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1、信号激酶AMPK通过组蛋白H2B的磷酸化作用来开启应激调控的转录过程 哺乳动物单磷酸腺苷-活化的蛋白激酶（AMPK）是一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶复合体，它是细胞内能量自稳机制的核心调控子。然而，在新陈代谢应激条件下，AMPK如何调控细胞的应答反应？这一机制仍不清楚。我们的研究发现，AMPK激活的转录过程直接关联于相应的染色质及其组蛋白H2B 36 位丝氨酸的磷酸化作用。AMPK的募集和H2B 36 位丝氨酸的磷酸化作用内共定位于依赖AMPK激活的基因，包括启动子区和转录区。通过对H2B异位表达，把 36 位丝氨酸替换成丙氨酸，结果显示在应激条件下，转录作用降低，RNA聚合酶与AMPK依赖型基因
2、结合变少，而且细胞表现出较低的生存率。我们的研究结果表明，AMPK依赖型的H2B Ser36磷酸化作用直接参与转录途径和染色质调控途径，从而使细胞面对应激压力表现出一定的适应性。信号传导途径通常会涉及到相关蛋白质的级联磷酸化反应，最后在核转录调控作用下结束。然而，这些通路过程的核心激酶并不是直接来调控转录过程。单磷酸腺苷-活化的蛋白激酶（AMPK）即是此类信号激酶的一种，当细胞处于能量胁迫情况下（如养分缺乏或者低氧胁迫），AMPK会被高浓度的底物-单磷酸腺苷所激活。AMPK的活化会开启一系列新陈代谢适应功能来维持细胞的能量体系（三磷酸腺苷的保存）和保持细胞的生存能力。我们研究了AMPK信号途径
3、中可能直接相关于转录过程的机制。首先，我们仔细研究了AMPK是否广泛地应答于细胞胁迫压力。我们将小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）进行了一系列的胁迫处理，如紫外线照射，射线照射，拓扑异构酶抑制剂喜树碱处理，可插入DNA的试剂阿霉素处理，烷化剂甲基硝基亚硝基胍或过氧化氢处理。结果发现，AMPK会被上述任意一种试剂所激活【AMPK活性环结构处的Thr172磷酸化及底物ACC(乙酰辅酶A-羧化酶-)磷酸化】（图1A）。LKB1是哺乳动物的三个上游AMPK激酶之一，在生物能的胁迫下它可以激活AMPK途径。当应答于遗传毒性胁迫（紫外线照射）或新陈代谢胁迫作用【糖降解抑制剂2-脱氧葡萄糖（2-DG）处理】，L
4、KB1同样也会激活AMPK途径。（补充部分S1）然后，我们利用野生型的MEFs以及AMPK1、AMPK2共缺失的MEFs（ampk-/-）来检验应激条件下AMPK是否会影响细胞生存能力。实验结果表明，在受到新陈代谢胁迫（图1B和补充部分S2）、紫外线照射（图1B）或者过氧化氢处理时，ampk-/- MEFs生存能力降低。这说明，当应答于各种新陈代谢胁迫及遗传毒性胁迫时，AMPK会提高细胞的生存能力。我们的早期研究涉及到AMPK和LKB1在肿瘤抑制物p53依赖型的代谢胁迫及遗传毒性胁迫应答。我们对p53应答基因转录调控过程中的AMPK参与者进行了研究。无论对ampk-/- MEFs进行脱葡萄糖处
5、理还是紫外线照射处理，其p21（一个特征明显的p53靶基因）的诱导表达量都表现出降低（图1C和补充部分S3）。特别是在葡萄糖调控的基因表达研究中，p21的表达降低率基本相似与敲除p53基因的效果（图1C）。其他p53依赖型基因，包括reprimo（TP53 dependent G2 arrest mediator candidate）、cyclinG（细胞周期蛋白G）、cpt1c（肉碱棕榈酰转移酶1C），在脱葡萄糖处理的ampk-/- MEFs中都有表达量降低的现象。但是，我们的对照基因gapdh（甘油醛-3-磷酸脱氢酶，house keeping基因），却没有受到影响（图1C和补充部分S4）
