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1、CpG ODN增强树突状细胞对胃癌细胞增殖周期和凋亡影响的实验研究作者：孙梯业颜伟刘全达张娜贾洪琳段伟宏周宁新 作者单位：100088北京，第二炮兵总医院肝胆胃肠病研究所(孙梯业、刘全达、贾洪琳、段伟宏、周宁新);空军总医院医务部(颜伟、张娜)【摘要】目的探讨CpG ODN1826增强树突状细胞(DC)抗胃癌效应的作用。方法分离正常人外周血DC，用GM-CSF和IL-4培养，于第5天加入TNF-并分成、组继续培养。第6天各组均加入胃癌细胞冻融抗原50 l，、组再分别加入CpG ODN1826 10 g/ml，第10天ELISA检测IL-12和IFN-的水平，MTT法检测CTL对MKN45、MK
2、N28、SGC7901和A549细胞的体外杀伤效应。流式细胞术检测CpG ODN1826增强DC对胃癌细胞增殖周期、凋亡的影响。结果体外培养第10天，加入CpG ODN1826后各组IL-12、IFN-的分泌量明显提高;CpG ODN1826协助DC对同种不同分化类型的胃癌细胞株MKN45、MKN28、SGC7901均有强烈的杀伤效应(P0.01)，杀伤活性显著高于A549(P0.01)。体外应用CpG ODN1826对肿瘤细胞周期比例：G0/G1间期(MKN45 68.35%、MKN28 69.23%、SGC7901 69.80%)，S期(MKN45 39.45%、MKN28 39.75%、
3、SGC7901 39.55%)，G2/M期(MKN45 6.50%、MKN28 6.30%、SGC7901 6.42%);与A549(G0/G1间期57.68%，S期25.13%，G2/M期18.46%)比较，差异有统计学意义(P0.01);同时，不同肿瘤细胞株的凋亡率分别为MKN45 75.20%、MKN23 73.87%、SGC7901 72.43%、A549 51.43%，表明CpG ODN1826能显著增强DC对胃癌细胞周期的抑制作用，促进胃癌细胞的早期凋亡(P0.01)。结论CpG ODN1826体外可显著增强DC诱导出高效而特异的抗胃癌效应，显著抑制胃癌细胞分裂增殖、促进凋亡，可作
4、为胃癌免疫治疗的一种有效方法。【关键词】 胃肿瘤;树突细胞;细胞周期;细胞凋亡;CpG ODN【Abstract】ObjectiveTo explore whether CpG ODN1826 assist dendritic cells(DC) to affect the anti-gastric cancer effects in vitro.MethodsDC was isolated from normal human peripheral blood by GM-CSF+IL-4，and append TNF- in the fifth and divided ， groups，an
5、d append carcinoma antigen 50 l in every group，CpG ODN1826 10 g/ml in ， groups in the sixth day.IL-12 and IFN- levels were detected using ELISA in 10th day.The cytotoxicity of CTL to MKN45，MKN28，SGC7901，A549 was detected by MTT assay in vitro.The inhibitive effects of CpG ODN1826 on gastric cell pro
6、liferation cycle and apoptosis in vitro were detected by flow cytometry.ResultsOn the 10th day，IL-12，IFN- level were significantly increased in the CpG ODN1826 groups.The CTL had much obviously raised the cytotoxicity to different differentiated types of the three gastric cancer cell lines such MKN4
7、5，MKN28，SGC7901 by CpG ODN1826，and than A549 (P0.01).Treated with the CpG ODN1826 in vitro，the percentages of G0/G1，S and G2/M cells of tumor cells were(MKN45 68.35%，MKN28 69.23%，SGC790169.80%)，(MKN45 39.45%，MKN28 39.75%，SGC7901 39.55%) and(MKN45 6.50%，MKN28 6.30%，SGC7901 6.42%) respectively.and the
