[精]生物反应器器背景下细胞培养基的选择和个性化发展方向.doc

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1、技术无止境 服务无止境 - 1 - Its not just the medium, its the sercice.TM 生物反应器背景下生物反应器背景下 细胞培养基的选择和个性化发展方向细胞培养基的选择和个性化发展方向 北京清大天一生物技术有限公司北京清大天一生物技术有限公司/2008/2008 年年 4 4 月月 生物制药核心元素由细胞系/病毒株、细胞培养基、细胞培养技术和生物反应器构成，其中每一个环 节都影响着生物制药行业的发展和生物制药水平的提高，他们是不可分割相互促进的，而其中培养基作 为细胞培养的基础更是起着至关重要的作用。 生物制药生物制药 核心要素核心要素 “培养基培养基虽虽

2、不是不是细细胞培养中唯一重要因素，但确胞培养中唯一重要因素，但确实实是最重要的一种。是最重要的一种。 ” Wurm 博士，瑞士博士，瑞士联联邦科技学会生物工邦科技学会生物工艺艺学教授学教授 Genetic Engineering News （ （2005） ） 生物制药核心技术要素 技术无止境 服务无止境 - 2 - 目目 录录 一一 细胞培养基的选择原则细胞培养基的选择原则3 1根据细胞或病毒特性、培养方式选择合适培养基 .3 2选择高品质的细胞培养基 .4 3从经济性角度选择合适的细胞培养基 .5 二二 个性化培养基是细胞培养基的发展方向个性化培养基是细胞培养基的发展方向5 1细胞培养技术

3、发展需要个性化培养基 .5 2个性化细胞培养基被国际生物制药公司普遍采用 .6 三三 清大天一个性化培养基的应用清大天一个性化培养基的应用7 1反应器微载体培养细胞 .7 2反应器全悬浮培养基细胞培养 .8 3低血清培养基最新应用 .11 4Marc145 细胞 DMEM 培养基14 5二倍体细胞 MEM 培养基15 四四 个性化细胞培养基的研发和生产个性化细胞培养基的研发和生产15 1生产能力 .15 2生产工艺技术 .16 3无动物来源成分声明 .16 4质量标准和检验 .16 5GMP 管理体系16 6ISO9001 管理体系16 7国际 OEM 经验.17 8健全的委托生产管理流程 .

4、17 9核心技术保密管理经验 .17 附录：清大天一个性化细胞培养基产品目录附录：清大天一个性化细胞培养基产品目录18 参考文献参考文献19 技术无止境 服务无止境 - 3 - 一一 细胞培养基的细胞培养基的选择原则选择原则 1根据细胞或病毒特性、培养方式选择合适培养基根据细胞或病毒特性、培养方式选择合适培养基 不同的细胞株和培养条件都有着不同的营养需求，这就需要配一个最优化的细胞培养基，才能够提 高生物制品的产率。 Text in here 选择合适选择合适 的细胞培养基的细胞培养基 培养方式培养方式 细胞特性细胞特性 蛋白表达蛋白表达 或病毒特点或病毒特点 （1）选择基础细胞培养基选择基础

5、细胞培养基 基础培养基的产品配方成分是公开的，并被业界普遍采纳和使用。例如: MEM、DMEM、1640、199、PRMI1640、IMDM、F12 等细胞培养基。 （2）选择在基础细胞培养基成份基础上添加或减少某种成份选择在基础细胞培养基成份基础上添加或减少某种成份 （3）选择个性化细胞培养基选择个性化细胞培养基 存在的问题：存在的问题： 大多数大多数为为50年代的配方年代的配方产产品。品。 不足：不足： 没有本没有本质质改改变变，有，有时还时还可能添加可能添加动动物来源成份。物来源成份。 清大天一清大天一对对常用常用细细胞系在反胞系在反应应器和器和转转瓶中培养的情况，研瓶中培养的情况，研发

6、发相相应应的的细细胞培养基，胞培养基， 以达到更高的以达到更高的细细胞密度、胞密度、细细胞活性等。胞活性等。 生物制生物制药药企企业业提供自身需要的培养基配方，合同委托清大天一建立的提供自身需要的培养基配方，合同委托清大天一建立的“细细胞培胞培 养基委托生养基委托生产产平台平台”， ，进进行委托生行委托生产产或定制生或定制生产产。 。 工工艺艺研研发发、 、GMP管理、无管理、无动动物成份控制、流程管理、保密管理物成份控制、流程管理、保密管理 技术无止境 服务无止境 - 4 - 2选择高品质的细胞培养基选择高品质的细胞培养基 2.12.1 标准标准 细胞培养基产品符合国家化工行业标准。 干燥减