6、。我们在人类癌症细胞（HCT116结肠癌）中也观察到一个类似的胁迫依赖型转录缺陷（补充部分S5）。紫外线照射处理引发的细胞转录缺陷都是出现在DNA损伤修复位点下游调控，在lkb1 -/-、ampk-/-细胞系中Chk1，Rad17，p53的磷酸化作用与对照组野生型的表征相似（补充部分S6）。由此，在细胞培养过程中，LKB1-AMPK信号通路广泛响应于不同的新陈代谢胁迫和遗传毒性胁迫，并且是众多p53依赖型基因极端胁迫诱导表达所必需的，从而提高细胞的生存能力。图1. AMPK是应激依赖型转录所必需的，定位于应激应答基因上。（A）当MEFs受到紫外线照射，射线照射（IR），喜树碱（CPT）处理，阿
7、霉素（Adr）处理，甲基硝基亚硝基胍(MNNG)或过氧化氢(H2O2)处理后，细胞内AMPK的活化（AMPK pThr172）和ACC磷酸化（ACC pSer79）的Western blot。MEFs在UV、IR、CPT和Adr中暴露时间为6小时，在MNNG、H2O2中处理30分钟。NT，未经处理；Glc，葡萄糖。（B）野生型（WT）MEFs和ampk-/-MEFs在受到特定应激情况时所表现的生存性。左框：葡萄糖脱除胁迫；右框：紫外线照射处理。（C）野生型、AMPK缺失或p53 RNAi表达的MEFs在葡萄糖脱除胁迫后，相对于未处理细胞，p21，cpt1c和gapdh mRNA的表达情况（qP
8、CR）。（D）在lkb1 -/-MEFs经葡萄糖脱除胁迫后，WT或负显性（MUT）myc-AMPK与WT或无催化活力的(MUT)FLAG-LKB1共转染到处理的MEFs内进行ChIP观察到，都会被免疫共沉淀【见（A），补充部分S7】。Data represent meansSEM for n = 3。（E to G）在未处理（），2-DG(15min)，或UV（6h）MEFs中内源性AMPK2的ChIP结果（E）；野生型或ampk-/-MEFs（F）；野生型或p53-/-MEFs（G）。Data represent means SEM for n = 3. #P 0.06, *P 0.05,
9、*P 0.01, *P 0.03。这些结果还有前期的结果都说明AMPK参与基因的激活，尽管其中的机制仍不是很明确。我们采用染色质免疫共沉淀技术（ChIP）和定量聚合酶链式反应（qPCR）来探究在MEFs中AMPK是否直接作用于p53调控的基因。我们发现响应于紫外线照射时，LKB1与AMPK会共免疫沉淀，这一相互作用会依赖于AMPK激酶的活化（补充部分S7）。ChIP结果显示在响应于葡萄糖脱除胁迫和紫外线处理胁迫时，异位表达的myc-AMPK会作用于cpt1c和p21基因的启动子(图1D和补充部分S8)。异位表达的激酶缺失型myc-AMPK或FLAG-LKB1终止了AMPK与染色质的结合（图1D
10、和补充部分S8）。FLAG-LKB1也类似的相关联于p21启动子（补充部分S9）。在无胁迫情况下，细胞内与启动子结合的AMPK或LBK1相对较少（图1D和补充部分S8、S9）。紫外线处理后，在人类HCT116细胞内也可以观察到AMPK与p21启动子结合（补充部分S10）。这一AMPK的活化看来好像是特定于响应胁迫压力来求生存，因为并没有观察到AMPK与PUMA（一种依赖于p53的促凋亡基因）启动子的结合（补充部分S11）。免疫沉淀及染色质免疫沉淀结果表明这是一个功能上激酶依赖型的反应，LKB1和AMPK会关联于启动子。我们对内源性AMPK【使用AMPK2的抗体免疫沉淀获得的蛋白(补充部分S12
11、)】进行了染色质免疫共沉淀，发现当细胞被2-DG或紫外线处理后，会有更多的AMPK2结合在cpt1c上游p53位点（图1E；绑定于p21启动子的结果见补充部分S13）。而在ampk-/-细胞（图1F）和p53-/-细胞（图1G）中，这种特异性的结合相对减少。因此，当响应于细胞胁迫情形时，LKB1和AMPK会以相互依赖且依赖于p53的形式结合在染色体上来调控基因转录过程。核心组蛋白的翻译后修饰包括磷酸化，主要起到转录调控功能。为了验证组蛋白是AMPK的底物，我们通过抗原表位标记了占优势的核心同工型AMPK2和免疫沉淀的野生型AMPK2或者一种催化突变体（Asp157Ala）（来自于转染的ampk
