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1、中文论著摘要RNA干扰抑制FUBP1基因表达对人胃癌细胞系SGC7901生物学功能的影响南方医科大学 刘一柏目 的构建针对靶向基因FUBP1（far upstream element binding protein 1，FUBP1）的慢病毒载体LV-FUBP1-RNAi，转染胃癌SGC-7901细胞，探讨应用RNA干扰技术抑制FUBP1基因的表达对人胃癌细胞增殖、细胞迁移、细胞周期和凋亡等生物学功能的影响，初步评价FUBP1基因沉默在胃癌基因治疗中的应用价值。方 法构建三组不同RNA干扰序列的慢病毒载体LV-FUBP1-RNAi及阴性对照序列的慢病毒载体Negative-RNAi，通过慢病毒转
2、染预实验选择合适的感染复数分别转染胃癌细胞SGC7901后利用荧光定量逆转录-聚合酶链反应(QRT-PCR)检测FUBP1在mRNA的表达水平，筛选出有效的RNA干扰序列用于后续实验。将实验分为FUBP1-RNAi组、Negative-RNAi阴性对照组（标记为NC）和空白对照组（标记为CON），应用QRT-PCR 及蛋白免疫印迹（Western blot）检测FUBP1在mRNA和蛋白质水平的表达量。应用CCK-8法检测各组细胞增殖、Transwell及划痕实验检测各组细胞迁移能力、流式细胞仪检测各组细胞周期分布情况及细胞凋亡。结 果成功构建了三组不同RNA干扰序列的慢病毒载体FUBP1-R
3、NAi-KD1、FUBP1-RNAi-KD2、FUBP1-RNAi-KD3；通过慢病毒转染预实验选择MOI=30的感染复数成功转染各组胃癌SGC7901细胞并筛选出有效的RNA干扰序列FUBP1-RNAi-KD2（相对于NC组FUBP1抑制效率高达70.4%）；QRT-PCR结果显示：相对于NC组，RNA干扰组（FUBP1-RNAi-KD2）FUBP1 mRNA的表达量明显下调，抑制率达70.4%（P0.05）；Western blot结果显示：相对于NC组，RNA干扰组FUBP1 蛋白质的表达量明显下调，抑制率达74.4%（P0.05）；CCK-8结果显示：相对于NC组和CON组，RNA干扰
4、组连续5天胃癌细胞增殖倍数降低（P0.05）；PI-FACS细胞周期检测结果显示：相对于NC组和CON组，RNA干扰组S期细胞比例明显升高（达60.74%，P0.05），G0/G1期和G2/M期细胞比例分别降低达30.48%（P0.05）、8.78%（P0.05）。结 论慢病毒载体FUBP1-RNAi-KD2介导的FUBP1基因沉默能够有效的抑制FUBP1在人胃癌SGC7901细胞系内mRNA和蛋白质水平的表达量；通过RNA干扰技术沉默FUBP1基因的表达能够抑制胃癌细胞SGC7901的增殖，影响细胞周期的分布，将细胞周期阻滞在S期，抑制细胞生长；但是对细胞凋亡及迁移能力无明显影响；通过RNA
5、干扰技术特异而有效的沉默FUBP1基因在胃癌的基因治疗中具有一定的价值。关键词RNA干扰；慢病毒转染；远端上游元件结合蛋白1；胃癌；基因治疗英文论著摘要The effect of RNA interference inhibiting FUBP1 gene expression on the biological function of human gastric cancer cell line SGC7901ObjectiveThis paper aimed to construct FUBP1-RNAi lentiviral vector to transfect into human
6、gastric cancer cell line SGC7901 and investigate the effect of inhibiting FUBP1 gene expression on the biological function of gastric cancer cell proliferation, metastasis, cell cycle and apoptosis. Through this study, we can evaluate the value of FUBP1 gene silencing in the treatment of gastric can
7、cer.MethodsTo design FUBP1-RNAi lentiviral vector with three different kinds of RNA interference sequences and Negative-RNAi lentiviral vector with negative control sequence. Then choice the reasonable MOI via preliminary experiment of lentiviral transfection to transfect into human gastric cancer S
8、GC7901. The quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (QRT-PCR) was used to detect the mRNA expression level of FUBP1 to select the effective RNA interference sequence which was used in the following experiment. We divide the experiment into three groups, which were FUBP1-RNA inte