8、 apoptosis of MKN45 75.20%，MKN23 73.87%，SGC7901 72.43%，A549 51.43%，indicated CpG ODN1826 may significantly inhibit the percentages of three gastric cell lines，and promote gastric cell early apoptosis(P0.01).ConclusionsThe effecience and specificity of CpG ODN1826 can observably enhance dendritic cel
9、ls induce the effecience and specificity of anti-gastric cancer activity，can significantly inhibit gastric cells proliferation and growth，and promote gastric cell early apoptosis，and might provide a new kind of therapeutic means for gastric cancer.【Key words】Stomach neoplasms;Dendritic cells;Cell cy
10、cle;Apoptosis;CpG oligodeoxynucleotides树突状细胞(dendritic cells，DC)是迄今为止发现的机体免疫系统中功能最强大的专职抗原提呈细胞(antigen presenting cells，APC)，可有效地递呈可溶性肿瘤抗原，增强机体对肿瘤的特异性免疫应答1。DC激活的细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)介导的免疫反应在机体抗肿瘤免疫反应中发挥重要作用2-3。近年研究发现，细菌DNA除了编码基因产物以外，还因含有非甲基化的CpG基序可以有效地活化APC，具有强大的免疫激活作用4。而细菌基因组DNA由于来自细菌的脂多糖(LPS)具有明确的诱导DC成熟并
11、影响其功能的作用5。前期研究表明，CpG ODN可显著地诱导人外周血DC分化成熟，增强DC对胃癌细胞MKN45的杀伤作用6。本研究在前期研究的基础上，进一步研究CpG ODN增强DC对胃癌细胞的杀伤作用，并对胃癌细胞分裂增殖、凋亡的影响进行研究，为CpG ODN作为免疫佐剂在临床应用提供理论和实验依据。材料与方法一、实验材料健康成人新鲜外周血100 ml(由第二炮兵总医院肝胆胃肠病研究所提供)。健康志愿献血者，年龄2540岁，共4份，每份25 ml，均在献血后立即进行外周血单个核细胞的分离。胃癌细胞株MKN 45、MKN 28和SGC7901购自第四军医大学消化病研究所，肺癌细胞株A549购自
12、第三军医大学全军呼吸病研究所，CpG ODN(5-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3)由第三军医大学药理学教研室合成，MTT、RPMI1640、DMSO、胎牛血清、淋巴细胞分离液、人IL-12和IFN- ELISA试剂盒及碘化丙啶染液等均购自Sigma公司，GM-CSF、IL-4、TNF-均购自美国Peprotech EC公司;Annexin-V-Flous凋亡试剂盒(Roche);流式细胞仪购自美国Bio-RAD公司。二、方法1. 细胞培养：取对数生长的三株胃癌细胞MKN 45、MKN 28、SGC7901和肺癌细胞株A549，加入0.25%胰蛋白酶消化后加入含10%灭活的新生小牛
13、血清的RPMI1640细胞培养液，置于37 、5% CO2细胞培养箱中培养，隔日更换新鲜培养液，每隔34 d传代。取对数生长期细胞进行实验，实验前用倒置显微镜观察，形态良好，折光性强。2. 胃癌细胞冻融抗原的制备：收集对数生长期的三株胃癌细胞MKN 45、MKN 28和SGC7901制成细胞悬液，于液氮、37 水浴中反复冻融4次(800 r/min，离心半径5 cm,10 min)，取上清液经0.22 m 滤膜过滤即为细胞冻融抗原，-80 冻存备用。3. 人外周血DC的培养：取健康成人外周血100 ml，收集外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells
