ESRl IVS1-401 位点rSNP 的鉴定及其在慢性HBV 相关肝病中的意义.doc

《ESRl IVS1-401 位点rSNP 的鉴定及其在慢性HBV 相关肝病中的意义.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《ESRl IVS1-401 位点rSNP 的鉴定及其在慢性HBV 相关肝病中的意义.doc（13页珍藏版）》请在三一文库上搜索。

1、ESR1 IVS1 - 401位点rSNP的鉴定及其在慢性HBV相关肝病中的意义晏泽辉 邓国宏 谭文婷 但芸婕 陈文 汤影子 周霞 王小红 毛青 王宇明*第三军医大学西南医院全军感染病研究所 400038 重庆*通讯作者：王宇明教授, Email： , 电话：023-68754858背景：我们前期在群体水平和流行病学角度证实了ESR1基因外显子1 T29C多态性与慢性HBV感染及慢性HBV感染相关肝病存在显著遗传关联，且T29C杂合子个体的ESR1 mRNA转录本中，两种等位的表达存在差异。但阳性关联的T29C位点为同义SNP位点，其本身不具有功能意义。可能存在与外显子1 T29C位点连锁不平

2、衡的调控区SNP（rSNP）位点，连锁不平衡分析和生物信息提示，ESR1内含子1（IVS1） T-401位点与外显子1 T29C强烈连锁且存在核蛋白结合位点。鉴定此ESR1 IVS1 T-401位点rSNP的功能，对揭示ESR1基因多态性在慢性HBV感染相关肝病中的作用具有积极意义。方法：在我们收集的359名HBV感染相关急性肝衰竭(HBV-ALF)患者，464名HBV感染相关肝硬化(HBV-LC)患者和469例HBV感染无症状携带者(ASC)组成的基于医院的病例-对照人群中，采用限制性片断长度多态性 (PCR-RFLP)和直接测序法对ESR1位点基因3个SNP（IVS1 T-401/C, T

3、29C, A11940G）进行基因分型、连锁不平衡检测、单倍型分析和关联研究。综合采用荧光素酶报告基因试验、电泳移动漂移分析（EMSA）、单倍型等位特异性染色质免疫沉淀技术（HaploChIP）、位点特异性小RNA干扰（SiRNA）等手实验对阳性关联的ESR1 IVS1 -401T/C位点进行功能验证。结果：HBV感染相关ALF患者病例组和HBV感染相关LC患者病例组中IVS1 -401/C和29C的等位频率显著高于HBV感染无症状携带者疾病对照组 (HBV-ALF vs ASC：P = 3.710-4，HBV-LC vs ASC：P = 2.110-5)。经非条件逻辑回归校正年龄、性别等因素

4、后，在显性模式下，IVS1 T-401/C和T29C两个SNP位点与HBV相关急性肝衰竭以及HBV相关肝硬化显著关联。和IVS1 -401T/C或T/T基因型个体相比，IVS1 -401C/C基因型的个体对HBV相关急性肝衰竭以及HBV相关肝硬化易感性显著升高(显性模式；HBV-ALF vs ASC：OR = 1.79, 95% CI = 1.54-2.12, P = 0.000；HBV-LC vs ASC：OR = 2.07, 95% CI = 1.47-2.92, P = 0.000) 。功能实验在多个角度证实了与T29C位点连锁的IVS1 T-401C位点的可以通过结合核蛋白C-myb而

5、发挥对ESR1表达的顺式调控作用；并且IVS1 T-401C位点的两个等位对核蛋白C-myb的结合能力存在差异，-401C等位对核蛋白C-myb的结合能力更强，表现出更强的增强子活性。结论：中国人群中，ESR1 基因多态性（IVS1 T-401/C和T29C）两个SNP与慢性HBV感染者发生急性肝衰竭和关肝硬化的遗传易感性相关。IVS1 -401C等位可能通过影响了ESR1表达（mRNA和蛋白水平）而增加了HBV相关肝衰竭和肝硬化发病的危险因素。前言慢性HBV感染是遗传与环境因素相互作用的复杂疾病。近年来普遍认为宿主因素，尤其是宿主的遗传因素，在慢性HBV感染极其相关肝病的发病机制中起着极为关