7、重的质量分数干燥减重的质量分数5 pH 渗透压渗透压 微生物限度微生物限度: 细菌细菌200CFU/g 霉菌霉菌50CFU/g 内毒素内毒素10EU/ml 细胞生长细胞生长 澄清度澄清度 细胞培养基细胞培养基 2.22.2 GMP 管理管理 细胞培养基的生产实施 GMP 管理。我国对药品生产实施 GMP 管理，但用于生物制品（药品）生产 的细胞培养基却未纳入其中。细胞培养基作为生物制药的重要原料，从人员、设施与设备、生产过程、 质量控制等方面须严格按 GMP 要求进行生产，这是保障细胞培养基合格产品生产的必要条件。 企企业业自律自律 政府政府监监管管 用用户户要求要求 哺乳类动物细胞培养基哺乳

8、类动物细胞培养基中华人民共和国化工行业标准：中华人民共和国化工行业标准： 北京清大天一生物技北京清大天一生物技术术有限公司起草，有限公司起草，2007年年4月月13日日获获得国家得国家发发展和改革委展和改革委 员员会批准，会批准，2007年年10月月1日正式日正式实实施。施。 该标该标准准对细对细胞培养基的澄清度、胞培养基的澄清度、pH值值、干燥减量、干燥减量、渗透渗透压压、 、细细菌内毒素、微生物菌内毒素、微生物 限度（限度（细细菌数、霉菌数）以及菌数、霉菌数）以及细细胞生胞生长试验长试验等等进进行了行了详细详细的的规规定。定。 提出提出细细胞培养基成分的要求。在胞培养基成分的要求。在药药品

9、申品申报报和管理和管理时时， ，对细对细胞培养基的要求不胞培养基的要求不仅仅 仅仅是名称，更重要的是成分。是名称，更重要的是成分。细细胞培养基的胞培养基的组组成成分才是成成分才是细细胞培养基的核心。胞培养基的核心。 重要意义：重要意义： 提高和提高和稳稳定定细细胞培养基胞培养基产产品的性能和品的性能和质质量，量，给给用用户户提供提供评评判判标标准，准，规规范行范行业发业发 展，从根本上保展，从根本上保证证生物制品的生物制品的质质量。量。 细细胞培养基作胞培养基作为动为动物物细细胞培养技胞培养技术术的一的一项项重要支撑性技重要支撑性技术术， ，对对我国的我国的动动物物细细胞胞 大大规规模培养技模

10、培养技术术的突破性提高能起到关的突破性提高能起到关键键性的促性的促进进作用作用。 培养基行培养基行业业的的 GMP 管理管理 技术无止境 服务无止境 - 5 - 3从经济性角度选择合适的细胞培养基从经济性角度选择合适的细胞培养基 不论是疫苗生产，还是抗体生产，采用高品质、更符合生产实践的个性化细胞培养基，才能从根本 上提高生物制品质量，降低生物制品的综合生产成本。 （1）提高了细胞密度和细胞活力；提高了细胞密度和细胞活力； （2）提高了单位体积培养液中病毒量或抗体表达量，提高了生产效率；提高了单位体积培养液中病毒量或抗体表达量，提高了生产效率； （3）降低了动物来源成分，简化纯化成本，提高了生

11、物制品的安全性。降低了动物来源成分，简化纯化成本，提高了生物制品的安全性。 二二 个性化培养基是细胞培养基的发展方向个性化培养基是细胞培养基的发展方向 随着生物技术的日新月异，生产工艺的不断进步，生物制药企业对生物制品的产率以及安全性提出 了更高的要求，而细胞培养基作为重要的生物制药原材料，其高品质和个性化的重要性就显得尤为突出。 细胞 个性化个性化 高品质高品质 细胞培养基细胞培养基 细胞培养、产品纯细胞培养、产品纯 化等稳定生产工艺化等稳定生产工艺 安全安全 高品质高品质 生物制品生物制品 1细胞培养技术发展需要个性化培养基细胞培养技术发展需要个性化培养基 利用生物反应器培养动物细胞生产生

12、物制品是未来我国疫苗/抗体等生物制药产业发展的重要方向， 而普通培养基无法满足反应器中细胞的高密度培养，也不能够支持反应器独特的培养方式，因此使用适 应反应器培养的个性化培养基、无血清培养基等就成为未来生物制药行业发展的主要趋势。 生物制药企业生物制药企业生物制品生物制品培养基厂家培养基厂家 细胞反应器高密度培养的主要方式：细胞反应器高密度培养的主要方式： 批式培养是指将批式培养是指将细细胞和培养液一次性装入反胞和培养液一次性装入反应应器内，器内，进进行培养，行培养，细细胞不断生胞不断生长长， ，产产物物 也不断形成，也不断形成，经过经过一段一段时间时间反反应应后，将整个反后，将整个反应应系取