14、，PBMC)，用含GM-CSF 100 g/ml、IL-4 100 g/ml及RPMI1640的培养液培养，获得贴壁的DC前体细胞，第5天加入TNF- 100 g/ml并分成、组继续培养。第6天各组均加入胃癌细胞冻融抗原50 l，、组再分别加入CpG ODN1826 10 g/ml继续培养，每2 d更换培养液并补加细胞因子。分别调整细胞密度为2108/ml，接种于24孔培养板，2 ml/孔，然后置37 、5% CO2培养箱内培养。第10天消化，分别收集4组细胞并计数。4. 体外细胞毒活性测定：收集培养第10天的各组DC，调整细胞密度1109/ml。收集淋巴细胞，调整细胞密度为4.0107/ml
15、。将各组DC与淋巴等量混合培养，即DC淋巴细胞=140。第6天在各组中分别加入冻融法获取的肿瘤抗原50 l，继续培养4 d后，收集淋巴细胞即抗原特异性T淋巴细胞作为效应细胞，调整密度为1109/ml;收集培养的MKN 45、MKN 28和SGC7901为靶细胞，用不含血清的培养液将细胞悬液浓度调整为1.0107/ml，取各组效应细胞同各组靶细胞100 l在96孔板中混合，即效应细胞淋巴细胞=401，在37 CO2温箱中培养4 h后。设各组空白对照，所有实验组均设5个复孔，标准条件下培养4 h后细胞贴壁，每孔中加入5 mg/ml的MTT 20 l，置37 CO2温箱培养4 h后取出，每组前3个复
16、孔分别加入20 l新鲜配制的MTT溶液(5 mg/ml)，继续孵育4 h，吸出孔内培养液，每孔加入150 l DMSO，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光(absorption，A)值，计算细胞杀伤活性，实验重复3次。剩余复孔细胞继续培养至第10天进行IFN-、IL-12和相关检测。杀伤活性=1-实验组A值/(效应细胞对照组A值+靶细胞对照组A值)100%。5. IFN-、IL-12的检测：取上述体外诱导培养至第10天的CTLs细胞上清液每孔100 l，按ELISA检测试剂盒说明测定IFN-和IL-12的含量。6. 外周血T淋巴细胞获取
17、：用淋巴细胞分离液分离获取PBMC，制备尼龙毛柱，1109 PBMC重悬于2 ml RPMI1640培养基中，将均匀细胞悬液装入尼龙毛柱，关闭阀门置37 孵育60 min,37 预温、含20% FCS的RPMI1640培养基洗脱毛柱2次，获取T淋巴细胞，台盼蓝染色检测活细胞比例。7. 细胞周期检测：收集培养至第10天的剩余复孔肿瘤细胞，以0.25%胰酶消化后，制成单细胞悬液，1500 r/min离心10 min，弃上清，调整细胞浓度为1105/ml;置于6孔板中，每孔细胞数为2105,37 、5 % CO2条件下，培养20 h。以4 预冷的PBS洗涤细胞，1500 r/min离心5 min，重
18、复两次，弃上清，以0.5 ml预冷的PBS重悬细胞，加入3000活性单位的RNase A,37 水浴30 min;冰浴降温，终止RNase A的作用后，加入碘化丙碇染液0.5 ml染色30 min，样品置于暗处备用;检测前用400目尼龙网过滤除去杂质，调整细胞浓度为1107个/ml;488 nm激发波长测定样品，620 nm带通滤片检测PI荧光。每样本收集多于10 000个荧光信号，采用Multi Cycle DNA软件分析细胞周期分布情况，计算细胞分裂增殖指数(Proliferation Index，PI)。PI=S%+G2/M%/(G0/G1+S%+G2/M%)100%。8. 细胞凋亡检测
19、：收集培养至第10天的剩余复孔肿瘤细胞，以0.25%胰酶消化后，制成单细胞悬液，1500 r/min离心10 min，弃上清，调整细胞浓度为1105/ml;置于6孔板中，每孔细胞数为2105,37 、5% CO2条件下，培养20 h。以4 预冷的PBS洗涤细胞，1500 r/min离心5 min，重复2次，弃上清，以0.5 ml 4 PBS重悬细胞后，移至 EP 管中，再次 1500 r/min离心 5 min;加5 l Annexin -FITC 溶液和2.5 l 碘化丙啶染液到100 l 细胞混悬液中，混合后室温避光反应30 min，加入反应缓冲液400 l，送检。三、统计学分析所得数据用
20、均数标准差(x-s)表示。采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，均数的比较用t检验及单因素方差分析，P0.05时表示差异有统计学意义。结果1. CpG ODN1826诱导DC对肿瘤细胞的杀伤作用：MTT检测结果显示：胃癌抗原致敏DC诱导的特异性CTLs对分化不同的同种胃癌细胞株MKN45(组)、MKN28(组)和SGC7901(组)均有较高的杀伤率，对肺癌细胞株A549的杀伤率较低，MKN45、MKN28和SGC7901与A549(组)比较，差异有统计学意义(P0.01)，说明胃癌致敏DC诱导的CTLs对胃癌细胞的杀伤活性具有较强的特异性，而对A549没有特异性的杀伤作用(表1)。而Cp