6、键的作用2，影响HBV感染和疾病进程的许多阶段3。探讨慢性HBV感染相关肝病的宿主遗传特征，将为我们从另一角度认识慢性HBV感染相关肝病及发病机制提供新的线索，并为临床防治提供新的、合理的策略，而以生物学功能相关基因作为候选基因进行病例-对照关联研究，是当前对复杂疾病进行遗传易感性研究的主要策略。ESR1在慢性HBV感染相关肝病的发生、发展及生存预后中均有重要作用，但其转录和表达存在显著的个体差异。顺式调控位点等位变异的功能影响是当前人类基因组研究的重要内容。本课题组前期研究从群体水平和流行病学角度已经证实了ESR1基因外显子1 T29C多态性与慢性HBV感染及HBV感染相关肝细胞癌的遗传关联

7、。并且发现T29C杂合子个体的ESR1 mRNA转录本中，两种等位的表达存在差异，C等位的表达量显著高于T等位。但T29C位点为同义SNP位点(Ser/Ser)，其本身不具有功能意义。可能存在与外显子1 T29C位点连锁不平衡的调控区SNP(rSNP)位点。初步分析和前期实验提示与T29C高度连锁的内含子1 IVS1 -401T/C SNP位点是最可能影响转录调控的功能位点。鉴定IVS1 -401位点的顺式调控作用，观察C/T等位变异对ESR1启动子使用以及mRNA外显子缺失变异体产生的影响，对认识肝组织中ESR1表达调控个体差异的内在机制具有重要意义。本研究拟采用EMSA、荧光素酶报告基因试

8、验(DLRA)、等位特异性染色质免疫沉淀(HaploChIP)、位点特异性RNA干扰(SiRNA)等手段，证实IVS1 -401位点的等位特异性顺式调控作用，以期深入认识ESR1基因rSNP在慢性HBV感染疾病进程中的功能和作用。研究对象，材料和方法：（略）主要结果：一、ESR1基因SNPs与HBV相关肝病的关联分析(一) 研究对象的临床的人口学资料前期建立的慢性HBV感染肝病标本数据库中无亲缘关系的359名的HBV相关肝衰竭患者(HBV-ALF)、470名HBV相关肝硬化(HBV-LC)和469名无症状慢性HBV携带者(ASC)纳入本部分的研究。研究所用样本的简要社会人口学和临床资料见表2-

9、1。在我们收集的基于医院收集的病例-对照队列中，ASC对照组的男性比例(54.2%)显著低于HBV-LC组(83.0%; 2=100.6; P =0.000)和HBV-ALF组(84.4%; 2=76.1; P =0.000)；饮酒指数上ASC对照组与HBV-LC组(2=45.8; P =0.000)以及HBV-ALF组(2=28.9; P =0.000)差异显著，这可能与两组之间在性别分布上差异显著有关，因为在中国饮酒主要以男性为主；ASC对照组的年龄也显著低于HBV-ALF组(37.412.1 vs 41.0 12.6; P = 0.000)和HBV-LC组(37.412.1 vs 43.

10、011.82; P =0.000)；HBeAg 阳性率在ASC组与HBV-LC组(2=0.375; P =0.541)以及HBV-ALF组(2=1.819; P =0.177)均无明显差异。表2-7 病例对照人群的社会人口学和临床资料CharacteristicAsCHBV-LCHBV-ALF(n =469)(n =468)(n = 359)Gender, no. (%)Men254 (54.2)395 (84.4)298 (83.0)Women215 (45.8)73 (15.6)61(17.0)Age (years), mean (SD)37.412.143.311.841.1 12.7A

11、lcohol drinkers, no. (%) 82 (17.5)174(37.2)121 (33.7)HBsAgAll +All +All +Anti-HBs IgGAll -All -All -HBeAg positive, no (%)120(25.6)128(27.3)107(29.8)Anti-HBc IgGAll +All +All +TBil ( mol / L )13.5 4.3205.2 193.4321.1 166.1ALT ( IU / L )27.7 10.8284.0 426410.1 541.6注：“Drinker”定义为男性每周饮白酒40 g/week 或女性男

