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1、Fas、FasL及Caspase-3在青蒿琥酯诱导人胚肺成纤维细胞凋亡中的作用(题目太大，与实验内容不符)王昌明1，黎宏秀1，黄岚珍2，范才文2（1桂林医学院附属医院，广西桂林541001，桂林医学院科学实验中心）2？摘要 目的探讨青蒿琥酯人胚肺成纤维细胞HFL-I凋亡的作用及其与Fas、FasL、Caspase-3表达的关系，为青蒿琥酯防治肺纤维化提供理论依据。方法 采用CCK-8法检测青蒿琥酯对体外培养的HFL-I细胞的CCK-8法检测细胞增殖的影响，用流式细胞术测定细胞凋亡率; RT-PCR法测定Fas 、FasL、Caspase-3mRNA的表达。结果 青蒿琥酯呈浓度依赖性抑制HFL-
2、I细胞增殖， HFL-I细胞经青蒿琥酯作用后凋亡率明显增加(P99% ，广西桂林南药公司，批号ZA080203），CCK-8试剂，二甲基亚砜(DMSO)，碘化丙啶(PI)，D-MEM/F-12培养基，FBS，胰酶；RNA提取试剂Trizol，反转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit，PCR试剂盒Premix PrimeSTAR HS，引物由上海生物工程有限公司合成。1.2 HFL-I细胞培养 取 HFL-I细胞株，用含10% FBS、1105U/L青霉素及100mg/L链霉素的D-MEM/F-12培养液培养，37、5% CO2培养箱培养，3d换液1次、5-6d传代1次。
3、取4代以上细胞用于下列实验。1.3细胞增殖测定(CCK-8法) 取对数生长期HFL-I细胞接种于96孔培养板中，每孔含细胞5000个，培养24 h后加入适当浓度青蒿琥酯，浓度分别为3.75、7.5、15、30mg/L，每组样本设3个复孔，对照组只加入等体积的培养液，37、5%CO2饱和湿度下培养，继续培养1-7天 在规定的时间内吸去培养液，PBS洗一次，加入含10%CCK-8溶液的无血清培养基100每孔加入10CCK-8溶液100l，继续培养2 h后，取80l用酶标仪于450nm处测定吸光度（A），并绘制生长曲线。1.4流式细胞数术检测细胞凋亡率取对数生长期 HFL-I细胞，用含10% FBS
4、的D-MEM/F-12培养液调整细胞浓度为1106/ml，接种于25 cm2的培养瓶中，5% CO2、37培养箱中培养12 h至贴壁，用含0.5% FBS的D-MEM/F-12培养液培养24 h，使细胞周期同步化。入浓度分别为1、10、100mg/L的青蒿琥酯，对照组加入等体积培养液，每组设3个复孔，作用48h后收集贴壁细胞，制成单细胞悬液，70%乙醇固定，4保存过夜，-20保存(有效期为1周)。检测前用PBS洗去固定液，加入20l RnaseA， 37孵育30min，暗处加PI染液，冰浴30 min，染色后以300目筛网过滤。调整细胞浓度为1105-6/ml后采用流式细胞仪，在波长488 n
5、m下用Multicycle DNA分析软件行凋亡率测定，实验重复3次。1.5 RT-PCR检测Fas 、FasL、Caspase-3基因的表达HFL-I细胞种于6cm板，细胞贴壁并长至80%丰度，换含2%血清培养基（DMEM）培养12h，后加入不同浓度的青蒿琥酯（1、10、100mg/L），设不加药物的阴性对照组），继续培养24h后，用Trizol试剂提取高质量的mRNA。按照反转录试剂盒说明合成cDNA。PCR引物序列如下：人内参-actin：上游引物5-AAGATCCTGACCGAGCGTGG-3，下游引物：5-CAGCACTGTGTTGGCATAGAGG-3，扩增长度300bp， Bax
6、上游引物：5-ATTGGAGATGAACTGGACAA-3，下游引物：5-CCACAAAGATGGTCACTGTC-3，扩增长度454bp，Bcl-2上游引物：5- CAGCTGCACCTGACGCCCTT-3，下游5-GCCTCCGTTATCCTGGATCC-3，扩增长度198bp。1.7统计学方法 采用SPSS10.0统计软件进行统计学处理。计量资料以s，采用方差分析及t检验，率的比较行X2检验，P0.05为差异有显著性。2结果2.1CCK-8比色法检测的结果各实验组随着青蒿琥酯浓度的增大，或作用时间的延长， 450nm光吸收A值越来越小(表1)，青蒿素对人胚肺成纤维细胞的抑制率越来越大（
7、图1）。青蒿琥酯对成纤维细胞增殖的抑制作用具有时间依赖性和浓度依赖性。2.2 青蒿琥酯对HFL-I细胞株凋亡率青蒿琥酯个浓度组（1、10、100mg/L）的细胞凋亡率与对照组比较差异有统计学意义（表1）。2.3青蒿琥酯对HFL-I细胞Fas 、FasL、Caspase-3基因的表达的影响与对照组比较，随着青蒿琥酯浓度的增加，Fas 、FasL、Caspase-3基因表达呈逐渐增强趋势（图2）。图1 青蒿琥酯对人胚肺HFL-I细胞的生长曲线图表1不同浓度青蒿琥酯对体外培养的HFL-I细胞凋亡率的影响Table 1Effect of Artesunate on the cell apoptosis