13、出。系取出。 流加式操作是指先将一定量的培养液装入反流加式操作是指先将一定量的培养液装入反应应器，在适宜条件下接种器，在适宜条件下接种细细胞，胞，进进行培行培 养，养，细细胞不断生胞不断生长长， ，产产物也不断形成，随着物也不断形成，随着细细胞胞对营对营养物养物质质的不断消耗，新的的不断消耗，新的营营养成分养成分 不断不断补补充至反充至反应应器内，使器内，使细细胞胞进进一步生一步生长长代代谢谢，到反，到反应终应终止止时时取出整个反取出整个反应应系。系。 连续连续灌注式培养是指将灌注式培养是指将细细胞种子和培养液一起加入反胞种子和培养液一起加入反应应器内器内进进行培养。一方面新行培养。一方面新鲜

14、鲜 培养液不断加入反培养液不断加入反应应器内；另一方面又将反器内；另一方面又将反应应液液连续连续不断地取出，使反不断地取出，使反应应条件条件处处于一种于一种 恒定状恒定状态态。 。 技术无止境 服务无止境 - 6 - 目前国内外生物反应器种类较多，应用于生产实际的也不少，其中用得最广泛的为机械搅拌式生物 反应器，如 B.Braun Biostat、BioEngineering 等。 而一次性抛弃式的 WAVE 反应器（GE 生命科学）因易验证、易放大、占地空间小、起步快等鲜明特点 在未来有很大的应用空间。 2个性化细胞培养基被国际生物制药公司普遍采用个性化细胞培养基被国际生物制药公司普遍采用

15、个性化培养基在国外生物制药企业被普遍采用。不同的生物制品，不同的细胞株，不同的生产工艺， 都需要与之对应的个性化细胞培养基来支持。随着生物制药行业的竞争日益激烈，能否及时迅速的占领 市场，同时降低生产成本，提高生产效率，确保生物制品安全就显得尤为重要，而作为生物制药主要原 材料之一的细胞培养基，是否能最大程度的满足生产的需要就成为生物制药企业所面临的主要问题。因 此只有根据自身的生产工艺使用符合自身要求的个性化培养基，才能在瞬息万变的市场中立于不败之地。 世界上很多著名的生物制药公司（如 Amgen、Genetech）往往和培养基企业合作，建立一种“协议 服务”的商业关系，研制最适合自身细胞特

16、点的个性化细胞培养基应用于生产实践，培养基厂家为客户 提供细胞培养基最优化的技术服务以及相关的技术支持，帮助他们最大程度的提高生产效率。台湾的生 物制药企业也根据自己生产工艺和生物制品特点定制无酚红细胞培养基。 国际上，个性化细胞培养基主要是通过细胞培养基的合同定制进行生产的。尽管国内个性化培养基 的研发、生产以及实际应用还处于起步阶段，但清大天一开发研制的个性化培养基通过在生产实践中的 WAVE 抛弃式反抛弃式反应应器是一次性使用的波浪袋生物反器是一次性使用的波浪袋生物反应应器，用以替代器，用以替代传统传统的的 不不锈钢发锈钢发酵罐。其研酵罐。其研发发始于始于 1996 年，并且在年，并且在

17、 1998 年投入商品化生年投入商品化生产产。 。WAVE 反反应应器适用于各种器适用于各种类类型的型的细细胞培养，包括胞培养，包括 CHO、 、NS0、 、杂杂交瘤、植物交瘤、植物细细胞和初胞和初 级级人人类细类细胞株等。温和的波浪式运胞株等。温和的波浪式运动动可以起到良好的供氧和混合的目的，同可以起到良好的供氧和混合的目的，同时时， ， 这这种运种运动动方式所方式所产产生的剪切力也很小，生的剪切力也很小，远远远远小于小于传统传统罐体中用罐体中用搅搅拌或者气升式拌或者气升式 方法所方法所产产生的剪切力；能生的剪切力；能够够支持高密度大支持高密度大规规模模细细胞培养，并且不会形成泡沫和胞培养，