12、性每周饮白酒20 g/week； AsC,无症状携带者；HBV-LC，HBV相关肝硬化；HBV-ALF，HBV相关急性肝衰竭患者 (二) 病例及对照标本的ESR1 SNPs分型 采用PCR-RFLP对对所有样本IL-10基因的3个SNP位点进行分型。其中随即选取5%的样本进行直接测序以验证PCR-RFLP方法分型的准确性，结果与测序结果完全吻合(图2-1至图2-5)。图2-6 IVS1 T-401C位点PCR- Pvu II-RFLP分 图2-7 T29C位点的PCR- BamH I-RFLP分型图2-8 ESR1 A11940G位点的PCR- Alw26 I-RFLP分型图2-9 ESR1

13、IVS1-401T/C位点测序验证(三) ESR1基因3个SNP位点与HBV相关肝病的关联分析1. 分型结果的初步分析ESR1基因3个SNP位点在病例对照人群中分型结果显示(见表2-9)：ESR1 A11940G位点的基因型和等位频率在HBV感染ASC对照组和HBV相关ALF病例组(2=0.357; P =0.550)以及HBV相关LC病例组(2=1.439; P =0.230)之间均无明显差异；但是ESR1 IVS1 T-401C位点的基因型和等位频率在HBV感染ASC疾病对照组和HBV相关ALF病例组(2=5.04; P =0.0246)以及HBV相关LC病例组(2=13.06; P =3

14、.010-4)之间均差异显著；ESR1 T29C位点的基因型和等位频率在HBV感染ASC疾病对照组和HBV相关ALF病例组(2=7.22; P =0.0071)以及HBV相关LC病例组(2=20.69; P =5.410-6)之间均存在显著差异；HBV相关ALF组和LC组中-401C和29C 的等位频率显著高于HBV感染ASC对照组。与未携带有- T-401C和29C等位的个体相比，携带有-401C和29C等位的个体显著的增加了HBV相关ALF和LC易感性。表2-9 病例组和对照组ESR1基因型和等位基频率分布及差异显著性Genotype/alleleAsCHBV-ALFHBV-LC(n =

15、469)(n =359)(n = 464)pvuII siteT/T, no. (%)166 (35.4)109(30.4)120 (25.9)T/C, no. (%)242 (51.6)182(50.7)251 (54.1)C/C, no. (%)61 (13.0)68(18.9)93 (20.0)T allele, no. (%)574(61.2)400 (55.7)491 (52.9)C allele, no. (%)364 (38.8)318 (44.3)437 (47.1)P Value 0.02463.010-4T29C6.9T/T, no. (%)228 (48.6)143 (3

16、9.8)158 (34.1T/C, no. (%)188 (39.7)160 (44.7)225(48.5)C/C, no. (%)55 (11.7)56 (15.6)91 (17.4)T allele, no. (%)642 (68.4)446 (62.1)541 (58.3)C allele, no. (%)296 (31.6)272 (37.9)387 (41.7)P Value 0.00715.410-6A252966GA/A, no. (%)193 (42.9)135 (37.6)174 (37.5)A/G, no. (%)196 (43.6)184 (51.3)227 (48.9)

17、G/G, no. (%)61 (13.5)40 (11.1)63 (13.6)A allele, no. (%)582 (64.7)454 (63.2)575 (62.0)G allele, no. (%)318 (35.3)264 (36.8)353 (38.0)P Value 0.55000.2302注： AsC，无症状携带者；HBV-LC，HBV相关肝硬化；HBV-ALF，HBV相关急性肝衰竭患者；P值由22四格表c2 检验给出，AsC组为对照。2. 阳性关联位点的非条件logisitic回归分析和分层分析经非条件logistic回归校正年龄、性别、饮酒指数等因素后，在显性模式下，ESR

18、1 IVS1 T-401C和T29C两个SNP位点与HBV相关急性肝衰竭和肝硬化显著关联(见表2-10)。和-401T/C或T/T基因型个体相比，-401C/C基因型的个体对HBV相关ALF和LC的易感性显著升高(共显性模式：HBV-ALF，OR = 1.36, 95% CI = 1.09-1.70, P = 0.0061；HBV-LC，OR = 1.48, 95% CI = 1.12-1.83, P = 0.0004) 。和29T/C或29T/T基因型个体相比，29C/C基因型的个体对HBV相关ALF和LC的易感性显著升高(共显性模式：HBV-ALF，OR = 1.29, 95% CI =