21、G ODN1826可明显提高胃癌抗原致敏DC诱导的特异性CTLs对分化不同的同种胃癌细胞株MKN45(组)、MKN28(组)和SGC7901(组)的杀伤率，对A549(组)的杀伤率较高，组、组、组与组比较，差异有统计学意义(P0.05)，三株胃癌细胞与A549相比，差异有统计学意义(P0.01)，说明胃癌致敏DC的效应细胞均可释放IFN-和IL-12，分泌量明显增高，而对A549(组)没有明显增高(表3)。而CpG ODN1826可显著提高胃癌抗原致敏后的三株胃癌细胞MKN45(组)、MKN28(组)和SGC7901(组)上清液中IFN-、IL-12的分泌量，对A549(组)也有明显的提高，组
22、、组、组与组比较，差异有统计学意义(P0.01)，说明CpG ODN1826能显著增强胃癌致敏后的三株胃癌细胞的上清液中IFN-、IL-12的含量，对A549上清液中IFN-、IL-12的含量也有明显的提高(表4)。表3DC对肿瘤细胞培养上清IFN-、IL-12的表达量表4CpG ODN1826对肿瘤细胞培养上清IFN-、IL-12的表达量3. 流式细胞仪分析肿瘤细胞周期：MKN45(组)、MKN28(组)和SGC7901(组)中G0/G1期细胞比例分别为(68.351.21)%、(69.231.24)%和(69.801.20)%，S期分别为(39.453.23)%、(39.753.19)%和
23、(39.553.20)%，G2/M期分别为(6.503.24)%、(6.303.42)%和(6.422.37)%;A549(组)中G0/G1期细胞比例为(57.681.32)%，S期为(25.133.13)%，G2/M期为(18.462.48)%。与A549(组)相比，三株胃癌细胞中G0/G1期、S期细胞明显增多，G2/M期细胞显著降低，说明DNA合成前期(G1/G0期)和合成期(S)细胞比率显著升高，DNA合成后期/分裂期(G2/M)细胞比率明显下降。三株胃癌细胞与A549相比，统计学差异显著(P0.01)。本实验说明胃癌抗原致敏DC对三株胃癌细胞的细胞周期有明显的抑制作用，对A549的细胞
24、周期无明显的抑制作用(图1)。而CpG ODN1826可显著增加三株胃癌细胞MKN45(组)、MKN28(组)和SGC7901(组)中G0/G1期(89.121.54)%、(88.421.76)%和(89.271.65)%、S期细胞数量(67.6212.44)%、(68.272.59)%和(68.112.37)%，显著降低G2/M期细胞(2.263.34)%、(2.413.42)%和(2.392.37)%，说明CpG ODN1826可显著升高DNA合成前期(G1/G0期)和合成期(S)细胞比率，显著降低DNA合成后期/分裂期(G2/M)细胞比率。同时，CpG ODN1826可明显增加A549(
25、组) G0/G1期(70.361.13)%、S期(39.352.08)%细胞数量，降低G2/M期细胞数量(16.522.15)%，组、组、组与组比较，差异有统计学意义(P0.05)，三株胃癌细胞与A549相比，差异有统计学意义(P0.01)，说明胃癌致敏DC可显著增加分化不同的同种胃癌细胞株MKN45、MKN28和SGC7901的凋亡率，而对无关肺癌细胞株A549的凋亡没有明显作用(图3)。而CpG ODN1826可显著协助DC增加三株胃癌细胞MKN45(组)、MKN28(组)和SGC7901(组)的凋亡率(75.207.50)%、(73.876.70)%和(72.876.67)%，明显增加A
26、549(组)的凋亡率(51.435.24)%(图4)，组、组、组与组比较，差异有统计学意义(P0.01)，说明CpG ODN1826可明显增加分化不同的同种胃癌细胞株MKN45、MKN28、SGC7901和肺癌细胞株A549的凋亡率。讨论DC是唯一能激活初始型T细胞的APC，它决定着特异性免疫应答对抗原的选择性并提供共刺激信号，能有效地活化CD8+CTLs，产生体内外抗肿瘤效应，在肿瘤细胞免疫和体液免疫中均发挥重要作用7。肿瘤患者APC数量或功能缺陷、肿瘤相关抗原性弱等原因可导致机体无法识别和提呈肿瘤抗原，不能激发有效的CTLs抗肿瘤免疫反应，最终导致免疫逃逸和肿瘤的发生8。实验结果表明，胃癌
27、抗原致敏DC诱导的特异性CTLs对分化不同的三株同种胃癌细胞株均有较高的杀伤率，对无关肿瘤细胞株A549的杀伤率较低，说明胃癌致敏DC诱导的CTLs对胃癌细胞的杀伤活性具有较强的特异性。而CpG ODN是富含胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸的特殊结构，在细菌DNA中出现频率较高，而在哺乳动物DNA中出现的频率相对较低且常被甲基化，细菌与哺乳动物间的这种差异，是细菌非甲基化CpG DNA序列可能是哺乳动物免疫系统的预警信号9。研究表明，某些人工合成的CpG ODN序列有显著的免疫刺激活性10，包括B细胞、巨噬细胞、NK细胞等，可以刺激巨噬细胞产生细胞因子以及在巨噬细胞存在的前提下刺激NK细胞产生IFN-，
