaseBCO07755glycyl-tRNA synthetaseXM_097582.1eukaryotic translat
14、ion initiation factor 3，subunit 2（ beta，36kD）XM_049354.3ribosomal protein L9；60S ribosomal protein L9（LOC93123）, mRNAAF155096NY-REN-6 antigen mRNA，partial cdsNM_005452.3Chromosome 6 open reading frame 11（C6orf11），mRNAXM_045800.2ribosomal protein，large，POBCO17449PAI-1 mRNA-binding proteinNM_016397.1T
15、H1-like(Drosophila)（ TH1L），mRNAXM_096767.1proteasome（prosome，macropain）activartor subunit 1（PA28 alpha）HSM802601cDNA DKFZp762H186（from clone DKFZp762H186）；complete cdsBCO02406pyruvate dehydrogenase（lipoamide）alpha 1XM_040578.1phosphatidylserine synthase 1（PTDSS1）, mRNABCO12195Valosin-containing prot
16、einXM_039827.2reticulon 4（RTN4），mRNANM_018269.1SIPL protein（SIPL），mRNABCO01011cleavage stimulation factor，3pre-RNA，subunit 1XM_012124.1KIAA0152 gene productBCO24192.1host sell factor homologXM_031941.113kDa differentiation-associated protein（DAP13），mRNAAF313485S1tissue-type kidney valosin-containing
17、 protein mRNAXM_083905.1hypothetical protein FLJ10563（ FLJ10563），mRNANm_014306.1hypothetical protein（ HSPC117），mRNA二 讨论斑蝥酸钠是斑蝥素的半合成衍生物，我们在实验中发现，1.25g/ml的斑蝥酸钠就能抑制细胞生长，浓度达到2.50g/ml时，K562细胞出现明显的凋亡，证明斑蝥酸钠在体外能有效诱导K562人红白血病细胞凋亡。细胞凋亡是与细胞坏死不同的死亡方式，与肿瘤的发生、发展以及治疗和预后有关。我们应用DNA微阵列技术比较斑蝥酸钠诱导K562细胞凋亡前后的基因表达变化，发现大
18、部分基因片段的表达都有所降低，这与发生凋亡时，细胞生命活动大大降低，mRNA产生大大减少是一致的。进一步分析发现有37个基因片断的表达降低，其中包括与细胞蛋白合成密切相关的基因，如丙氨酰-tRNA合成酶、苏氨酰-tRNA合成酶、甘氨酰-tRNA合成酶以及真核翻译起始因子3、60s核糖体蛋白L9等;与细胞转录有关的基因如DNA指导的RNA聚合酶等;与细胞mRNA转录后加工有关的切割刺激因子（cleavage stimulation factor）6 ;与细胞代谢相关的基因如丙酮酸脱氢酶等;与细胞凋亡密切相关的 基因片段，如PAI-1等。在肿瘤的增殖中，内皮和血管生成也起着非常重要的作用。型纤溶酶
19、原激活物抑制因子（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）通过抑制内皮细胞与玻基结合素（识别凋亡细胞的物质）之间的粘附，促进玻基结合素向纤溶酶的移动，刺激内皮细胞向纤溶酶迁移，促进血管生成，从而促进细胞生长，抑制细胞凋亡7 。柔红霉素诱导人脐静脉内皮细胞凋亡后，PAI-1的表达明显降低8 ，而我们也在As2O3 诱导K562细胞的凋亡中发现PAI-1基因表达降低。基因芯片是研究功能基因变化的重要工具。本研究中，我们利用K562细胞表达谱基因芯片，在一次实验中就对几百个基因同时进行了考察，研究斑蝥酸钠诱导细胞凋亡的分子机制。既成百上千倍地提高了实验效率，又
20、显著降低了系统误差。从实验结果看，基因表达谱的变化与细胞形态功能改变的一致性较好，说明所采用的基因芯片技术是可靠的。此外，基因芯片的实验结果，又为我们提出了许多可供深入探讨的研究线索，并提供了更加广阔的思维空间。因此，基因芯片是研究细胞之功能基因表达改变的重要工具。 参考文献1 高倬，姜平，熊惠周.斑蝥素衍生物与铂络合物体外耐药性初探.时珍国医国药，2000；11（5）:385.2 孙震晓，赵天德，魏育林，等.去甲斑蝥素诱导人红白血病K562细胞凋亡的实验研究.中国组织化学与细胞化学杂志，1999；8（1）:9298.3 程宝鸾（主编）.动物细胞培养技术.广州:华南理工大学出版社，2000，1
21、31-132.4 冯春琼，马文丽，宋艳斌，等.用MTT染色法检测细胞凋亡.第一军医大学学报，2002；（3）:262263.5 Herrmann M，Lorenz HM， Voll R，et al.A rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments.Nucleic Acids Research，1994；22（24）:55065507.6 Bleoo S，Sun X，Hendzel M J，et al.Association of human DEAD box protein DDX1 with a cl
22、eavage stimulation factor involved in 3-end processing of pre-MRNA.Mol-Biol-Cell，2001；12（10）:30463059.7 Isogai C，Laug WE，Shimada H，et al.Plasminogen activator inhibitor-1 promotes angiogenesis by stimulating endothelial cell migration toward fi-bronectin.Cancer-Res，2001；61（14）:55875594.8 Soeda S，Iwata K，Hosoda Y，et al.Daunorubicin attenuatestumor necrosis factor-alpha-induced biosynthesis of plasminogen activator inhibitor-1 in human umbilical veinendothelial cells.Biochim-Biophys-Acta，2001；1538（2-3）:234241.（由广州第一军医大学分子生物学研究所和广州军区肿瘤分子生物学研究所提供，获广东省科技计划项目C30903）