18、并且不会形成泡沫和 剪切力的破坏作用。目前最大的袋子已剪切力的破坏作用。目前最大的袋子已经经放大到放大到 500 升工作体升工作体积积的的规规模。模。 搅拌式生物反应器搅拌式生物反应器 各种各种搅搅拌式生物反拌式生物反应应器的主要区器的主要区别别在于在于搅搅拌器的拌器的结结构。根据构。根据动动物物细细胞培养的特胞培养的特 点，要求点，要求搅搅拌器拌器转动时产转动时产生的剪切力小，混合性能好。生的剪切力小，混合性能好。围绕这围绕这两两项项要求，已开要求，已开发发 了不少型式的了不少型式的搅搅拌器，如拌器，如笼笼式通气式通气搅搅拌生物反反拌生物反反应应器、离心式器、离心式搅搅拌器拌器细细胞培养胞培

19、养 反反应应器等。器等。 技术无止境 服务无止境 - 7 - 应用已取得可喜的成果。 清大天一个性化培养基的应用清大天一个性化培养基的应用 1 1反应器微载体培养细胞反应器微载体培养细胞 1.1 反应器微载体培养反应器微载体培养 Marc145 细胞细胞 细胞培养基：清大天一反应器高密度 Marc145 细胞培养基。 微载体：GE 的 cytodex-1。 在 50 升生物反应器培养 Marc145 细胞，细胞密度可达 3.4106cells/mL。 1.2 Vero 细胞反应器生产狂犬病疫苗细胞反应器生产狂犬病疫苗 某企业使用清大天一高密度培养基（MD503）在反应器中生产人用狂犬病疫苗。

20、细胞培养：细胞培养后期培养液灌流体积可达到 12 个培养体积，细胞维持培养 710 天，密度达到 1107cells/mL 以上。 病毒培养收获：接种狂犬病毒后可连续收液 20 天以上，收获病毒液使用小鼠脑内法检测病毒毒力在 9.0 以上。 疫苗制备：使用工作体积为 10L 的反应器，收获的病毒液制备狂犬疫苗，每罐可制备 23 万人份，疫 苗效力效价在 4IU/瓶以上。 1.3 Vero 细胞反应器微载体培养细胞反应器微载体培养 细胞培养基：清大天一反应器高密度 Vero 培养基。 微载体：GE 的 cytodex-1。 在 5 升 B.Braun 生物反应器灌注培养 Vero 细胞，120h

21、r 时微载体上的细胞如图 3，144hr 细胞密度提 高至 7.1106cells/mL。 0 1 2 3 4 5 6 7 8 050100150200 Time(小时) 细胞密度(106cells/ml) 技术无止境 服务无止境 - 8 - Fig2. 5 升反应器灌注培养升反应器灌注培养 Vero 细胞的生长曲线细胞的生长曲线 2 2反应器全悬浮培养基细胞培养反应器全悬浮培养基细胞培养 2.1 BHK21 反应器全悬浮培养反应器全悬浮培养 细胞培养基：清大天一反应器高密度 BHK21 培养基。 细胞驯化：BHK21 细胞从 10血清逐步驯化至 1.53血清，传代时的 BHK21 细胞密度可

22、达到 2106cells/ml。 细胞培养：在 5 升生物反应器中，悬浮培养的 BHK21 细胞密度超过 1107cells/ml。 Fig3. BHK21细胞的生长曲线细胞的生长曲线 2.2 CHO 细胞全悬浮培养表达人源化单克隆抗体细胞全悬浮培养表达人源化单克隆抗体的研究的研究 细胞株：CHO 工程株（上海某抗体药物公司构建）。 无血清培养基： A：清大天一公司的 SAF-CHO-G-003 B：国外某培养基公司的无血清培养基 实验方法：5105cells/mL 接种，每天计数，留样测定 IgG。 0 2 4 6 8 10 12 14 020406080100 Time(hr) cell

23、density(106cells/ml) BHK21 cell growth curve 0 10 20 30 40 50 60 012345678 Time/d Density/(105/ml) 国外某公司国外某公司 清大天一清大天一 技术无止境 服务无止境 - 9 - A B Fig4.A 细胞密度对比，细胞密度对比，B 细胞活力比较细胞活力比较 批培养的最高细胞密度均可达到批培养的最高细胞密度均可达到 4.5106cells/mL，细胞存活率基本一致，细胞存活率基本一致 Fig5.Fig5. IgG 产量比较抗体浓度：清大天一：产量比较抗体浓度：清大天一：148ug/ml 国外某公司：国

