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1、CpG-containing 寡聚脱氧核苷酸对新化疗药物Coramsine的抗肿瘤增强效应概述Coramsine（即龙葵总碱）是一种从Solanum linnaeanum（devils apple）中提取出来的新的化疗药物临床上主要用于治疗皮肤肿瘤本实验通过研究Coramsine对恶性间皮细胞瘤的小鼠模型的体内抗肿瘤效应来探讨Coramsine更广泛的临床应用前景研究发现Coramsine全身用药可以延缓肿瘤生长和延长小鼠生存期并且当Coramsine与ODNs 联用时,未甲基化的ODNs作为先天免疫系统的激活物可以增强Coramsine的抗肿瘤效应.两药联用更为有效的延缓了肿瘤的生长和提供生
2、存获益. Coramsine 可能是通过直接裂解细胞的方式来杀死肿瘤细胞.我们用两种不同的方法来检测凋亡(caspase 激活和DNA断裂),没有发现Coramsine诱导任何形式的程序化细胞死亡的证据.实验发现, 由ODNs 增强的Coramsine的抗肿瘤效应表明Coramsine介导的细胞死亡是一种与免疫学无关的事件。关键词化学治疗, CpG寡聚脱氧核苷酸,免疫治疗, 恶性间皮细胞瘤(J Immunother 2006;29:134-142) 细胞毒性化疗仍然是大部分实体肿瘤治疗的最好选择.然而,并非所有肿瘤都对此有效.单一模式的药物化疗已经很难治愈肿瘤,部分原因是目前的单药治疗容易导致
3、肿瘤细胞产生耐药性.因此有必要探索新的化疗药物用于以后的化疗或与其他治疗方式的联用上.一般情况下我们通过以下两种思路寻找药物。一是新药物能够特异性的干扰象细胞繁殖这样的生化途径，如抗代谢药物吉西他滨.二是,新药物中的有效成分可以在天然复合物中被发现和提取出来，如红豆杉、紫杉酚类的药物。 Daunter 和 Cham在20世纪90年代发现在澳大利亚昆士兰地区的一种叫做Solanum linnaeanum （即龙葵）的植物可以有效的延缓牲畜皮肤癌的发展在此基础上提出了几种具有细胞毒作用的甾体生物碱苷类成分。混合物中的两种活性生物碱成分澳洲茄碱和澳洲茄边碱共享一个各种三糖碳水化合物附着的甾体配基。随
4、后人们把这两种复合物用来治疗表浅的皮肤疾病如角化病、基底细胞癌、和鳞状细胞癌，并把它推向市场。澳洲茄碱和澳洲茄边碱的混合物最初被称为SBP002现在被命名为Coramsine，体外细胞实验发现它有更宽的抗癌谱说明其可能有更广的应用范围。最初人们提出龙葵总碱的细胞毒作用是直接裂解细胞。现在也有观点认为诱导凋亡也是这些生物碱类的细胞毒作用机制。但在我们实验当中，尚未发现支持龙葵总碱诱导凋亡的证据。我们在恶性间皮细胞瘤的小鼠模型上进一步研究了Coramsine对实体肿瘤的疗效。实验证明Coramsine全身用药可以减缓肿瘤生长和提供适度的生存获益。Coramsine 目前正在由Australia S
5、pecial Access Scheme机构进行临床实验评估。这是一个对未上市药品有选择性的对病人进行临床实验的机构。近年来，肿瘤化疗逐渐与免疫治疗相结合。我们先前的实验证明抗代谢药物吉西他滨作用于恶性间皮细胞瘤小鼠模型，可以通过凋亡促进肿瘤细胞死亡并增加了淋巴灌注区（DLNs）肿瘤抗原的表达。吉西他滨联合对抗抗-CD40的FGK-45抗体激活树状突细胞上的CD-40的免疫辅助的治疗方式对肿瘤有很高的治愈率。目前化疗和免疫结合的综合治疗已经越来越多样化。比较有前景的免疫治疗方法是通过免疫治疗来激活机体的先天免疫系统。这种治疗方式本质上与CD-40的激活是不同的，后者实际上是一种后天获得性免疫治