9、rference group, Negative-RNAi control group and blank control group. The QRT-RCR and Western blotting were used to detect the mRNA and protein expression level of FUBP1. CCK-8 was used to detect cell proliferation of each group. Transwell and Scratch Test were used to detect the acticity of cell mig
10、ration. PI-FACS were used to detect Cell cycle distribution and apoptosis of each group.ResultsLentiviral vector with three different kinds of RNA interference sequences were successfully constructed, including FUBP1-RNAi-KD1, FUBP1-RNAi-KD2 and FUBP1-RNAi-KD3. Then choice MOI=30 via preliminary exp
11、eriment of lentiviral transfection to transfect into human gastric cancer SGC7901 and select FUBP1-RNAi-KD2 as the effective RNA interference sequence (inhibition rate of FUBP1 was up to 70.4% Which compared with Negative-RNAi group). Compared with Negative-RNAi group, RT-PCR and Western blotting re
12、sults showed that the mRNA and protein expression level of FUBP1 gene in FUBP1-RNAi-KD2 group were respectively reduced by 77.6%(P0.05) and 74.4%(P0.05). The CCK-8 test showed that gastric cancer cell proliferation fold in five days of FUBP1-RNAi-KD2 group were decreased (P0.05) Which compared with
13、negative control group and black control group. Flow cytometry results showed that the number of gastric cancer cell in S phase of FUBP1-RNAi-KD2 group was up to 60.74%(P0.05) Which compared with Negative-RNAi group and black control group, while the number of gastric cancer cell in G0/G1 phase and
14、G2/M phase were respectively decreased to 30.48%(P0.05) and 8.78%(P0.05).ConclusionsSilencing of FUBP1 gene via FUBP1-RNAi lentiviral vector can effectively suppress the mRNA and protein expression level of FUBP1 in gastric cancer cell SGC7901. Silencing of FUBP1 gene can effectively inhibit gastric
15、 cancer cell proliferation, affect distribution of cell cycle, arrest cell cycle in S phase to suppress cell growth.While there is on significant effect on apoptosis and migration. The specific and effective silencing of FUBP1 gene via RNA interference technique has a certain value in the gene thera