19、1.05-1.61, P = 0.0160；HBV-LC，OR = 1.48, 95% CI = 1.52-1.87, P = 0.0001)。同时,我们对这两个位点进行了年龄(40岁和40岁)和性别分层分析，结果显示(见表2-11)：ESR1 IVS1 T-401C和T29C的等位频率分布没有年龄、性别差异，基因型分布在病例对照之间的差异仍然显著。表2-10 ESR1阳性关联位点与HBV相关肝病的非条件logisitic回归关联分析ESR1 IVS1 T-401CESR1 T29CALF vs AsC LC vs AsC ALF vs AsC LC vs AsC Dominant model

20、(TT+TC/CC)P value0.01130.01590.09870.0357OR (95% CI) 1.70(1.13-2.56)1.62(1.09-2.40)1.44(0.93-2.22)1.55(1.03-2.34)Recessive model(TT/TC+CC)P value0.04670.00120.02440.0000OR (95% CI) 1.37(1.01-1.88)1.66(1.22-2.67)1.41(1.05-1.89)1.83(1.38-2.46)Co-dominant model(TT/TC/CC)P value0.00610.00040.01600.0001O

21、R (95% CI) 1.36(1.09-1.70)1.48(1.19-1.83)1.29(1.05-1.61)1.52(1.24-1.87)注：AsC，无症状携带者；HBV-LC，HBV相关肝硬化；HBV-ALF，HBV相关急性肝衰竭患者； Dominant model, 显性模式；Recessive model，显性模式；Co-dominant model，共显性模式；P值采用非条件logisitic回归分析统计方法校正年龄、性别等因素的影响给出；OR(odds ratio)：相对风险度；CI(confidence intervals)95%的置信区间。表2-11 ESR1阳性关联位点与H

22、BV相关肝病的关联分层分析ESR1 IVS1 T-401CESR1 T29CAsCHBV-ALFHBV-LCAsCHBV-ALFHBV-LCMen only.n=254n=298n=392n=254n=298n=392TT98(38.5)94(31.5)101(25.7)120(47.2)120(40.3)136(34.7)TC129(50.7)149(50.0)206(52.6)108(42.5)132(44.3)186(47.4)CC27(10.6)55(18.5)85(21.7)26(10.3)46(15.4)70(17.9)T allele325(64.0)337(56.5)408(5

23、2.0)348(68.5)372(62.4)458(58.4)C allele183(36.0)259(43.5)376(48.0)160(31.5)224(37.6)326(41.6)P Value 0.0122.310-50.0342.610-4Women onlyn=215n=61n=72n=215n=61n=72TT68(31.6)15(24.6)19(26.4)108(50.3)23(37.7)22(30.6)TC114(53.0)34(55.7)45(62.5)79(36.7)29(47.5)39(54.2)CC33(15.4)12(19.7)8(11.1)28(13.0)9(14

24、.8)11(15.3)T allele250(58.1)64(52.5)83(57.6)295(68.6)75(61.5)83(57.6)C allele180(41.9)58(47.5)61(42.4)135(31.4)47(38.5)61(42.4)P Value 0.2630.9160.1390.016Age 40 yn=175n=166n=255n=175n=166n=255TT52(29.7)54(32.5)70(27.5)85(48.6)71(42.8)91(35.7)TC106(60.6)83()50.0129(50.6)72(41.1)74(44.6)120(47.1)CC17

25、(9.7)29(17.5)56(22.1)18(10.3)21(12.7)44(17.3)T allele210(60.0)191(57.5)269(52.7)242(69.1)216(65.1)302(59.2)C allele140(40.0)141(42.5)241(47.3)108(30.9)116(34.9)208(40.8)P Value 0.5120.0350.2570.003Age 40 yn=294n=193n=209n=294n=193n=209TT106(36.1)55(28.5)50(23.9)143(48.6)72(37.3)67(32.1)TC145(49.3)99

26、(51.3)122(58.4)115(39.1)86(44.6)105(50.2)CC43(14.6)39(20.2)37(17.7)36(12.3)35(18.1)37(17.7)T allele357(60.7)209(54.1)222(53.1)401(68.2)230(59.6)239(57.2)C allele231(39.3)177(45.9)196(46.9)187(31.8)156(40.4)179(42.8)P Value 0.0420.0160.0063.410-4注：AsC，无症状携带者；HBV-LC，HBV相关肝硬化；HBV-ALF，HBV相关急性肝衰竭患者；P值由22