12、-/-MEFs，通过低浓度葡萄糖诱导处理后激活了AMPK）。通过对催化突变体和模拟免疫沉淀的对比观察排除了四种组蛋白的非特异性背景干扰，我们发现野生型的AMPK2复合体能够特异性的磷酸化组蛋白H2B（图2A）。来自未处理细胞的AMPK2表现出的H2B活力比胁迫处理过的AMPK2相对较低（图2B和补充部分S15）。H2A在这些分析过程也会磷酸化，然而，在模拟免疫沉淀中也会观察到磷酸化H2A且不会对胁迫响应，说明这一活力并非特异性的。这些数据表明活化的AMPK2会特异性的磷酸化H2B。对组蛋白H2B的分析结果显示AMPK的潜在靶点模体在N端的36位丝氨酸，这类似于AMPK的其他底物内皮型-氧化氮合
13、成酶（eNOS）和磷酸果糖激酶2（PFK2），（H2B,Arg-Ser-Arg-Lys-Glu-Ser;eNOS,Arg-Ile-Arg-Thr-Gln-Ser;PFK2,Arg-Met-Arg-Arg-Asn-Ser）具有保守性的P-5 Arg 残基和P-3相关联的磷酸基团接受子Ser36（补充部分S14）。因此，我们比对了H2B 1到20或21到42号残基构成的肽段，只有H2B 21到42号残基构成的肽段会被免疫沉淀的AMPK2磷酸化。然而，S36A突变体H2B 21到42号残基构成的肽段没有发生磷酸化，S32A和S38A突变体H2B肽段发生了磷酸化（图2C）。而且，myc- AMPK2对
14、H2B 21到42号残基肽段的磷酸化作用比对腺苷甲硫氨酸合成酶肽段（His-Met-Arg-Ser-Ala-Met-Ser-Gly-Leu-His-Leu-Val-Lys-Arg-Arg，典型的AMPK靶向序列）的磷酸化效果更明显（图2D）。因此，在体外H2B Ser36是AMPK的一种稳定底物。下一步，我们检验了在体内AMPK是否参与H2B Ser36的磷酸化作用。我们生成了H2B pS36 肽段的抗体而且在体内外大规模的表征化亲和纯化的抗体（补充部分S16）。H2B pS36 会出现在用2-DG处理过的细胞内，因为2-DG会诱导新陈代谢应激，表现在AMPK和ACC磷酸化的增加（图2E），然
15、而其他组蛋白标记包括H3，K9me3 H3和pS10 H3并没有明显的变化（补充部分S17）。在ampk-/-MEFs中，H2B pS36并不会由于2-DG的处理而增加（图2E）。通过两种典型的AMPK激活剂氨基咪唑氨甲酰核苷酸（AICAR）和苯乙基二胍处理细胞后，我们同样观察到类似的H2B pS36诱导（图2F）。另外，在lkb1 -/- MEFs中并无H2B pS36，但是当加入LKB1再次诱导之后会发现H2B pS36增加，而且只有在LKB1存在的情况下2-DG才会刺激H2B pS36。这些结果表示H2B pS36磷酸化过程是体内LKB1-AMPK信号通路响应于广泛的新陈代谢应激的一个下
16、游反应，而且在这一通路中AMPK似乎是最直接的激酶。这一广泛提升的H2B pS36或不仅仅局限于p53靶基因（图1G），因为在p53-/-细胞内H2B pS36的水平并没有减低（补充部分S19）。图2. H2B是AMPK的靶点。（A to D）在ampk-/-MEFs内通过myc-AMPK免疫共沉淀出的人类组蛋白复合体在体外的磷酸化结果。分别用玻璃粉、WT myc-AMPK或催化突变体（D157A）myc-AMPK处理。（右侧为myc Western blot）（A）；在含有葡萄糖及不含葡萄糖处理的细胞内用myc-AMPK得到的人类组蛋白复合体（B）；H2B肽段（C）；H2B 21-42肽段和
