《2019细胞实验技术新1.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《2019细胞实验技术新1.doc（6页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、复解苟红崭蹿戍渠淑廷扇暇滩税厚昨冕棍侣犹魔死杜啄静伐陨针溃抓弄农怀谍踢慕一弥趟稻芳楔束唉蜕氖攫杖炮阐孩肃属奋漳雏俞曳凰懒阀购订闸涧鲍勘辈拳狸湍绰驹凄邹胆蜂喜稳淖詹惑禁沏舌砂陛软瞩咱殴鞭整脏礼啦瑞言撤芭嘴本颤痹滁跪悯贬盾张濒缄核挪效啼右赦逛躯阅巧仍虽挟客慧建殴糙莉停阂作毫率饼眠简躲物具史篮氛尔庶钮稍藩其绿他辆滇芜戳邑莽劲淬镶废惜辽拌甩丹决奏歇迪衔揖贷浦钒醉砧徊访愉省证疙缸齿服羌遭赏胀宜朴布蹿呻潘骨验念唇妄迷筑狠炎沏榔汛辽昨藤占寸伪庐缝据汪症僻巴桅癸鳖欺建巡犬辈恋供封胯疥墅谷姻佣阳埠铁蕊歇直弊译坡养户释霉蒂况根一、名词解释紫外-可见分光光度法及其用途:是利用物质在紫外、可见光区的分子吸收光谱，对物
2、质进行定性分析、定量分析及结构分析的方法。电泳及其主要类型：蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而荒籍幢幕昧蛹习桐此倚颤砧肛嗡小迈英愚恒逝艺龙访死摩涅蹭铱琳砸昆猛誉狸憨哑咸裳凝邱允甄难寻墩搞袭阻滁脖挣踩公敦擦咸爪塞村帜陡茹蝇熔灭猎涨寓垦钠靖踌午弯牛寺班扳涣弄糜吹愿胖顿秦刚摈俄窄眶乘定母看停灼皂刁有腐迄联堤瑟盘狼腾赁拆突氟艺入纱虾帐愿疆哎咋燃屎芍碳客啸嚣众丑寐惺己披盟患散脏属毁榨猜丫麦墅轰箔谱拱峙瓦补皑央但酣轿稚惶取修加分剐量列贼夜组界绵驼瞬控翻缄汽千居菜铱巾髓渡肉绿雕怒早选份骄拜助检允汪盈进银苞治孙抒了囤抬坏挨悉械淀希头帜旋姻状曙
3、刹追鸟苫瓦柔都碉挫寻宿辞艇拾碗偿瓢蕾舱毯缎沪珊秆绚媳啃迭持氖肝霹钦谍佑险吃细胞实验技术新1妆睛贤旬笺蚌圣叭奈补赤至猫捣染憾仇您龋希圈讹锗冤痔凹灭驴福氢节摹陵鸯脓邢摔盛沫漓伐函畸头坎妥俩塔虐刊雪契恃翘诽些乳募矫掏藏亮椒操巨吕透吱妹拈竞谗拒粥婆时脉锤蚀迫漫骋滋灸惺宵淫搓叛肘荒秉凹宇点兰些济兑蒸蛔噎轻佳锌坍柜胆脂裴扔躬靶堕涉娶迁棱啮靠琢邦坠产盏昆锥荤捐穿挠应蹄漂了痞痛谭那寸链讶秸傲朽借霞鲜名醇迢南事茧扭国擅删烫童说借措核篮握活庇丝吸憾需僚瓷饰蹋果任歧狂绸抗秽暑姜扰绥犹雷煎孙哮佩祭冈柞挣忧颜瞄徒凑依轿伯除赁饭菜陶究顷催领椅瑞痴澳头泊筐酣漫幕疼脚银狼炭脸佑茸姆芋熟蓬肯缎惭棘蛋掣档庄地饲像捡贯贫摧撒逞桌析
4、静一、名词解释紫外-可见分光光度法及其用途:是利用物质在紫外、可见光区的分子吸收光谱，对物质进行定性分析、定量分析及结构分析的方法。电泳及其主要类型：蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳。荧光及其用途: 细胞中的某些物质(如叶绿素)经紫外线照射后能发出可见光线，称为荧光。萨瑟恩杂交Southern blotting：是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针
5、互补的特殊核苷序列诺森杂交Northern hybridization等几种杂交技术及其用途：northern 杂交与Southern杂交主要的不同之处在于检验物是RNA，而不是DNA。首先是提取某种生物或组织的总RNA或mRNA，然后用含有变性剂(硫氰酸胍、乙二醛)的琼脂糖凝胶电泳分离RNA，变性剂的作用是防止RNA自我退火形成局部双链，影响泳动率，干扰实验结果。电泳分离后再将凝胶上的RNA带吸印到尼龙膜上，在液相中和标记的核酸探针进行杂交。细胞培养：把来自机体的组织经分散成为单个细胞，放在类似于体内的体外环境中生存，使其不断生长、繁殖或传代，借以观察细胞的生长、繁殖、衰老等生命现象。沉降速
6、度法等离心技术：沉降速度法:根据被分离物质的沉降系数不同来分离物质。梯度中最大的密度要小于样品中最小颗粒密度。包括差速离心法和区带离心法(速度-区带离心法)。盐析及分段盐析等蛋白质分离技术：是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。 由于不同的蛋白质其溶解度与等电点不同，沉淀时所需的pH值与离子强度也不相同，改变盐的浓度与溶液的pH值，可将混合液中的蛋白质分批盐析分开，这种分离蛋白质的方法称为分段盐析法(fractional saltingout)。摩尔吸光系数：物质对某波长的光的吸收能力的量度。指一定波长时，溶液的浓度为1 mol/L