27、四格表c2 检验给出，AsC组为对照。 3. ESR1基因启动子区3个SNP位点连锁不平衡检测通过LDA软件分析ESR1基因3个SNP位点连锁不平衡情况，得到如下结果：ESR1 T29C与IVS1 T-401C，D=0.734， r2 =0.4248，Q value=0.924；ESR1 T29C与A11940G，D=0.154， r2 =0.024，Q value=0.315；ESR1 IVS1 T-401C与A11940G， D=0.0999， r2 =0.0078，Q value=0.182；提示ESR1基因T29C与IVS1 T-401C位点存在强烈的连锁不平衡。4. ESR1基因启动

28、子区3个SNP位点单倍型分析及关联研究单倍型分析提示ESR1基因T29C与IVS1 T-401C两个SNP位点仅存在四种单倍型(29T-IVS1T、29T-IVS1 C、29C-IVS1 T、29C-IVS1C)。初步统计分析(见表2-12)表明：四种单倍型的单倍型频率在HBV无症状携带对照组和HBV相关ALF组(2=7.86; P =0.049)以及HBV相关LC组之间差异分布显著(2=21.75; P=7.3510-5)。分别以单倍型29T-IVS1或29C-IVS1C为标准，将HBV感染相关性急性肝衰竭患者病例组和HBV感染无症状携带对照组中单倍型29T-IVS1T和29C-IVS1C的

29、携带情况分别进行非条件logisitic回归分析，校正年龄、性别等因素后，在共显性模式下，单倍型29T-IVS1T以及29C-IVS1C与HBV相关急性肝衰竭显著关联(见表2-13)。和29T-IVS1T /-或-/-单倍型个体相比，29T-IVS1T /29T-IVS1T单倍型的个体对HBV相关LC(OR =1.52, 95% CI =1.24-1.88, P =0.0001)和(OR =1.35, 95% CI =1.10-1.67, P =0.0051)ALF易感性显著降低。和29C-IVS1C /-或-/-单倍型个体相比，29C-IVS1C /29C-IVS1C单倍型的个体对HBV相关

30、LC(OR =1.51, 95% CI =1.21-1.90, P =0.0003)和(OR =1.32, 95% CI =1.04-1.66, P =0.0187)ALF易感性显著增高。表2-12 ESR1基因单倍型与HBV相关肝病之间的关联分析HaplotypeAsCHBV-ALFHBV-LC2n=9382n=7182n=92829T-IVS1 T536(57.1)365(50.8)442(47.6)29T-IVS1 C108(11.5)82(11.5)100(10.8)29C-IVS1 T39(4.2)36(5.0)50(5.4)29C-IVS1C255(27.2)235(32.7)33

31、6(36.2)27.8621.75P Value 0.0489997.3510-5注：AsC，无症状携带者；HBV-LC，HBV相关肝硬化；HBV-ALF，HBV相关急性肝衰竭患者；P值由24列联表c2 检验给出表2-13 ESR1基因单倍型与HBV相关肝病之间的的非条件logisitic回归关联分析AsCHBV-ALFHBV-LC2n=9382n=7182n=92829T-IVS1T/29T-IVS1T(TT/TT)146(31.1)97(27.1)104(22.4)29T-IVS1T/-( TT/-)244(52.1)171(47.6)234(50.4)-/-79(16.8)91(25.3

32、)126(27.2)2 tests29.1218.02P Value 0.0104831.2310-4Dominant modelP Value0.00230.0009OR (95%CI)1.77(1.23-2.56)1.82(1.28-2.58)Recessive modelP Value0.10660.0014OR (95%CI)1.31(0.94-1.81)1.69(1.22-2.32)Co-dominant modelP Value0.00510.0001OR (95%CI)1.35(1.10-1.67)1.52(1.24-1.88)29C-IVS1C/29C-IVS1C (CC/CC

33、)37(7.9)33(9.2)48(10.4)29C-IVS1C/-(CC/-)181(38.6)169(47.1)240(51.7)-/-251(53.5)157(43.7)176(37.9)2 tests27.8222.84P Value 0.0200271.1010-5Dominant modelP Value0.01160.0000OR (95%CI)1.46(1.08-1.96)1.83(1.38-2.44)Recessive modelP Value0.38360.3758OR (95%CI)0.79(0.46-1.34)0.80(0.48-1.32)Co-dominant mod