6、疗。(postlicensing therapy)，如淋巴灌注区启动事件后的T淋巴细胞的激活。而先天免疫系统的激活会反过来增强启动事件 。先天免疫系统可以被脂多糖（LPS）、鞭毛素、双链RNA、和未甲基化的含有CpG 结构的寡聚脱氧核苷酸等不同的微生物结构所激活，机制主要与病原体的分子结构有关。细胞上的受体如TLRs识别这些结构并激活先天免疫反应。在临床前期实验中，我们发现几种TLR配体尤其是双链RNA以及与之具有相似药代动力学的多聚次黄嘌呤核苷酸和含有CpG 结构的寡聚脱氧核苷酸具有抗肿瘤活性并且在与其他治疗方式联用时具有协同作用我们发现Coramsine对免疫系统有轻微毒性，因此我们研究了
7、其与不同的免疫刺激治疗（如激活CD40或多聚次黄嘌呤核苷酸和含有CpG 结构的寡聚脱氧核苷酸等TLR配体治疗）相结合时的治疗获益 。结果发现Coramsine与CpG-ODNs联用可以降低肿瘤生长速度而与FGK-45联用时没有协同作用。材料和方法：1 细胞培养和试剂鼠AB1-HA恶性间皮细胞瘤细胞株贴壁培养在DMEM中，DMEM由20mM羟乙基哌嗪乙磺酸，0.05mM 2-巯基乙醇，100u/mL 青霉素(CSL，Melbourne,Australia），50ug/mL 庆大霉素，(David Bull Labs,Warwick,UK)，和5%的胎牛血清配制而成。AB1-HA恶性间皮细胞来源于
8、AB1恶性间皮细胞。AB1细胞是由经石棉诱导的恶性间皮细胞瘤的BALB/C小鼠身上得到的。AB1-HA细胞正常条件下可以逃避免疫监视。AB1和AB1-HA属于高度同源基因。SBP002(Coramsine)由Solbec Pharmaceuticals公司提供（Perth,Western Australia）。消毒蒸馏水稀释Coramsine至200ug/ml，用3%冰醋酸过滤法消毒。进一步稀释时均用消毒的一次性蒸馏水。吉西他滨(美国印第安纳波利斯礼来公司生产）由Sir Charles Gairdner医院药房提供。将吉西他滨用消毒蒸馏水稀释成1ug/ml的原液备用，使用时用消毒蒸馏水稀释。其
9、他材料均购于Sigma公司（Castle Hill,New South Wales,Australia）。2实验鼠，肿瘤的体内生长和化学治疗BALB/C(H-2d)小鼠由澳洲西部的佩思动物实验中心提供，养殖于标准条件下。AB1-HA细胞1*106个皮下接种于实验鼠的一侧下腹部。大约10-12天后当肿瘤直径可扪及约1-2mm 大小时开始用药（day0）。实验组小鼠腹膜内注射含有不同剂量Coramsine 的溶液200 uL。用生理盐水稀释的乙酸相应的处理对照组。Coramsine用药期间用双脚规每周3次测量肿瘤大小。当肿瘤大小达到100mm2时，处死小鼠。3免疫治疗和TLR配体治疗活化的抗CD-
10、40 FGK45抗体实验组小鼠6天内分3次静脉注射（day4,6,和day9）含有FGK45 100ug（由Antonius Rolink博士赠送）的PBS100uL。在TLR配体治疗中，当肿瘤可扪及时（day0），分别瘤内注射含有10ug的poly I/C（Invivogen,CA），洛索立宾 (Invivogen),CpG1668(5-TCCATGACGTTCCTGATGCT-3),或非GpG操纵的GpG1720（5-TCCATGAGCTTCCTGATGCT-3）（德国柏林，TIB-MOLBIOL）生理盐水50uL。每隔3天重复一次，用药至day15。4淋巴细胞及其亚群的细胞数目分析当肿瘤