24、外某公司：114ug/ml。清大天一提高。清大天一提高 30。 2.32.3 CHOCHO 细胞细胞 WAVE 反应器全悬浮培养生产人源化抗体的应用反应器全悬浮培养生产人源化抗体的应用 细胞培养基：清大天一无血清无动物组分 CHO 培养基及 CHO 营养添加剂。细胞培养：在 200 升的 WAVE 反应器中悬浮培养 CHO 细胞，活细胞密度达到 1107cells/ml，连续灌注 1 个月以上。抗体表达情况： 抗体表达水平超过进口的无血清培养基。 2.42.4 营养添加剂在流加培养营养添加剂在流加培养 CHOCHO 细胞表达抗体中的作用细胞表达抗体中的作用 分组实验： 批培养：对照培养（con

25、trol） 流加培养：SAF-CHO-Feed-1 营养添加剂 实验方法： 每天取样，计数、测定 IgG 0 40 80 120 160 200 012345678 Time/d IgG/(ug/ml) 50 60 70 80 90 100 012345678 Time/d Viability/% 技术无止境 服务无止境 - 10 - 当细胞密度达到 3106cells/ml 左右时，隔天补加一定量的营养添加剂。 0 30 60 90 120 0246810 time/day Density/(105cells/ml) control feed-1 0 20 40 60 80 100 0246

26、810 time/day viability control feed-1 A B 0 100 200 300 400 0246810 time/day IgG/(ug/ml) control feed-1 C 3 3低血清培养基最新应用低血清培养基最新应用 3.1 低血清低血清 199 培养基（培养基（MD 504）培养）培养 Vero 细胞细胞 低血清 199 培养基（MD 504）在 3 层转瓶中培养 Vero 细胞，血清含量 3，细胞培养 34 天，比 采用进口基础 199 培养基的对照组平均每瓶多 3108个细胞，细胞数量提高 43.5。 （见表 1） MD504 培养基多层瓶培养的

27、病毒滴度高于基础 199 培养基单层瓶培养，收毒次数增加 2 次。 （见表 2） 能降低血清用量 提高细胞密度和细胞活力 提高病毒滴度和收毒次数，适合于多层转瓶生产 表表 1. MD504 和进口和进口 199 培养基培养培养基培养 Vero 细胞的比较细胞的比较 细胞数量（细胞数量（108） 试验批次试验批次 MD 504进口 199 培养基 Fig6.Fig6. CHO 细胞生长和抗体生成情况细胞生长和抗体生成情况 A 细胞密度比较细胞密度比较 B 细胞活力比较细胞活力比较 C 抗体产率比较抗体产率比较 技术无止境 服务无止境 - 11 - 06030912.06.6 7.05.0 060

28、316 6.04.8 06032011.49.0 06032713.08.4 平均数9.96.9 表表 2 三种培养瓶两种培养基的病毒滴度比较三种培养瓶两种培养基的病毒滴度比较 培养瓶类型培养瓶类型 单层瓶单层瓶 （3L） 双层瓶（双层瓶（3L） 三层瓶三层瓶 （3L） 细胞培养基 传统 199 MD502 低血清 MD504 低血清 MD504 一次苗6.866.255.9 二次苗6.97.17.19 三次苗6.97.5 A 组 四次苗7.07.5 一次苗6.56.06.5 二次苗6.836.837.73 三次苗7.07.5 滴 度 B 组 四次苗7.57.83 3.2 BHK21 细胞低血

29、清培养基的适应和低血清培养细胞低血清培养基的适应和低血清培养 以 201 培养基10%血清培养的细胞为对照组，采用分阶段驯化法驯化 BHK21 细胞适应 MEM SLM。结果显示细胞在驯化初期细胞很难适应 MEM SLM，在 56 代后细胞逐渐适应 MEM SLM，细 胞比生长率和细胞活性与对照组相近；并能够筛选出能稳定传代、繁殖较快、能适应大规模生产需要的 细胞，建立生产用细胞种子库。 已适应 MEM SLM 的 BHK21 细胞在血清含量大于 2的情况下均能稳定传代，连续传代均在 30 代 以上，能够满足生产实际需要。添加 5、4和 3血清的试验组细胞均在 48h 达到最大量，细胞产量、

30、细胞活性与对照组差异不大。 进而做 MEM SLM 培养基培养 BHK21 细胞生产口蹄疫疫苗试验，清大天一 MEM SLM 培养基 （MD611）添加 3小牛血清培养 BHK21 细胞，对照基础 MEM 培养基+10小牛血清。连续传代 30 代， 各时间段细胞生长数量均与对照组情况相当。 （见表 3） 接种口蹄疫病毒后，病毒效价不低于对照组，符合疫苗规程；BHK21 细胞在适应 MEM SLM 培养基 （MD611）后，对口蹄疫病毒仍然敏感。 （见表 4） 技术无止境 服务无止境 - 12 - 表表 3 低血清低血清 MEM 培养基培养培养基培养 BHK21 细胞的生长情况（细胞的生长情况（