17、SAMS肽段（D）。（E）用2-DG(25mM处理10min)处理野生型或ampk-/-MEFs和未处理MEFs的Western blot结果。（F）用AICAR(AIC,2mM)或苯乙基二胍（Ph,3mM）处理1h后MEFs的Western blot结果。我们发现在293T细胞内，转染的myc-AMPK和FLAG-H2B会相互交联应答于AMPK激活剂AICAR（图3A）。而在H2B S36A突变体内这一相互交联却没发生（图3A），说明36位的丝氨酸对AMPK与H2B间的相互作用是至关重要的。然后我们对野生型和ampk-/-MEFs进行了染色质免疫共沉淀实验来检测H2B pS36是不是与AMP
18、K依赖型基因相关联，尤其是在cpt1c启动子上的p53结合位点。应答于2-DG处理和紫外线处理时，H2B pS36染色质免疫共沉淀信号会增加，而且在AMPK缺失细胞内ChIP信号又降回了背景水平（图3B）。图3. 应答于胁迫刺激AMPK和H2B pS36会定位在染色体。（A）WT H2B或H2B S36A表达细胞在AICAR（1mM，24h）处理后myc-AMPK免疫共沉淀物的Western blot。WCL,全细胞裂解液。（B）野生型或ampk-/-MEFs的ChIP结果。Data represent meansSEM for n = 3。（C和D）沿cpt1c基因的ChIP(C)和p21基
19、因（D）。Data represent meansSEM for n = 3。*P 0.01, *P 0.05。我们分别在标准条件和葡萄糖缺失条件下，对cpt1c进行了ChIP，使用的引物都是沿着启动子，转录区和上游或下游非转录区，来对比内源性AMPK和H2B pS36的定位（图3C，引物顺序1-7）。面对胁迫，在p53结合位点的H2B pS36会增多（p53bs，2号引物），在转录起始位点会有更大的增加量（TSS，4号引物），在基因上游区（1号引物），或者这些位点之间的区域（3号引物），及下游都仅仅只有背景水平（7号引物）（图3C）。很明显，H2B pS36的关联性贯穿cpt1c的转录区（5
20、、6号引物）（图3C）。然后，我们使用AMPK2抗体进行了ChIP，发现内源性AMPK和H2B pS36之间的细胞定位存在正相关性，也同样贯穿了转录区（图3C）。关于内源性AMPK和H2B pS36之间的细胞定位，其在p21基因p53结合位点和转录区域也显示出相似的正相关性，但是并没有遍及整个基因而且只应答于低浓度葡萄糖胁迫（图3D）。我们对gapdh基因进行了一个对照实验，结果显示在有应激和没有应激条件的细胞内ChIP并没有信号差异（补充部分S20）。在紫外线胁迫处理后，我们对cpt1c基因进行观察，也得到了相似的结果（补充部分S21）。当应答于低浓度葡萄糖胁迫时，异位表达的myc-AMPK
21、也会沿着p21转录区定位而且需要AMPK催化活力（补充部分S22）。AMPK和H2B pS36细胞内定位的一致性暗含着AMPK在转录调控过程中的作用，AMPK与其靶基因转录区结合的H2B的磷酸化作用相关联。图4. 面对新陈代谢胁迫，H2B Ser36对细胞转录和生存是必需的。数据分别是通过野生型H2B和H2B S36A突变体细胞系获得。（A）单个MEF纯系（H2B，纯系5、6；H2B S36A，纯系4、6）在葡萄糖脱除胁迫后，特定基因的相对表达量（qPCR）。（B）葡萄糖脱除、2-DG(10mM)和苯乙基二胍（3mM）处理后，H2B或H2B S36A MEFs的生存性。（C）RNA聚合酶在cp
22、t1c基因上的ChIP结果。Data represent meansSEM for n = 3。 *P 0.05, *P 0.01, #P 0.03, #P 0.08。我们生成了纯系的MEF细胞系可以稳定的异位表达FLAG-H2B或者突变体FLAG-H2B S36A，结果也如上所述，只有FLAG-H2B可以检测到与H2B pS36抗体有结合（补充部分S16）。通过Western blot检测，FLAG标签的野生型或突变体组蛋白H2B的表达水平都比内源性的H2B要低（补充部分S23）。但是，我们应用ChIP和qPCR检测cpt1c基因的启动子和转录区，发现异位表达的野生型或突变体S36A H2B