11、可扪及时（day0），Coramsine处理AB1-HA细胞荷瘤小鼠（14mg/kg）。生理盐水稀释的乙酸相应的处理对照组小鼠（14mg/kg）。在day0，1，2，7，8，9，14，15时向荷瘤小鼠体内腹膜内注射含有Coramsine的溶液300uL，并在day3，10，17时分批处死小鼠。分别收集小鼠脾脏、肿瘤灌注区淋巴结和对侧淋巴结，制成细胞悬液，并用抗CD3和抗B-220单克隆抗体荧光标记细胞。将细胞置于FACScalibur流式细胞仪检测和CellQuest and FlowJo软件分析结果。通过上述淋巴器官细胞悬液序列稀释，苔盘兰染色（Sigma）和血细胞仪记数器计算出细胞总数。5
12、 荧光激活细胞分类器和终端脱氧核苷酸转移酶末端标记脱氧尿苷三磷酸盐（TUNEL）分析细胞凋亡和细胞坏死. ApoStat异硫氰酸荧光素(R&D, 美国明尼苏达州)检测Caspase途径诱导的凋亡.六孔板接种AB1-HA细胞，每孔2*105个，置于标准条件下（37，5%CO2）培养过夜。吉西他滨或Coramsine 稀释液加入六孔板中继续培养细胞。收集细胞前，六孔板中每孔添加10uL，50ug/mL的ApoStat继续培养半小时。然后收集细胞，PBS洗涤，用400uLPBS 重悬细胞。滴加5uL PI（propidium iodine）至细胞悬液，搁置20分钟后，流式细胞仪检测结果。通过终端脱氧
13、核苷酸转移酶末端标记脱氧尿苷三磷酸盐方法（TUNEL）检测Coramsine用药后的细胞凋亡表现。六孔板接种AB1-HA细胞，每孔1*106个，Coramsine致死剂量组和亚致死剂量组作用不同时段后，收集100uL细胞悬液用细胞离心涂片器旋转制作载波片， 95%乙醇固定10分钟。TUNEL法分析载波片上细胞核DNA断裂情况。6 免疫组化笔者用免疫组化TUNEL法对肿瘤组织内淋巴细胞记数。AB1-HA 细胞1*106个皮下接种于小鼠侧腹部，每隔两天观察肿瘤在鼠体内生长情况，待肿瘤可触及时做为day0。实验组和对照组分别在day0，1，2，7，8，9，14，15时向荷瘤小鼠腹膜内注射300uLC
14、oramsine（14mg/kg）溶液和生理盐水稀释的乙酸（14mg/kg）并在day3，10，17时分批处死小鼠。将肿瘤从小鼠体内完整取出做组织学切片，层厚约9um。切片用抗CD4，CD8，和B220单克隆抗体染色。用F4-80单克隆抗体检测小噬细胞microphages。TUNEL法分析肿瘤细胞在鼠体内的凋亡情况。7 统计学分析T检验分析不同组别间的数据差异。P16mg/kg,每天一次， 该药有很高比例的死亡率。由此结果本实验始终采用用药3天中断4天(3days on-4days off)和用药剂量16mg/kg的治疗方案。当AB1-HA肿瘤可触及时, 经小鼠(n=5)腹膜内注射Coram
15、sine(12mg/kg) ,观察其抗肿瘤效应。结果显示用药3天中断4天的时间方案在治疗前两周可以显著延缓肿瘤生长。 (P=0.0027;图1A)。当Coramsine剂量提高到14mg/kg时,重复上述实验,P=0.0008.此剂量不仅可显著延缓肿瘤生长而且在治疗后15天还观察到肿瘤体积的缩小(图1A)。当用药停止后,肿瘤恢复生长。但在14mg/kg剂量组荷瘤小鼠的生存时间显著延长（P=0.047）。所有荷瘤小鼠最终都因为肿瘤死亡。 图1：Coramsine腹膜内注射延缓了肿瘤生长。当AB1-HA肿瘤可触及时，以用药3天间隔4天的时间方案往BALB/c荷瘤小鼠腹膜内注射不同剂量的Corams
16、ine（12mg/kg或14mg/kg，每个剂量组n=5），。A，可见治疗方案。盲法进行实验。实验组和对照组的肿瘤生长速率（A）和生存曲线（B）如图所示。2 Coramsine对免疫系统的影响因为许多化疗药物都会对免疫系统产生影响,使淋巴细胞记数降低。本实验在小鼠模型上观察Coramsine是否会诱导淋巴细胞记数降低。Coramsine经腹膜内注射入荷瘤小鼠(n=5,14mg/kg)后,分别于治疗开始后第3,10,17天收集脾脏,肿瘤淋巴灌注区,和对侧淋巴灌注区的淋巴细胞并记数。结果发现对照组荷瘤小鼠三个区域的淋巴记数在第3和10天时轻度降低,第10-17天时开始升高(图2A)。而实验组Cor