31、107） 组别组别 细胞接种细胞接种 量（量（0h） 细胞数细胞数 量量 （24h） 细胞数细胞数 量量 （48h） 细胞数细胞数 量量 （72h） 细胞数细胞数 量量 （96h） 连续传代连续传代 次数次数 传统培养基 +10血清（对照组）0.4620.831.862.512.2130 代 MD 611 +2血清0.3870.681.842.201.8630 代 MD 611 +3血清0.4030.7522.282.041.9230 代 表表 4.低血清培养基培养的低血清培养基培养的 BHK21 细胞繁殖口蹄疫病毒的效价细胞繁殖口蹄疫病毒的效价 第一次试验第一次试验第二次试验第二次试验第三次

32、试验第三次试验平均值平均值 组别组别 TCID50LD50TCID50LD50TCID50LD50TCID50LD50 传统培养基 +10血清（对照组）7.58.07.617.677.57.57.547.72 MEM SLM +2血清 7.618.58.178.07.837.677.878.0 MEM SLM +3血清 8.08.337.838.07.617.677.838.0 3.3 不同培养基在猪伪狂犬病活疫苗生产中的应用研究不同培养基在猪伪狂犬病活疫苗生产中的应用研究 利用猪伪狂犬病毒弱毒株 Bartha-K61 进行细胞培养，培养基种类为普通细胞培养基（BD-199）和清 大天一低血清

33、培养基（MEM SLM） 。观察不同细胞培养基维持鸡胚成纤维细胞单层（CEF）生长情况， 并测定病毒产量（TCID50/ml） 。结果在生产条件下，应用低血清培养基（MEM SLM）添加 0.52%新生 犊牛血清，制备的维持液培养细胞单层生长良好，细胞间隙不明显，细胞形态正常。细胞单层接种病毒 培养 18-24 小时左右，有少量细胞形成 CPE，继续培养至 48 小时左右，70%以上细胞产生 CPE，此时病 毒增殖达到高峰，测定病毒产量达到 210-6.75210-7.5TCID50/ ml，符合猪伪狂犬病活疫苗制苗要求，实 际应用低血清培养基制备的活疫苗可有效防制疫苗注射引起的过敏反应。 （

34、见表 5 和表 6） 表表 5. 不同培养基培养不同培养基培养 CEF 细胞生长情况和病毒特异性细胞生长情况和病毒特异性 CPE 形成情况比较形成情况比较 组别维持液种类血清细胞单层生长状态病毒特异性 CPE 形 技术无止境 服务无止境 - 13 - 含量（%）成（18 小时） MEM SLM2% 细胞单层生长状态 优良，无可见细胞 间隙，细胞形态良 好 少量细胞形成少量细胞形成 CPE 试验组 MEM SLM0.5% 细胞单层生长良好， 细胞间隙不明显， 细胞形态正常 少量细胞形成少量细胞形成 CPE BD-1992% 细胞单层生长良好， 细胞之间间隙很少， 形态正常 少量细胞形成少量细胞形

35、成 CPE 对照组 BD-1991% 细胞单层生长状态细胞单层生长状态 变差，形态瘦长，变差，形态瘦长， 细胞间隙增大细胞间隙增大 少量细胞形成少量细胞形成 CPE 表表 6. 不同培养基在猪伪狂犬病活疫苗生产中不同批次细胞毒液的不同培养基在猪伪狂犬病活疫苗生产中不同批次细胞毒液的 TCID50/ ml 比较比较 批次维持液种类维持液血清含量TCID50/ ml BD-1992%210-7.0 060713 MEM-SLM2%210-7.25 BD-1992%210-7.25 060728 MEM-SLM2%210-7.5 BD-1992%210-7.25 060811 MEM-SLM2%21

36、0-7.25 BD-1992%210-7.0 060818 MEM-SLM2%210-7.25 BD-1991%210-6.5 070503 MEM-SLM0.5%210-7.0 BD-1991%210-6.75 070510 MEM-SLM0.5%210-7.25 BD-1991%210-6.25 070523 MEM-SLM0.5%210-6.75 070530BD-1991%210-6.5 技术无止境 服务无止境 - 14 - MEM-SLM0.5%210-7.0 4 4Marc145 细胞细胞 DMEM 培养基培养基 Fig7. 在在 T75 方瓶中培养方瓶中培养 Marc145 细胞