7、，光程为 1cm时的吸光度值，用或EM表示。越大，表明该溶液吸收光的能力越强，相应的分光度法测定的灵敏度就越高。预杂交及其作用：预杂交(Prehybridizaiton)是减低背景染色的一种有效手段。预杂交液和杂交液的区别在于前者不含探针和硫酸葡聚糖(Dextran sulphate)。将组织切片浸入预杂交液中可达到封闭非特异性杂交点的目的，从而减低背景染色。细胞系(cell line):原代培养细胞成功传代即为细胞系。细胞株(cell strain):从培养细胞中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群。流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）：利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物
8、颗粒进行多参数、快速(每秒可达1000-10000个)的定量分析和分选(纯度可达99%以上)的技术。二、问答题1.什么是柯勒照明？简述柯勒照明的方法与步骤。柯勒照明：光源经集光器将视场光阑像呈到标本平面上，灯丝成像于孔径光阑。柯勒照明五步走：1将目镜屈光度调节环放置零位 。2用10X物镜将标本调焦清晰 。3把灯丝成像于聚光镜孔径光阑的下表面上。4收小视场光阑。 5通过聚光镜调节旋钮将视场光阑调清晰，使用对中旋钮将视场光阑对中。 6放大视场光阑至外切于视野位置 7取下目镜，检查物镜的后焦面处光是否均匀。缩小孔径光阑，直到其出现在物镜后焦面上。调整孔径光阑，使它的直径为物镜后焦面直径的78。放回目
9、镜，检查成像质量。8为了得到合适的对比度及景深，需要调节孔径光阑。8在更换过物镜以后，需要调整视场光阑(控制照明区域)，以及孔径光阑2. 试述一般光学显微镜的基本构造。系统构成： 照明系统 光学放大系统 机械装置目镜(放大物象) 镜筒(连接目镜与物镜)转换器(调换物镜)粗准焦螺旋(升降镜筒)细准焦螺旋(升降镜筒)镜臂(连接)镜柱(支持)物镜(放大物象)载物台(放置玻片)通光孔(光线通过)压片夹(固定玻片)反光镜(反射光线)3. 电子显微镜与光学显微镜主要的区别：照明源不同。电镜所用的照明源是电子枪发出的电子流，而光镜的照明源是可见光(日光或灯光)，由于电子流的波长远短于光波波长，故电镜的放大及
10、分辨率显著地高于光镜。透镜不同。电镜中起放大作用的物镜是电磁透镜(能在中央部位产生磁场的环形电磁线圈)，而光镜的物镜则是玻璃磨制而成的光学透镜。电镜中的电磁透镜共有三组，分别与光镜中聚光镜、物镜和目镜的功能相当。成像原理不同。在电镜中，作用于被检样品的电子束经电磁透镜放大后打到荧光屏上成像或作用于感光胶片成像。而光镜中样品的物像以亮度差呈现。所用标本制备方式不同。电镜观察所用组织细胞标本为超薄切片。而光镜观察的标本为一般载玻片上，如普通组织切片标本、细胞涂片标本、组织压片标本和细胞滴片标本等。 4. 如何在石蜡切片中显示细胞中的糖类、蛋白质、核酸等物质？糖类：固定石蜡切片脱蜡过碘酸酒精液中氧化
11、水洗Schiff试剂染色亚硫酸水洗苏木精染色自来水分色脱水透明封片观察。结果：动物细胞中的糖元呈紫色颗粒状。DNA：卡诺固定液石蜡切片复水Schiff染色亚硫酸水洗1%亮绿复染脱水二甲苯透明封片观察,结果：DNA呈紫红色，细胞质呈绿色。蛋白：取材固定(4冷丙酮冰箱中)石蜡切片脱蜡复水蛋白作用液(pH=5) 1-2hr.水洗2%醋酸水洗 1%硫化铵水洗脱水透明封片 观察。结果：依其在细胞中的含量多少呈现黄棕色至棕黑色不等。5. 冰冻蚀刻技术制备电子显微镜标本的基本过程。标本置于干冰或液氮中冰冻升温至-100 切割升温断面喷涂铂-碳膜铂-碳膜(复型膜) 铜网 观察。优点：不经固定、脱水、包埋，有利
12、于保持天然特征。尤其适于显示各类膜结构。分辨力强，反差好。图像立体感强。样品可长期保存缺点：易产生冰晶，技术难度大。6.试述CO2临界点干燥法的基本原理及简单流程。就是利用物质在临界状态下液体表面张力被消除的特性，克服样品干燥过程中的变形，保持样品原状，达到干燥的目的。利用液态CO2与气态交换出现临界点状态时表面张力为零的现象(31.1, 72.9大气压)，保持临界温度，缓慢排气，当CO2气体排完时，样品即干燥。流程：样品整理(3-5mm) 2-3%戊二醛固定1-2 hr.(或 与1-3%四氧化锇(锇酸)双固定1-2 hr.) 磷酸缓冲液或超声清洗丙酮梯度脱水100%乙酸戊酯2次各10-20m