17、amsine用药能够导致免疫器官的淋巴细胞记数轻度降低。（图2A）。笔者进一步用荧光标记的抗CD3和B220抗体对Coramsine处理组的荷瘤小鼠免疫器官的B淋巴细胞和T淋巴细胞记数。结果显示Coramsine处理组的T淋巴细胞总数也相应的有略微降低，对侧淋巴灌注区更明显一些（图2B）。结果分析，Coramsine与其他的化疗药物相比如吉西他滨对免疫系统的影响是非常小的。笔者通过免疫组化方法观察CD4、CD8 T淋巴细胞，B细胞，和巨噬细胞表达，分析Coramsine抑瘤作用是直接抑制肿瘤细胞还是诱导免疫系统间接抑制肿瘤细胞（图3）。结果发现在整个治疗过程中，Coramsine并没有明显改变
18、肿瘤组织中CD4、CD8 T淋巴细胞，B细胞表达（图2C）。实验组和对照组肿瘤组织内主要的免疫细胞是巨噬细胞（图3）。即使实验组的肿瘤生长被Coramsine明显延缓时，两组的肿瘤组织内免疫细胞数量也没有明显差异，此实验结果说明Coramsine直接作用于肿瘤细胞。图2：Coramsine对免疫系统的影响。接种 AB1-HA细胞的小鼠（n=5）经腹膜内注射14mg/kg的Coramsine或生理盐水稀释的乙酸。A，示Coramsine组和vehicle组在day3，10和17天时脾脏，肿瘤灌注区淋巴结，对侧淋巴结细胞总数。B，治疗开始后，Coramsine组和vehicle组在day3，10和
19、17天时脾脏，肿瘤灌注区淋巴结，对侧淋巴结CD3+ T细胞的频率。C，治疗开始后，Coramsine组和vehicle组在day3，10和17天时脾脏，肿瘤灌注区淋巴结，对侧淋巴结B220+ B细胞的频率。图3：Coramsine治疗AB1-HA肿瘤对瘤内对淋巴细胞和巨噬细胞数目的影响。接种 AB1-HA细胞的小鼠（n=5）经腹膜内注射14mg/kg的Coramsine或生理盐水稀释的乙酸。治疗开始后在day3，10和17天收集肿瘤。图示day10天时的免疫组化染色。A，对照组CD4+细胞B ，实验组CD4+细胞C，对照组CD8+细胞D，实验组CD8+细胞E，对照组B细胞F，实验组B细胞。G，
20、对照组巨噬细胞。H，实验组巨噬细胞。阳性细胞染成褐色。3 在与CpG-containing寡聚脱氧核苷酸联用时，Coramsine的抑瘤作用增强因为Coramsine的在BALB/c荷瘤小鼠身上的抑瘤作用与免疫系统介导的抑瘤作用并没有明显联系并且Coramsine也不会像其他化疗药那样导致淋巴细胞降低，我们探讨在Coramsine用药时给予免疫治疗是否会增强其抑瘤作用。笔者实验室先前的研究发现，吉西他滨与抗原呈递细胞（directed 激活CD40）在作用于AB1-HA细胞时有很强的协同作用。在此，我们首先评价FGK-45抗CD40免疫治疗（FGK-45抗体静脉注射）配合Coramsine腹膜
21、内用药时的疗效。治疗方案大体如图4A。很明显，FGK-45单独使用时可以延缓肿瘤生长（图4A，P=0.011），与我们先前的研究一致。由图4B我们可以看到Coramsine的抑瘤作用在用药的前11天，效果是比较显著的（P=0.016）。但实验没有发现两者的协同作用。在肿瘤淋巴灌注区的启动事件后, FGK-45激活免疫反应， 但FGK-45并没有增强Coramsine的抑瘤作用。说明与吉西他滨相比，Coramsine诱导的肿瘤细胞死亡并非由于其可能激活免疫反应。我们利用脂多糖，双链RNA，胆碱磷酸甘油酯ODNs等相关病原体的炎性刺激能力启动树突状细胞成熟并激活免疫反应。假设这些TLR配体激活免疫