16、py of gastric cancer.Key wordsRNA interference; lentiviral transfection; FUBP1; gastric cancer; gene therapy 英文缩略语表英文缩写英文全称中文译名FUBPFar upstream element binding protein远端上游元件结合蛋白RNARibonucleic acid核糖核酸RNAiRNA interferenceRNA干扰dsRNADouble stranded RNA双链RNAsiRNAsmall interfering RNA小干扰RNARISCRNA indece
17、d silencing complexRNA诱导的沉默复合物FUSEFar upstream element远端上游元件TFIIHTranscription/repair factor IIH转录修复因子IIHFBSFetal bovine serum胎牛血清PBSPhosphate buffer saline磷酸盐缓冲液DMSODimethyl sulfoxide二甲基亚砜RT-PCRReverse transcription-polymerase chainreaction逆转录-聚合酶链反应WBWestern Blot免疫印迹法RnaseRibonuclease核糖核酸酶DEPCDiet
18、hypyrocarbonate焦炭酸二乙酯PAGEPolyacrylamide gel electrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳法SDSSodium dodecyl sulfonate十二烷基磺酸钠TBSTTris-Buffered Saline Tween-20缓冲液PVDFPolyvinylidene fluoride聚偏二氟乙烯ECLElectrochemiluminescence电化学发光MOIMultiplicity of infection感染复数ODOptical density光密度论文RNA干扰抑制FUBP1基因表达对人胃癌细胞系SGC7901生物学功能的影响前 言胃
19、癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，尤其是在发展中国家，具有恶性程度高、发展迅速、预后差等特征。在常见癌症中，胃癌的发病率居第四位，致死率居第三位 Ferlay J, Soerjomataram I, Dikshit R, et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. Int J Cancer. 2015, 136(5):359-386.。根据2012年全球癌症统计数据显示，胃癌的新发病例数接近100万，其中超过70万病例的患者发生死亡
20、，数据显示几乎一半以上的胃癌患者来自中国 Bray F, Ren JS, Masuyer E, et al. Global estimates of cancer prevalence for 27 sites in the adult population in 2008. Int J Cancer. 2013, 132(5):1133-1145.。随着早期胃癌诊疗技术和水平的不断发展提高，胃癌的发病率和死亡率都有所下降，但是进展期患者的预后仍然比较差，胃癌患者的五年生存率仍然比较低，而传统的治疗方法已不能满足胃癌发展的现状，因此，寻找胃癌基因治疗的方法成为目前研究的热题。RNA干扰是真核生
21、物体内一种基因沉默现象，具有高度的保守性和特异性。首先由Guo和Kemphues Guo S, Kemphues KJ. par-1, a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed. Cell. 1995, 81(4):611-620.等在1995年利用反义RNA抑制秀丽隐杆线虫基因表达的过程中发现并证实反义RNA和正义RNA均能有效抑制C.elegans par-1基因的表
22、达，但是这种现象产生的原因并未得到解释。随后，Fire等人在1988年通过研究发现dsRNA能够识别内源性mRNA的特异性序列，诱导mRNA的降解从而抑制特定基因的表达，并且比单链反义RNA或正义RNA抑制基因表达的作用更强，后来这种现象被称为RNA干扰(RNA interference, RNAi) Fire A, Xu S, Montgomery MK, et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 1998, 391(666
23、9):806-811.。RNA干扰机制可以简单的概括如下，由于外源性基因的入侵诱导体内细胞产生长双链RNA，这些长dsRNA在核酸内切酶Dicer作用下被分割成许多小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)，siRNA长约21-23个核苷酸片段，之后siRNA再与一些核酸酶复合物结合，形成RNA诱导的沉默复合物(RNA indeced silencing complex, RISC)，活化后的RISC能够与目的mRNA特异性结合，从而抑制目的基因的表达 Zamore PD, Tuschl T, Sharp PA, et al. RNAi: double-stran