34、elP Value0.01870.0003OR (95%CI)1.32(1.04-1.66)1.51(1.21-1.90)注：AsC，无症状携带者；HBV-LC，HBV相关肝硬化；HBV-ALF，HBV相关急性肝衰竭患者；“-” 表示其他非ATA单倍型；P值由23列联表c2 检验给出；Dominant model, 显性模式；Recessive model，显性模式；Co-dominant model，共显性模式；P值采用非条件logisitic回归分析统计方法校正年龄、性别等因素的影响给出；OR(odds ratio)：相对风险度；CI(confidence intervals)95%的置信

35、区间。二、ESR1 IVS1 - 401T/C位点的荧光素酶报告基因实验将构建好的pGL3-IVS1 -401 TT或CC的不同长度pGL3系列重组载体荧光素酶报告基因质粒单独转染或与c-myb表达质粒pcDNA-c-myb共转染HepG2细胞，转染24 h后分别测定期荧光素酶活性。Firefly荧光素酶(F值)与Renilla荧光素酶 (R值)比值为每孔荧光素酶比值，将每孔比值除pGL3-Promoter空质粒得到荧光素酶的相对活性。结果提示：在HepG2细胞中，这两种等位片断重组pGL3-Promoter载体荧光素酶活性较pGL3-Promoter空载体明显增强(p0.05)，-401C

36、pGL3-Promoter重组载体荧光素酶表达量显著高于-401T pGL3-Promoter重组载体(p0.05)，提示-到这个片断具有增强子功能。但不同等位片断启动子活性存在差异。结果发现IVS1 -401 C等位存在能显著提高pGL3-promoter的荧光素酶活性，IVS1 -401 C表明出增强子活性，且c-myb表达质粒共转染提高了IVS1 -401 C的增强子活性(图4-10，图4-11，图4-12，图4-13)。图4-10 pGL3-Promoter-IVS1 -40I T/C不同等位载体与pGL3-Promoter空载体的荧光素酶活性比较图4-11 pGL3-Promoter

37、-IVS1-401C /T 不同等位载体与pcDNA3-C-myb质粒共转染与pGL3Promoter空载体的荧光素酶活性比较图4-12 pGL3-Promoter-IVS1-401C /T 不同等位载体单独或共转染pcDNA3.0-C-myb与pGL3-Promoter空载体的荧光素酶活性比较图4-13 pGL3-Promoter-IVS1-401C等位载体单独或共转染pcDNA3.0-C-myb与pGL3-Promoter-IVS1-401T等位载体的荧光素酶活性比较三、ESR1 IVS1 - 401T/C位点的EMSA分析1. 交叉抑制EMSA我们所用的核蛋白来源于雌激素诱导2h的Hep

38、G2细胞。交叉抑制EMSA结果见图4-14，结果显示： ESR1 IVS1 -401C、-401T等位探针均可见有一条结合带(箭头所指)，C等位探针与核蛋白的结合能够被C、T两种冷探针所竞争抑制 (泳道3，5)，同样T等位探针与核蛋白的结合也分别被T、C冷探针竞争抑制(泳道7、9)，提示针对IVS1 -401C/T位点的两种等位特异性探针与核蛋白结合是特异的,且两种等位的所结合的核蛋白的种类相同。通过Quantity One分析，C、T等位探针与核蛋白的结合量存在差异，C等位与核蛋白结合量约为T等位的2.3倍。提示IVS1-401C/T的两种等位特异性探针对核蛋白的结合量存在差异，C等位的结合

39、能力强于T等位。图4-14 ESR1 IVS1-401C/T位点EMSA交叉抑制分析2. 超漂移EMSA为鉴定探针结合核蛋白是否为预测的C-myb，我们在结合体系中先加入C-myb单抗孵育，再加入标记探针，观察加C-myb单抗后是否会出现核蛋白-探针结合带的超漂移。结果显示(图4-15)： ESR1 IVS1-401C、-401T等位探针，均可见有一条结合带(Complex箭头所指)，-401C、-401T 等位探针与核蛋白的结合能够被相应的冷探针所竞争抑制，提示针对ESR1 IVS1-401C/T位点的两种等位特异性探针与核蛋白结合是特异的。泳道4、8分别为预先加入C-myb单抗孵育的IVS