22、系统的信号有助于Coramsine在肿瘤治疗中的作用。本实验中将评价TLR-3(poly I/C),TLR-7(loxoribine),和TLR-9(CpG-containing ODNs)对Coramsine的协同作用。我们首先在预实验的肿瘤模型中评价TLR配体的作用。AB1-HA肿瘤细胞接种到小鼠（n=4）。当肿瘤可触及时（day0），开始用药，每隔3天瘤内注射poly I/C，loxoribine， CpG-containing ODNs，和non CpG-containing ODNs，空白对照组注射PBS。所有小鼠以用药3天中断4天的方案经腹膜内注射Coramsine（14mg/kg
23、）,监测肿瘤生长。治疗方案如图5A。引人注目的是，所有接受CpG- Coramsine方案的小鼠肿瘤生长明显延缓（p=0.019与PBS组比较，P=0.027与non-CpG组比较.）生存期明显延长(P=0.009与PBS组比较,P=0.009与non-CpG组比较). CpG- Coramsine方案治愈一例肿瘤(1/4).如图5B。相比之下在non CpG- Coramsin组(对照组),没有发现两者的协同抑瘤作用.(P=0.45,与PBS组比较，图5)。我们扩展预实验的数据范围,进一步寻找CpG- Coramsin协同作用的证据.AB1-HA细胞接种于小鼠体内(n=10), Corams
24、ine结合CpG或non CpG处理小鼠，如图6所示。当Coramsine联用CpG时, CpG可以增强Coramsine在延缓肿瘤生长和延长小鼠生存时间方面的作用.两者联用效果明显优于CpG单药组 (p=0.023), Coramsine+non CpG对照组(p=0.0024)和PBS组(p=0.019). CpG单独用药时也可以明显延缓肿瘤生长 (p=0.015,与non CpG组比较) 。Coramsine联用CpG时可以显著的延长荷瘤小鼠的生存时间, 与空白对照组(p=0.0015)和Coramsine+non-CpG组(p=0.0018)比较具有显著性差异(如图6B)。 但是CpG
25、- Coramsin组的小鼠中位生存期为29天, CpG单独用药组为21天,两组差异显著(p=0.01)。图4：快速筛选不同的TLRs配体对肿瘤生长速率（a）和生存曲线（b）的影响。各种不同的TLRs配体（三天一次）结合Coramsine治疗（用药3天间隔4天）。治疗方案如图a。盲法实验。图5，Coramsine结合CpG ODN用药可以使治疗获益明显增加。Coramsine和CpG ODN的协同作用对肿瘤生长速率（a）和生存曲线（b）的影响。Coramsine（用药3天间隔4天）结合CpG ODN或non-CpG（三天一次）作用荷瘤小鼠（n=10）。治疗方案如图a。盲法实验。讨论 本实验首次
26、通过动物实验阐述了澳洲茄碱和澳洲茄边碱的生物碱苷类混合物全身用药在诘抗实体肿瘤方面的效应。我们通过小鼠恶性间皮细胞瘤模型评估了这两种生物碱苷类混合物（已命名为Coramsine）的抗肿瘤作用。实验证明Coramsine全身用药可以延缓肿瘤生长并延长小鼠生存期。但所有小鼠最终都死于肿瘤说明其没有使小鼠生存获益。与其他化疗药物相比，Coramsine对免疫系统的影响较小。Coramsine治疗过程中，并没有淋巴器官中淋巴细胞记数的减少也没有淋巴细胞进入肿瘤组织内。 Coramsine的抑瘤作用可以被CpG ODNs增强。虽然实验证明Coramsine和CpG ODNs的协同作用是明确的但我们目前的