37、，培养基为清大天一细胞，培养基为清大天一 DMEM 培养基培养基 （MD210）+5%血清，血清，72 小时细胞长成致密单层小时细胞长成致密单层 Fig8. 更换培养液为更换培养液为 MD210+2%血清，生长至第血清，生长至第 8 天，细胞仍维持致密单层、高活力状态天，细胞仍维持致密单层、高活力状态 在蓝耳病疫苗实践生产，MD210 比普通 DMEM 培养基的细胞形态更好、分种率更高，并能降低血 清量。 5二倍体细胞二倍体细胞 MEM 培养基培养基 5.1 清大天一清大天一 MEM 培养基（培养基（MD610）和某进口）和某进口 MEM 培养基培养培养基培养 2BS 细胞进行比较细胞进行比较

38、 分种率为 1:2 或 1:4，10%小牛血清，37下培养，平行比较连续传 20 代，逐天每 24 小时显微镜下 观察细胞的生长状况。细胞长致密单层时间相同，但 MD610 培养的 2BS 细胞，细胞上黑点更少，细胞生 长得更为健康。 技术无止境 服务无止境 - 15 - 5.2 清大天一清大天一 MD610 培养基与进口培养基与进口 MEM 培养基以及基础培养基以及基础 MEM 培养基培养培养基培养 KMB17 细胞比较结果细胞比较结果 细胞生长速率更快，获得更高的细胞密度和扩增倍数。 （见表 7） 表表 7. MD 610 和进口和进口 MEM 培养基培养培养基培养 KMB17 细胞的比较

39、细胞的比较 进口进口 MEM 培养基培养基清大天一基础清大天一基础 MEM 培养基培养基MD610 接种密度 （104cells/cm2） 3.83.83.8 第 4 天的细胞密 度 （104cells/cm2） 14.416.822.7 细胞扩增倍数3.74.45.9 四四 个性化细胞培养基的研发和生产个性化细胞培养基的研发和生产 为适应生物制药技术发展需求，清大天一建立了细胞培养基研发和生产平台，承担细胞培养基委托 生产、定制生产业务。 1生产能力生产能力 年产 60 吨粉末细胞培养基生产能力。 单批次批量超过 600 公斤。拥有中国专利的密闭输送、混合工艺技术。 一万级净化生产车间，有效

40、控制细胞培养基产品的微生物限度和细菌内毒素指标。 2生产工艺技术生产工艺技术 粉末细胞培养基生产工艺采用荣君 TM技术，保证委托配方的细胞产品具有良好的溶解性和均一性。 3无动物来源成分声明无动物来源成分声明 清大天一所有类别细胞培养基的原料均不含任何动物来源成分。 清大天一所有类别细胞培养基的生产过程均不接触任何动物来源成分的物质。 清大天一细胞培养基生产线不生产任何含动物来源成分的产品。 4质量标准和检验质量标准和检验 清大天一是中国国家化工行业标准哺乳类动物细胞培养基起草单位，具有细胞培养基产品 技术无止境 服务无止境 - 16 - 质量标准和检验方法的研发和制定能力。 清大天一具有对细

41、胞培养基生产原辅料和成品进行质量检验机构和设备设施。 5GMP 管理体系管理体系 清大天一细胞培养基产品生产实施 GMP 管理。 通过境外生物制药企业的 cGMP 稽核。 6ISO9001 管理体系管理体系 清大天一经过中国质量认证中心的 ISO9001 认证，同时获得国际认证联盟（IQNet）33 个国家和地区 ISO9001 认证。 7国际国际 OEM 经验经验 清大天一有为国外公司 OEM 细胞培养基产品的实际操作经验。 清大天一有为国内公司定制细胞培养基产品的实际操作经验。 8健全的委托生产管理流程健全的委托生产管理流程 项目经理管理制。 GMP 管理规程 委托生产管理规程 委托生产确

42、定生产工艺管理规程 委托生产产品质量标准及检验方法管理规程 委托生产业务流程 9核心技术保密管理经验核心技术保密管理经验 内部内部 保密制度。 核心技术控制办法。 对外对外 签定保密合约，强化违约法律责任。 由委托方提供编号命名的核心成份原料。 技术无止境 服务无止境 - 17 - 附录：清大天一个性化细胞培养基产品目录附录：清大天一个性化细胞培养基产品目录 1改良细胞培养基改良细胞培养基 产品名称产品名称产品代号产品代号特点特点 DMEMMD208 DMEM 培养基的改良低血清培养基，可用于培养基的改良低血清培养基，可用于 CHO 细胞的细胞的 低血清培养。低血清培养。 DMEMMD210改