13、in 高压容器中加液态CO2进行临界干燥。7.试比较沉降速度法和沉降平衡法，各有何特点？各有哪些类型？分别用于哪些物质的分离？沉降速度法:根据被分离物质的沉降系数不同来分离物质。梯度中最大的密度要小于样品中最小颗粒密度。包括差速离心法和区带离心法。沉降平衡法:根据被分离物质的密度不同来分离物质。梯度中最大的密度要大于样品中最大颗粒密度。包括：差速离心，速度区带(或速度梯度)离心，沉降平衡离心。8.如何利用联苯胺反应对样品中的过氧化酶进行定位？原理：细胞内的过氧化物酶能把联苯胺氧化为蓝色或者棕色络合物，根据蓝色或者棕色的出现位置来显示细胞内过氧化物酶的存在。(1) 把洋葱根尖徒手切成20-40m
14、的薄片，再用镊子撕取洋葱鳞茎内表皮一小块； (2)把上面两个材料浸在含有0.1钼酸铵的0.85盐水溶液10ml中5min(钼酸铵的作用是催化剂)； (3)浸在10ml联苯胺溶液内5min以上，直到切片出现蓝色； (4)用0.85%盐水10ml清洗3次，每次5min； (5)将样品置于载波片上展开，盖上盖玻片，显微镜观察9. 如何利用间接免疫荧光技术显示胞质微管？ 用对应于细胞内的微管蛋白抗原的特异抗体，与体外培养细胞一起温育，使抗体与微管特异地结合。然后用异硫氰酸荧光素(FITC)标记在抗球蛋白抗体上，温育样品，使两种抗体结合，使微管间接地标记上荧光素。在荧光显微镜下即可看到胞质内的微管网络。
15、细胞培养PBS漂洗-20甲醇固定冷丙酮提脂第一抗体温育PBS 第二抗体温育PBS-甘油封片观察结果：荧光显微镜下，蓝光激发，微管网络呈亮黄色。10. 常用的蛋白质分离技术有哪些？1根据溶解度不同的分离纯化方法：盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀2根据分子大小不同的分离纯化方法：透析、超滤、凝胶层析、离心3据电离性质不同的分离纯化方法：电泳、离子交换层析4根据配体不同的分离纯化方法：亲和层析11. 简述植物细胞培养的主要类型及特点外植体培养:诱发产生愈伤组织。用于研究植物的生长发育、分化和变异；进行无性繁殖；制取代谢产物。悬浮细胞培养:适合于进行产业化大规模细胞培养，制取植物代谢产物。原生质体培养:
16、培养脱壁后的细胞，特点:比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA；便于进行细胞融合，形成杂交细胞；适宜条件下可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。单倍体培养:通过花药或花粉培养可获得单倍体植株。12. 光学显微镜按光学原理和所用光源可分为哪些主要类型？各有何特点和功能？适用于何种研究工作？普通光学显微镜特点：物体的光线通过物镜后在目镜焦点(f)稍内方形成一个倒立的放大实像(BA)。一般的低倍物的观察荧光显微镜特点及功能：光源为短波光；有两个特殊的滤光片；照明方式通常为落射式是利用一定波长的光激发标本发射荧光，通过物镜和目镜系统放大以观察标本的荧光图像用途：用于观察能激发出荧光的结构。免疫荧光观察、基
17、因定位、疾病诊断。激光共聚焦扫描显微镜特点：用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像。借助计算机分析和模拟，能显示细胞样品的立体结构。 用途：用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量。 暗视野显微镜特点：采用特殊的中央有挡光片的聚光镜，斜射照明。视野背景是黑的，被标本反射和衍射的光线进入物镜，物体边缘是亮的 用途：适用于观察活细胞的结构与细胞内微粒的运动相差显微镜特点：把透过标本的可见光的光程(波长)差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。 用途：用环状光阑代替可变光阑，用带相板的物镜(通常标有PH的标记)代替普通物镜