24、ded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals. Cell. 2000, 101(1):25-33.。近几十年来随着分子生物学技术和遗传学的不断发展，人们逐渐认识到RNA干扰作为一种强大而有效的基因沉默技术能够特异性的抑制肿瘤相关致癌基因的表达而被广泛应用于胃癌的研究中。 远端上游元件结合蛋白(FUBPs)是由FUBP1、FUBP2和FUBP3三种调节蛋白所组成的DNA结合蛋白家族 Rydziel S, Delany AM, Canalis E. AU-rich elemen
25、ts in the collagenase 3 mRNA mediate stabilization of the transcript by cortisol in osteoblasts. J Biol Chem. 2004, 279(7):5397-404.，而c-myc作为原癌基因通过编码一种重要的转录因子家族参与细胞生长、增殖、分化及凋亡。1990年，Avigan Avigan MI, Strober B, Levens D. A far upstream element stimulates c-myc expression in undifferentiated leukemia
26、 cells. J Biol Chem. 1990, 265(30):18538-18545.等研究发现在未分化的白血病细胞内，FUBP1通过与远端上游元件FUSE结合调控c-myc基因的转录表达，首次证实FUBP1是一种DNA结合蛋白。随后一些研究表明，FUBP1在多种恶性肿瘤中呈表达上调，与c-myc基因的表达呈正相关，影响c-myc基因所介导的细胞生长、增殖、分化及凋亡，从而导致多种癌症的发生、发展 Liu J, Kouzine F, Nie Z, et al. The FUSE/FBP/FIR/TFIIH system is a molecular machine programmin
27、g a pulse of c-myc expression. EMBO J. 2006, 25(10):2119-2130.。本课题应用RNA干扰技术使FUBP1基因表达沉默，通过体外细胞实验观察FUBP1沉默后对人胃癌细胞系SGC7901生物学功能的影响，初步探讨RNA干扰技术在胃癌基因治疗中的应用价值。实验材料与方法一、实验材料（一）实验对象人胃腺癌细胞株SGC-7901（山东省肿瘤医院基础实验中心提供）（二）实验试剂与仪器1、细胞培养及转染（1）主要试剂与溶液 RPMI1640基础培养基 美国Gibco公司胎牛血清（FBS）美国Gibco公司磷酸盐缓冲液（PBS）北京鼎国昌盛生物技术有限
28、公司 青/链霉素混合液 美国Gibco公司 0.25%胰酶美国Gibco公司 二甲基亚砜（DMSO） shRNA慢病毒载体 Polybrene原液 感染增强液（Eni.S.）美国Gibco公司上海吉凯基因科技有限公司上海吉凯基因科技有限公司上海吉凯基因科技有限公司（2）主要试剂的配置15%RPMI1640完全培养基取1640培养基420ml，加入FBS 75ml，加入5ml双抗（青/链霉素混合液），置于4冰箱保存备用。细胞冻存液按照DMSO ：1640培养基：FBS的比例为1：7：2进行配制，冻存细胞时现用现配。Polybrene稀释液Polybrene原液（10mg/ml）用RPMI1640
29、基础培养基稀释200倍，至终浓度为50ug/ml，置于-20冰箱保存备用。（3）主要仪器设备级生物安全柜新加坡ESCO公司二氧化碳培养箱日本SANYO公司微量移液器 德国Eppendorff公司倒置显微镜倒置荧光显微镜日本Olympus公司日本Olympus公司BY-R18医用低速离心机BIO-RAD公司冷藏冷冻箱（4、-20）青岛海尔股份有限公司超低温冰箱（-80）日本SANYO公司电热恒温水槽细胞培养板细胞计数板山东潍坊精密医疗器械有限公司美国Costar公司美国Coster公司2、RT-PCR（1）主要溶液与试剂 Trizol试剂美国Invitrogen life technologie
30、sDEPC处理水（无RNase ）大连宝生物工程有限公司氯仿上海试剂一厂异丙醇 上海试剂一厂无水乙醇上海试剂一厂反转录试剂盒日本TaKaRa公司荧光定量PCR试剂盒日本TaKaRa公司PCR引物合成Thermo Fisher Scientific（2）主要试剂配制的方法75%乙醇：按照无水乙醇：DEPC处理水=3: 1的比例，置于常温保存备用。（3）主要设备仪器 微量反应管 美国Axygen公司微量移液器德国Eppendorff公司SIGMA 3K30超速冷冻离心机德国Sigma-Aldrich公司NANODROP 2000分光光度计Thermo Fisher ScientificMyCycl
31、er型PCR仪（BIOER）美国伯乐公司LightCycler480型PCR扩增仪德国Roche Diagnostics公司超低温冰箱（-80）日本SANYO公司3、Western blot（1）主要溶液与试剂兔抗人FUBP1单克隆抗体英国Abcam公司NP-40 lysis bufferBCA定量试剂盒5SDS-PAGE蛋白上样缓冲液美国Amresco公司碧云天生物研究所上海生工生物工程有限公司30%PAGE（聚丙烯酰胺）APS（过硫酸铵）TEMED（四甲基乙二胺）10TBST济南军区总医院检验科提供美国Amresco公司济南军区总医院检验科提供 北京索莱宝科技有限公司-actin美国Epi