40、1-401C、-401T等位探针，均可见有一条“核蛋白-探针”的结合带 (Complex箭头所指)和一条“C-myb单抗-核蛋白-探针”结合带的超漂移带(Shift Band箭头所指)。 通过Quantity One分析，C、T等位探针与核蛋白-抗体复合物(超漂移带)的结合量存在差异，C等位与核蛋白结合量约为T等位的2.5倍。提示ESR1 IVS1-401C/T的两种等位特异性探针与核蛋白C-myb均有结合(还存在与其他的核蛋白的结合)，但两种等位对核蛋白C-myb结合能力存在差异，C等位的结合能力强于T等位。图4-15 ESR1 IVS1-401C/T位点超漂移EMSA分析四、ESR1 IV

41、S1 - 401T/C位点等位特异性染色质免疫沉淀(HaploChIP)1. ChIP ESR1 IVS1 - 401位点T/C杂合的CBMC细胞(11例)经培养24 h后，用-雌二醇刺激和甲醛处理使结合在DNA上的转录因子交联，提取细胞核，分别采用RNA多聚酶H14 mAb和 c-myb单抗，对超声打断的核染色质片断进行ChIP(mock样本采用无关的Anti-T Antigen pAb101对照抗体)，然后采用针对IVS1 401位点的特异性PCR引物检测该区域是否有RNA多聚酶和(或)c-myb结合。免疫沉淀PCR定性检测结果表明，ESR1 IVS1 401T/C 位点附近(-672.-

42、至-38之间)无RNA多聚酶结合，但存在c-myb结合(图4-16)。图4-16 IVS1 401位点的特异性的ChIP定性结果检测2. c-myb等位特异性结合量的检测 c-myb单抗ChIP片段用MGB-TaqMan荧光定量PCR技术方法检测活体状态下IVS1 - 401位点T和C等位myb结合量的差异；两种等位特异性ChIP沉淀产物定量结果显示(图4-17)，11份杂合子细胞中， C等位的沉淀量显著高于T等位(C /A等位，平均比值为1.89)，提示活体状态下，细胞内ESR1 IVS1 - 401位点T和C等位对c-myb结合能力存在差异，C等位的结合量显著高于T等位。图4-17 11例

43、ESR1 IVS1-401T/C杂合子细胞的等位特异性ChIP鉴定结果五、ESR1 IVS1 - 401T/C位点等位特异性RNA干扰1等位特异性RNA干扰载体的构建 按照干扰靶序列合成回文DNA寡核苷酸(目标序列：IVS1 401TT干扰靶序列：5-tgtcccagctgttttatgc-3；IVS1 401CC干扰靶序列：5-tgtcccagccgttttatgc-3)，5端和3端分别引入BamH I和Hind III酶切位点，克隆至pRNAT-U6.1/Neo干扰载体。构建好的T和C两种等位特异性RNA干扰载体经过测序验证无误(图4-18)，可以用于后续的RNA干扰实验的细胞转染。图4-

44、18 ESR1 IVS1 - 401T/C位点等位特异性RNA干扰载体测序验证2等位特异性RNA干扰载体转染 利用脂质体2 000将构建好的ESR1 IVS1 - 401 T和C两种等位特异性RNA干扰载体分别转染ESR1表达阳性的IVS1 - 401CC和TC基因型的HepG2、 293细胞株，Skov3细胞株，G418筛选稳定转染的细胞。荧光显微镜下显示细胞转然后生长状态良好，荧光强度亮，可稳定表达pRNAT-U6.1/Neo干扰载体自带的绿色荧光蛋白(图4-19)，说明干扰效果理想。图4-19 三种不同基因型细胞的pRNAT-U6.1/Neo-IVS1干扰载体转染左图：HepG2细胞；中图： 293细胞；右图：Skov3细胞(荧光显微镜，200)3. mRNA转录水平检测等位特异性RNA干扰效果 采用Syber Green I 染料荧光定量PCR检测ESR1 mRNA与恒定表达的看家基因-action的mRNA的相对表达量，结果显示(图4-20)：在IVS1 - 401CC纯合的HepG2细胞株中，转染pRNAT/U6.1-CC干扰质粒的ESR1 mRNA 表达量降低了47%(p0.05)；在IVS1 401TC杂合的293细胞株中，转染pRNAT/U6.1-CC和TT干扰质粒的ESR1 mRNA 表达量分别降低了64%和31%，两者之间的干扰效率存在显著差异(