27、数据在机制方面证明两者的协同作用尚显不足。Coramsine和CpG ODNs联合用药与他们单独用药相比可以显著延缓肿瘤的生长。相反，当Coramsine联合CD40的激活因子FGK-45单克隆抗体用药时，却没有发现两者的协同作用。Coramsine与后天获得性免疫治疗（postlicensing ？）缺少协同作用的证据说明Coramsine诱导的细胞死亡是一个免疫沉默事件。如果Coramsine介导的细胞死亡是一个免疫激活事件，在我们先前对吉西他滨的实验当中会发现APC对Coramsine治疗的增强作用。事实恰恰相反。事实上，Coramsine的抑瘤作用可以被CpG增强与上述观点是一致的。如
28、果Coramsine诱导的肿瘤细胞死亡伴随着很强的免疫激活信号（如CpG ODNs），肿瘤局部环境可由免疫沉默转变成炎性环境。FGK-45可以增强Coramsine-CpG联用时的疗效预示上述结论的正确性。我们的数据验证了上述事实。（R.G Van der Most,R.Himbeck,and R.A.Lake,数据尚未公布。我们的原始数据表明：coramsine引起的免疫休眠期细胞的死亡与暴露于coramsin间皮细胞瘤细胞产生白介素6减少有关，而吉西他滨能够诱导白介素6产生。因为TLRs结合到树突状细胞可以激发白介素6的分泌，促使CD8 T-cell 耐受性降低。（facilitate t
29、he reversal of CD8 T-Cell tolerance）IL-6可能是coramsine介导的细胞死亡所需要的因子，这解释了免疫沉默事件和与CpG之间的协同作用，吉西他滨介导的细胞死亡过程会产生IL-6，因此它更独立于TLRs诱导的细胞因子的产生。coramsine里的生物碱类成分可能以一种独特的方式杀死细胞。 因为大多数化疗药物是通过凋亡来诱导细胞死亡，而coramsine可能是立即裂解细胞或诱导细胞原发性坏死来使细胞死亡的。两种不同的方法都没有发现coramsine引起细胞凋亡的证据。LETHAL LYSED相反致死剂量的coramsine可以在数分钟内裂解细胞。这些作用机
30、制与声称生物碱苷类破坏细胞膜的说法是一致的。从这一角度讲，coramsine可能与最近研究较多的一种从euphoria peplus 中提取的化疗药物，3-ingenyl angelate PEP005相似。PEP005导致细胞死亡可能通过破坏血浆中细胞膜，诱导细胞在随后一个小时内坏死。因为我们的数据表明coramsine诱导的细胞死亡是免疫沉默事件而吉西他滨诱导的细胞死亡是免疫激活事件。PEP005如何与免疫系统相互作用激起了我们的兴趣。我们观察到原发性细胞坏死的免疫休眠与以往凋亡是由一个免疫沉默或免疫耐受的过程观点相冲突，它把细胞坏死作为启动事件。但它与最近的一个研究阐述的观点相符，该研究
31、认为凋亡而不是坏死的肿瘤细胞的产物，会激活免疫应答。很显然，免疫学结果并不仅仅由细胞死亡的机制决定还有一些因素例如激活TLR。总之，coramsine和CPG联合应用于小鼠间皮瘤模型时两者的作用都得到增强，coramsine化疗时的抑瘤作用因其剂量提高时所产生的毒性而受到限制。但仍有发展的空间。 coramsine-CPG联合治疗有进行临床实验可行性。目前coramsine对间皮瘤及黑色素瘤的疗效研究正在进行临床实验。同样，临床实验已经评估了CPG ODNs的疗效。假设coramsine以相似的方式杀死鼠和人体内的间皮瘤(S.Aarosn and R.A.Lake,结果未发布)并且CpG单药治疗时安全的，在临床实验中评价 coramsine-CPG联合治疗的协同作用是有保证的。参考文献：略