32、tomics公司SDS1.0mol/L Tris（PH6.8）1.5mol/L Tris（PH8.8）德国Sigma公司济南军区总医院检验科提供济南军区总医院检验科提供蛋白质MarkerThermo Fisher ScientificPVDF膜ECL-PLUS试剂盒Millipore公司瑞典Amersham公司X线胶片显影粉上海冠龙照相材料厂医用X射线胶片中国Kodak公司（2）主要试剂配制的方法10% APS：0.1gAPS +1ml去离子水溶解，置于4保存备用。封闭液：2.5g脱脂奶粉+50ml 1TBST溶解，置于4保存备用。10ml 10%分离胶：去离子水4ml+30%PAGE 3.3
33、ml+1.5mol/L Tris（PH8.8） 2.5ml+10%SDS 100l+10%APS 100l +TEMED 4l，混匀备用。5ml 5%浓缩胶：去离子水3.4ml+30%PAGE 0.83ml+1.0mol/L Tris（PH6.8）0.63ml+ 10%SDS 50l+10%APS 50l+TEMED 5l，混匀备用。（3）主要仪器、设备5417R台式冷冻高速离心机德国Eppendorff公司SDS-PAGE蛋白电泳仪上海天能科技有限公司蛋白转膜仪上海天能科技有限公司电热恒温干燥箱山东省潍坊医疗器械厂脱色摇床兴化仪器厂显影仪美国Alpha Innotech 公司4、细胞功能学实
34、验 （1）主要溶液与试剂 CCK-8试剂德国Sigma公司PI（碘化丙啶）德国Sigma公司RNase AFementas公司凋亡试剂盒美国eBioscience公司Transwell试剂盒GIEMSA染色液美国Corning公司德国Sigma公司（2）主要仪器、设备酶标仪Thermo Fisher Scientific流式细胞仪划痕仪倒置显微镜倒置荧光显微镜Millipore公司VP scientific 日本Olympus公司日本Olympus公司二、实验方法（一）RNA干扰慢病毒载体的构建与包装针对靶基因FUBP1的RNA干扰慢病毒载体由上海吉凯基因科技有限公司协助设计、构建、包装及测序
35、。慢病毒载体名称为GV248，元件序列为hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin，设计的siRNA干扰序列如表1所示；设计的DNA oligo序列如表2所示；慢病毒滴度如表3所示：表1 FUBP1-RNAi 序列Virus NumberTarget SeqFUBP1-RNAi-KD1TGAGTATTATAGACAACAAFUBP1-RNAi-KD2 CGAAAGGATAGCACAAATAFUBP1-RNAi-KD3TGCTTATTACGCTCACTATNegative-RNAi TTCTCCGAACGTGTCACGT表2 DNA oligo 序列Virus N
36、umberDNA oligo 序列FUBP1-RNAi-KD1Sense：5-CcgggcTGAGTATTATAGACAACAACTCGAG TTGTTGTCTATAATACTCAGC TTTTTg-3 Anti：5- aattcaaaaa gcTGAGTATTATAGACAACAA CTCGAG TTGTTGTCTATAATACTCAGC TTTTTg-3FUBP1-RNAi-KD2Sense：5-CcggccCGAAAGGATAGCACAAATACTCGAG TATTTGTGCTATCCTTTCGGGTTTTTg-3 Anti：5- aattcaaaaa ccCGAAAGGATAGCACA
37、AATACTCGAG TATTTGTGCTATCCTTTCGGGTTTTTg-3FUBP1-RNAi-KD3Sense：5-CcgggcTGCTTATTACGCTCACTATCTCGAG ATAGTGAGCGTAATAAGCAGCTTTTTg-3 Anti：5- aattcaaaaa gcTGCTTATTACGCTCACTATCTCGAG ATAGTGAGCGTAATAAGCAGCTTTTTg-3Negative-RNAiSense：5-CcgggcTTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAG ACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTg-3 Anti：5- aattcaaaaa
38、gcTTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAG ACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTg-3表3 慢病毒滴度Virus Number滴度（TU/ml）FUBP1-RNAi-KD15E+8（5108）FUBP1-RNAi-KD23E+8（3108）FUBP1-RNAi-KD35E+8（5108）Negative-RNAi1E+9（1109） （二）细胞培养1、细胞复苏实验前30min将1640完全培养基从冰箱中拿出放置至室温备用。在液氮罐中取出冻存的胃癌SGC-7901细胞，迅速将冻存管放入水温37的水槽内并不断摇晃，之后将冻存管内完全融化的细胞悬液转移至离心管内，加入3ml完