28、可以直接刺激B细胞增殖及分泌抗体，还可诱导B细胞产生细胞因子。也可直接激活DC而无需其他辅助因子参与，主要表现为DC功能的成熟、Th1型细胞因子的分泌和共刺激分子的表达等方面，另外细菌DNA或CpG ODN还可刺激淋巴细胞产生以Th1型免疫应答为主的细胞因子，并刺激细胞表面分子MHC-、CD83、CD86等的表达6。目前尚未发现细菌DNA直接激活T细胞的证据。实验结果表明，CpG ODN1826除了显著提高胃癌抗原致敏DC后的三株胃癌细胞上清液中IFN-、IL-12的分泌量，可能与CpG ODN1826刺激IL-12等相关细胞因子的表达有关，在IL-12协同作用下直接激活NK细胞，被激活的NK
29、细胞杀伤活性增强，通过APC的抗原提呈作用以及分泌的细胞因子如IL-12、IFN-等，反过来进一步促进单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞的激活，间接促进T细胞活化效应，与Yi等11研究结果基本一致。说明CpG ODN1826可诱导机体产生Th1型免疫细胞因子和相关抗体，显示出良好的佐剂效应，它能够同时增强体液免疫和细胞免疫应答，尤其对细胞免疫应答具有更突出的增强作用。同时，实验中还发现，CpG ODN1826可显著提高胃癌抗原致敏DC诱导的特异性CTLs对分化不同的三株同种胃癌细胞株的杀伤率，对肺癌细胞株A549也有较高的杀伤率，说明CpG ODN不仅能有效激活天然免疫，而且能有效激活获得性免疫，
30、在CpG ODN的协同下，进一步刺激抗原特异性B细胞和T细胞分化，在Th1细胞因子的作用下，增强肿瘤抗原的免疫原性，免疫效果非常明显。表明CpG ODN抗肿瘤活性明显优于DC，可诱导DC产生抗肿瘤活性，可能与Th1型免疫反应和抗原的交叉提呈有关12。实验发现，三株胃癌细胞的细胞周期均呈现明显G0/G1期增多的趋势，表明CpG ODN协助DC具有显著抑制胃癌细胞DNA合成、染色质中蛋白质合成的作用，阻止细胞由G0/G1期向DNA合成期即S期的转化，为抑制胃癌细胞由S期向活跃的有丝分裂期G2/M期转变提供了必备的条件。与此同时的FACS分析结果还表明，CpG ODN能够明显协助DC促进胃癌细胞凋亡
31、，这也表明胃癌细胞经CpG ODN1826作用后处于活化状态进而使免疫细胞开始增殖，发挥免疫效应，清除外来抗原，恢复自身生理平衡和稳定。我们的结果初步证实了CpG ODN1826不仅能够通过抑制胃癌细胞由G0/G1期向S期转化，抑制胃癌细胞的增殖，同时还通过促进胃癌细胞的凋亡来扩大免疫细胞群体，产生清除抗原的免疫应答。而对于肺癌细胞株A549，CpG ODN1826也能明显抑制其细胞周期、增加其凋亡率。至于CpG ODN1826抑制胃癌细胞的细胞周期由C0/G1期向S期转变，促进胃癌细胞凋亡的分子机制，如在细胞周期中由G0/G1期向S期转变中起决定作用的CDC2激酶及细胞周期蛋白(cyclin
32、)等，在细胞凋亡中发挥作用的TCR/CD3通路、Fas-FasL、bcl-2、TRAIL及p53等的变化尚需做进一步深入的研究。细菌DNA或CpG ODN对各种免疫细胞亚群具有免疫调节作用，诱导多种细胞因子的分泌，包括IL-6和IFN-，这些免疫效果对于增强肿瘤抗原的免疫原性非常有效，可在肿瘤的免疫治疗研究中作为有效的免疫治疗增强剂。大量研究证实，CpG ODN是目前较强的诱导机体Th1型免疫作用的佐剂3,6,13;作为疫苗佐剂CpG ODN与其他佐剂相比有许多优点：(1)无免疫原性，不会导致自身免疫反应;(2)易于合成，且相当经济、极其稳定，半衰期长达几年;(3)安全性高，能与各种疫苗一起配
33、制;(4)能通过任何途径给药等。因此CpG ODN是一种非常有效和良好耐受可广泛使用的疫苗佐剂，特别是对于某些需要调动人体细胞介导的免疫和Th1型免疫应答来防治如HIV、HBV以及过敏性疾病和肿瘤等疾病，CpG ODN显示出非常有效的免疫佐剂效应，是一种理想的DC激活剂。(本文图片见光盘)（晋升网（http:/）是目前国内收录中文最多最权威医学杂志、医学杂志；网罗和甄选海量优秀医学论文，提供免费全文阅读。网站可以实现文章内容的全文检索，可以提供医学论文的免费查询、阅读、下载以及提供最及时的医学信息，最丰富的医学文献 ，最权威的期刊杂志，最有效的学习方法）。【参考文献】1Benwell RK，L
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