43、良改良 DMEM，适用于，适用于 Marc145 细胞培养。细胞培养。 199MD502改良改良 199，具有高缓冲性能，提高病毒滴度，具有高缓冲性能，提高病毒滴度 M199MD503 199 培养基的改良低血清培养基。可用于培养基的改良低血清培养基。可用于 VERO 细胞微载体细胞微载体 反应器低血清培养。反应器低血清培养。 199MD504 SLM，199 培养基的改良低血清培养基。可用于培养基的改良低血清培养基。可用于 VERO 细细 胞、地鼠肾细胞的低血清培养。胞、地鼠肾细胞的低血清培养。 199MD505 SLM-BR，199 培养基的改良低血清培养基。可用于培养基的改良低血清培养基

44、。可用于 VERO 细胞微载体反应器低血清培养。细胞微载体反应器低血清培养。 MEMMD610适用于二倍体细胞的培养适用于二倍体细胞的培养 MEMMD611 MEM 培养基的改良低血清培养基。可用于培养基的改良低血清培养基。可用于 BHK21 细胞的细胞的 低血清培养。低血清培养。 MEMMD612适用于二倍体细胞的培养适用于二倍体细胞的培养 不含不含 L-谷氨酰胺谷氨酰胺 2无血清无动物来源组分细胞培养基无血清无动物来源组分细胞培养基 产品名称产品名称产品代号产品代号特点特点 SAF-CHO-G-001SAF106CHO 悬浮细胞生长培养基悬浮细胞生长培养基 不含酚红不含酚红 SAF-CHO

45、-F-001SAF107CHO 细胞培养基添加剂细胞培养基添加剂 不含酚红不含酚红 SAF-NS0-G-001SAF110NS0 细胞抗体药物生产细胞生长细胞抗体药物生产细胞生长 （注：清大天一基（注：清大天一基础础培养基培养基还还有有 BME、 、DMEM、 、DMEM/F-12、 、Fischers、 、199、 、MEM、 、Ham F10、 、Ham F12、 、RPMI 1640 等，具体介等，具体介绍绍可以参照北京清大天一生物技可以参照北京清大天一生物技术术有限公司有限公司 细细胞培养基手册胞培养基手册 版）版） 技术无止境 服务无止境 - 18 - 参考文献参考文献 1 Zhao

46、lie C.Dirk L,Kai I J.High-density culture of recombinant Chinese hamster overay cells producing prothrombin in protein- free medium.Biotechnology Letters,2001,23(10): 767-770 2 Liu C M,Hong L N. Development of a shaking bioreactor system for animal cell cultures.Biochemical Engineering Journal,2001,

47、7(2):121-125 3 Girard P,Jordan M,Tsao M,et alSmall-scale bioreactor system for process development and optimization. Biochemical Engineering Journal,2001(7):117-119 4 DOWD J,WEBER I, RODRIGUEZ B,et al.Predictive control of collow-filter bioreactors for the production of monoclonal AntibodiesJ.Biotec

48、hnol Bioeng,1999,63:484-492. 5 北京清大天一生物技术有限公司，细胞培养基对生物反应器的支持， 生物制药信息2008（2 月）：第二期 58 6 岑小清，房宜康，吴文福.不同培养基在猪伪狂犬病活疫苗生产中的应用研究.中国畜牧医学医学会生物制品学分会， 中国微生物学会兽医微生物学专业委员会学术研讨会论文集.618620 7 刘学荣，董文教，宋玉霞，牟会琴，王晶，王国燕，董金杰，陈苗苗，牟克斌，黄银君.BHK21 细胞低血清培养基的 适应和低血清培养.中国兽医科学 （下） ；第 37 卷；增刊 2007：10301032 8 孙文，毕军，卢颖，曾庆丰，陈雪婷，黄仕和，方

49、志正.50L 生物反应器培养狂犬病毒工艺研究.科技资料汇编, 1996 年-2005 年（总第 21 期） 9 刘学荣，宋玉霞，董文教，魏怀菊，牟会琴，王国燕，王晶董金杰，陈苗苗，蔡芸，牟克斌，黄银君.不同血清浓度 的低血清培养基培养 BHK-21 细胞繁殖某病毒的试验研究.中国兽医科学 （下） ；第 37 卷；增刊 2007：10331037 10张龙，吴春芳，李建林，任伟，王占云，陈春艳，马德标.低血清培养基和常规培养基培养细胞对某病毒增殖影响 的比较.中国兽医科学 （下） ；第 37 卷；增刊 2007：959960 11苏玲，刘学荣，董文教，宋玉霞，牟会琴，王国燕，王晶董金杰，陈苗苗，牟克斌，黄银君.接种