39、全培养基，吹打混匀后放入低速离心机，1200rpm3min离心，将上清液用滴管吸弃后加入6ml完全培养基，吹打混匀后用滴管转移至培养瓶中，将培养瓶平放在实验台上画“8”字轻轻摇匀细胞悬液，静置1-2min后置于细胞培养箱（温度37，CO2浓度5%）中培养，隔天观察。2、细胞传代实验前30min将1640完全培养基、PBS、0.25%胰酶从冰箱中拿出放置至室温或者放入水温37的水槽内预热。取出融合度达到90%以上的胃癌SGC-7901细胞（已达到对数生长期），用滴管小心吸弃旧培养基，用3-5mlPBS冲洗2次，加入适量0.25%胰酶后放入培养箱内消化细胞约3min，当细胞皱缩呈漂浮状态时，加入适
40、量1640完全培养基终止消化，吹打后转移至离心管内，1200rpm3min离心，将上清液用滴管吸弃后加入适量完全培养基，吹打混匀制成细胞悬液，按1:3比例分别装入培养瓶中，将培养瓶平放在实验台上画“8”字轻轻摇匀细胞悬液，静置1-2min后置于细胞培养箱（温度37，CO2浓度5%）中培养，隔天观察。3、细胞冻存取出融合度达到90%以上的胃癌SGC-7901细胞（已达到对数生长期），按照细胞传代步骤制成单细胞悬液后移入15ml离心管内， 1200rpm3min离心，将上清液用滴管吸弃后加入事先配好的冻存液约2ml，吹打混匀，移入冻存管内，用封口膜封闭管口，放入细胞梯度冻存盒内，置于-80低温冰箱
41、内过夜，第二天转移至液氮罐中。 （三）慢病毒感染1、FUBP1-RNAi慢病毒感染胃癌SGC-7901细胞（1）慢病毒感染细胞前一天，将融合度达到90%以上的胃癌SGC-7901细胞按照细胞传代步骤制成单细胞悬液后移入15ml离心管内，吹打混匀，将细胞悬液接种于不同的细胞培养板（6孔、12孔、24孔、96孔）中，使细胞的融合度达到50%-60%左右，置于细胞培养箱（温度37，CO2浓度5%）中培养。（2）第二天进行慢病毒感染，根据合适的感染复数即MOI值，计算出不同孔板所需要的病毒用量和Polybrene稀释液用量，从培养箱中取出待转染的细胞，吸弃旧培养基，向各孔中加入相应的病毒用量和Poly
42、brene稀释液，轻轻混匀，放回细胞培养箱中继续培养。（3）感染16小时后，若细胞生长状态良好则更换为1640完全培养基，放回培养箱继续培养，感染72h后，用倒置荧光显微镜确定感染效率达到80%以上且细胞状态良好，拍照记录，再进行后续实验。 2、FUBP1-RNAi慢病毒感染预实验（1）根据设定的MOI值将预实验分成4组：MOI=0、MOI=20、MOI=30、MOI=40。（2）慢病毒感染前一天，将胃癌SGC-7901细胞接种于6孔板上（约2105个/孔），分组并标记，置于细胞培养箱（温度37，CO2浓度5%）中培养。（3）第二天利用Negative-RNAi慢病毒载体感染细胞，根据不同的M
43、OI值计算每组所需要的病毒用量和Polybrene稀释液用量，从培养箱中取出6孔板，吸弃旧培养基，每一组加入相应的病毒用量和Polybrene稀释液，轻轻混匀，放回培养箱中继续培养。（4）感染16小时后，更换为1640完全培养基，放回培养箱继续培养，感染72h后用倒置荧光显微镜观察不同MOI值细胞绿色荧光蛋白的表达情况，并用流式细胞仪方法检测含有绿色荧光蛋白细胞的百分比，计算不同MOI值条件下的感染效率，根据结果选择合理的MOI值用于后续实验。3、FUBP1-RNAi慢病毒载体有效靶点的筛选（1）根据siRNA干扰序列将实验分成5 组：FUBP1-RNAi-KD1组（标记为KD1）、FUBP1
44、-RNAi-KD2组（标记为KD2）、FUBP1-RNAi-KD3组（标记为KD3）、Negative-RNAi阴性对照组（标记为NC）和空白对照组（标记为CON），每组设置3个重复。（2）慢病毒感染前一天，将胃癌SGC-7901细胞接种于12孔板上（约1105个/孔），分组并标记，置于细胞培养箱（温度37，CO2浓度5%）中培养。（3）第二天进行慢病毒感染，将每组需要的慢病毒用RPMI1640完全培养基稀释滴度至1108TU/ml，设定MOI值=30（根据慢病毒感染预实验结果），从培养箱中取出12孔板，吸弃旧培养基，FUBP1-RNAi-KD1组、FUBP1-RNAi-KD2组、FUBP1-
45、RNAi-KD3组、Negative-RNAi组每孔分别加入30l相应的病毒用量、50l Polybrene稀释液、420l完全培养基，空白对照组只加入完全培养基，轻轻混匀，放回培养箱中继续培养。（4）感染16小时后，更换为1640完全培养基，放回培养箱继续培养，感染72h后确定感染效率达到80%以上且细胞状态良好，拍照记录。（5）收集每组细胞后提取总RNA，QRT-PCR检测每组胃癌细胞FUBP1 mRNA的表达情况，筛选出相对于NC组抑制效率最高的RNA干扰序列作为有效靶点，用于后续实验。（四）FUBP1 QRT-PCR实验步骤1、Trizol法细胞总RNA的提取（1）从培养箱中取出转染了72h后的6孔板细胞，吸弃旧培养基，每孔加入适量预冷的Trizol试剂（每10cm2加入约1ml），反复抽吸吹打，待细胞完全裂解后收集到1.5ml EP管中，室温孵育5min。（2）5min后，加入氯仿0.2ml，用手上下剧烈震荡15s，室温孵育10min，将EP管放入超速冷冻离心机中，4，12800rpm15min离心，离心后的样品分为三层，RNA存在于上层水相中。（3）小心吸取无色水相转移到一个新EP管中，加入0