8、 ratio of HFL-I分 组 n 浓度（mg/L） 凋亡率（%）对照组 9 - 1.10.2青蒿琥酯组 9 1 3.20.1* 9 10 15.20.3* 9 100 35.80.2*与对照组比较*P0.05，*P0.01M: Marker；1:Normal control；2：Artesunate 1mg/L；3：Artesunate 10mg/L；4：Artesunate 100mg/L；图2 青蒿琥酯对HFL-I细胞Fas、FasL 、Caspase-3 mRNA表达的影响3讨论肺纤维化的发生涉及到诸多因素，而成纤维细胞增生或凋亡不足是肺纤维化形成机制中重要的环节，肺内ECM主要
9、由成纤维细胞产生，正常时成纤维细胞处于静息状态，活化时大量增殖，分泌细胞因子，转变为肌成纤维细胞。成纤维细胞的活性在肺纤维化的发生和发展过程中起着重要的作用1。LaPPi-BlancoE等研究发现，肺纤维化患者的开胸肺活检标本中，存在着成纤维细胞和肌成纤维细胞的低凋亡水平2。因此，以成纤维细胞为治疗靶细胞，诱导其凋亡，抑制其过度增殖，是目前肺纤维化治疗研究的一个重要方向 34。青蒿素是1972年我国科研人员首次从菊科植物黄花蒿中分离得到抗疟疾的有效单体，其衍生物包括二氢青蒿素蒿甲醚蒿乙醚和青蒿琥酯，均含有过氧桥结构，属于新型倍半萜内酯化合物。除青蒿琥酯在碱性条件下可溶外，其他青蒿素衍生物均难溶
10、于水5。目前，青蒿素类药物因毒性低、抗疟疾作用强已被WTO批准为在世界范围内治疗脑型疟疾和恶性疟疾的首选药物。近年研究显示，青蒿素类药物尚有多种其他药理作用。徐光兰等6研究发现青蒿琥酯可降低肺纤维化大鼠TGF-1、TNF-的表达,明显减轻肺纤维化程度。本实验亦证实了青蒿琥酯可以抑制人胚肺成纤维细胞增殖、促进其凋亡。细胞凋亡(apoptosis)是机体生长发育、细胞分化和病理状态中细胞自主性死亡；是一系列基因活动引起的级联反应的结果。近年来的研究证明，Fas/ FasL 通路作为细胞凋亡信号转导死亡受体途径的代表性通路，在肺间质纤维化形成中发挥了重要作用7。Fas是细胞表面重要的死亡受体,其与配
11、体FasL 结合,活化并传导凋亡信号,是诱导细胞凋亡的重要途径之一。Fas又称为Apo-1或CD95,是属于肿瘤坏死因子受体/神经生长因子受体( TNFR /NG2FR)家族的I型跨膜糖蛋白。正常情况下Fas高表达于人体的多种组织细胞,如胸腺细胞、成纤维细胞、激活的淋巴细胞等。FasL是Fas在体内的天然配体,属于TNF家族的II型膜蛋白,两者结合可触发caspases 的级联反应引起细胞凋亡8。Caspase,即天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶,根据其结构的同源性分为3个亚家族。Caspase-3家族蛋白酶是介导细胞凋亡的核心酶,其中Caspase-3与凋亡的关系最为密切,参与多种因素诱导的细胞
12、凋亡910 ,有报道认为其可能是细胞凋亡下游的关键执行者11。在死亡受体介导的凋亡途径中，受体Fas与其相应的配体FasL结合后,相对浓度迅速升高,同时与这些受体相关的接头分子FADD、TRADD /FADD的相对浓度也随之升高,从而导致下游信号级联分子caspase-8、caspase- 10以及caspase-3、caspase-6和caspase-7的相继活化(表现为活性浓度相继升高) ,活化的caspase-3 和caspase-7 对DFF45的切割导致核酸酶DFF40的活化,活性浓度增加,从而完成对DNA的剪切引发细胞凋亡12。本研究显示，实验组Fas、Fas、Caspase-3
13、mRNA表达均显著高于对照组，且有逐渐增强的趋势。表明青蒿琥酯能促进Fas、Fas、Caspase-3 mRNA在 HFL-I细胞中的表达，且呈剂量依赖性。提示青蒿琥酯可能通过Fas/FasL介导的死亡受体通路，激活caspase-3级联反应，导致人胚肺成纤维细胞凋亡，此可能为其对抗肺纤维化的机制之一。参考文献（references）1 Selman M，Thanniekal VJ，Pardo A，et al. Idiopathic Pulmonary fibrosis: pathogenesis and therapeutic approaches J. Drugs，2004，64(4):4
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18、 the inhibition of apop tosis J. Brain Pathol, 2000, 10 ( 2 ) :283 - 292.10Hishikawa K, Nakaki T, Fujii T. Connective tissue growth factor induce apop tosis via Caspase - 3 in culturel human aortic smooth muscle cells J . Eur J Pharmacol, 2000, 392 (1 - 2) : 19 - 22.11 LI Jing-yan. Study the relationship of Caspase-3 and tumour J. Medical Reviews, 2005, 11 (5) : 430 - 432.12 LIU Shun-hui，TAO Chang-li，LUO Zhu-he，et al. Dynamic model of cell apoptosis signaling pathway J . Chinese Journal of Pathophysiology，2009, 25 (6) : 1244 1248.7