23、都能相似的与染色质结合（补充部分S24），而且采用FLAG-H2B免疫共沉淀了内源性的H3和H2B，结果看Western blot（补充部分S25）。我们分离出许多等量表达FLAG-H2B和FLAG-H2B S36A的表达纯系（补充部分S26）。这些细胞系受2-DG处理之后，显示出类似的AMPK水平、AMPK Thr172和pACC Ser79磷酸化诱导作用（补充部分S27），表明通向AMPK的信号并不受S36A突变的影响。当受到脱葡萄糖处理后，野生型FLAG-H2B表达细胞内AMPK靶基因p21，cpt1c，reprimo和cyclinG的转录水平会提升；而在FLAG-H2B S36A表达细
24、胞内这些基因表现出明显的诱导转录降低（图4A）。空白对照基因gapdh和hadh的表达量并没有受到S36A突变的影响（补充部分S28）。因此，尽管FLAG-H2B的表达量相对低于内源性H2B（补充部分S23、S25），但我们仍然在异位表达S36A突变体H2B细胞内观察到了重要且特异性的转录缺陷。下一步我们检测了这些细胞在受到各种新陈代谢应激如脱葡萄糖、2-DG和苯乙基二胍处理后所表现的生存力。我们发现异位表达S36A突变体H2B的细胞在受到这些胁迫时比异位表达野生型H2B的细胞具有更高的细胞死亡率（图4B）。最后我们检测了RNA聚合酶（Pol）在基因上的占位性是不是被异位表达的H2B S36A
25、所改变。ChIP分析显示Pol会存在于整个cpt1c基因，而且当受到葡萄糖脱除胁迫时Pol会增加（图4C）。在FLAG-H2B S36A细胞内，Pol的ChIP信号在cpt1c基因转录区会有所降低，尤其是在受到葡萄糖脱除情况下（图4C）。这些数据意味着AMPK介导的H2B Ser36磷酸化在细胞面对胁迫改善细胞适应性，优化细胞生存能力方面起到关键的转录调控作用。我们的结果表明：AMPK直接与染色质相关联来调节转录过程，这是细胞面临各种新陈代谢应激及环境胁迫时能够生存下来所必需的。哺乳动物AMPK是一种组蛋白激酶，可以优先对组蛋白H2B Ser36磷酸化。在体内，这一位点的磷酸化是高度依赖于LK
26、B1-AMPK能量检测信号通路，而且贯穿于与其靶基因的直接相互作用。AMPK和H2B pS36调控转录作用好像是通过激酶与H2B底物间的直接相互作用来完成。AMPK好像是被如p53这样的转录因子募集到特定的启动子区。AMPK可能会类似地影响其它胁迫诱导的转录活化剂，如Foxo3a，过氧化物酶体增生激活的受体g辅激活蛋白1（PGC-1）和调节CREB活力的转换器2（TORC2）。AMPK磷酸化H2B并与其共同结合在p53结合位点、沿着转录的cpt1c和p21基因。这一模式可能是由于特定的酶募集激活子，然后再由酶沿着转录区运载完成，就如SAGA-Gcn5-Ubp8复合体和H3乙酰化伴随H2B去泛素
27、化所观察到的模式。再就是在转录区，组蛋白甲基化酶类会与RNA聚合酶相关联来修饰H3。我们的发现为转录区的组蛋白磷酸化提供了证据，表明AMPK通过H2B Ser36磷酸化可能在转录延伸过程中起到作用。异位表达的H2B S36A突变体，甚至在高水平的内源性野生型H2B存在的情况下，都会明显的降低AMPK靶基因的转录水平和应激生存力。因此，这一修饰作用可能在转录延伸过程中持续性的发挥作用。当然，H2B Ser36磷酸化会促进RNA聚合酶与转录区的结合。异位表达的组蛋白突变体基因可能对哺乳动物细胞内其它已经受修饰的组蛋白具有长久的解决功效。当细胞内新陈代谢紊乱时，作为真核生物内部分核心能量检测通路的AMPK会维持细胞的能量平衡。我们的数据表明，AMPK修饰H2B磷酸化可能是一个通用的应激-响应通路，来调节特定的转录反应，调节细胞内的新陈代谢过程，提高细胞的生存能力。