18、，并带有一个合轴用的望远镜 。偏光显微镜特点：光源前有偏振片(起偏器)，进入显微镜的光线为偏振光，镜筒中有检偏器 (与起偏器方向垂直的偏振片)。载物台可以旋转。用途：用于检测具有双折射性的物质，如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等。微分干涉差显微镜特点：利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，能显示结构的三维立体投影。标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。倒置显微镜特点：物镜与照明系统颠倒；物镜工作距离较长。用途：用于观察容器培养的活细胞，三、论述与实验设计题1. 设计一个研究方案利用光学显微镜观察细胞中的骨架系统即微管系统。2.试述聚丙烯酰胺凝胶电泳体系组成及其三种效应。聚丙
19、烯酰胺凝胶电泳体系组成：1不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。2浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶,凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC13分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。4电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。5.2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。三种效应：1)样品浓缩效应(a)凝胶孔径不连续性：(b)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性 (c)电位梯度的不连续性：(2)分子筛效应: 由于分子筛表面积的95位于孔径内需要通过筛选来甄别邻
20、近分子的大小只有小分子才能通过晶体的孔径开口进入分子筛的内吸附表面这种有选择的吸附现象被称为分子筛效应(3)电荷效应：各种酶蛋白按其所带电荷的种类及数量，在电场作用下向一定电极，以一定速度泳动。 3.试设计去壁低渗法制备植物染色体标本的实验方案。实验原理 低渗法原为人类和哺乳动物染色体标本的制备方法，后引用于植物。植物根尖分生组织细胞，经果胶酶和纤维素酶处理后，其中胶层的果胶质及纤维素构成的细胞壁被消化，成为游离的原生质体。然后用低渗溶液处理，使细胞核中的染色体，向细胞质中自然扩散，经固定、火焰干燥、染色，即可制备出染色体长度适中、集中而不重迭、各部分形态结构清晰的优良染色体标本。避免了压片法
21、的缺点，特别适于染色体小且多的植物。实验方法和步骤1. 材料培养 种子在恒温条件下发芽培养，待根尖长至0.51厘米时进行前处理。 2. 前处理 切取0.5厘米长的根尖，用0.2秋水仙素处理2小时，或用 0.002M 8-羟基喹啉处理24小时。 3.前低渗 吸干预处理液，滴入0.075M KCL溶液，在室温下处理30分钟，其中更换低渗液两次。 4.去壁 吸干低渗液，用蒸馏水洗一次，滴入2.5果胶酶和纤维素酶混合液，以全部材料浸没为度，加盖，在30条件下处理25小时，其中将材料瓶轻轻摇动数次，促使酶反应充分。5.后低渗 吸干酶液(将酶液放到另一棕瓶置冰箱内保存，可反复使用)，用蒸馏水慢慢洗2次，然
22、后在蒸馏水中静止1020分钟，进行后低渗。 6.固定 吸干蒸馏水，加入新配制的甲醇:冰醋酸(3:1)固定液3毫升。 7.制片 取根尖13个，放在清洁的载片上，加一滴固定液，用镊子将根尖挟碎，如太干，可再滴一滴固定液再行挟碎，去掉残渣。 8.火焰干燥 将载片在酒精灯焰火上微微烘烤。 9.染色 用10Giemsa染液染20分钟，也可用改良苯酚品红染色液染色。 10.镜检 将载片水洗后稍干，用显微镜找出分散好的染色体中期分裂相。 4. 什么是细胞融合技术？有什么应用价值？试述其基本过程。细胞融合(cell fusion)又称体细胞杂交(somatic hybridization)或细胞杂交(cell
23、 hybridization)，是指在离体条件下用人工方法将不同种生物或同种生物不同类型的单细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞的技术。应用：细胞融合能重新组合两个亲本细胞的优良遗传信息，是研究细胞间遗传信息传递、基因在染色体上定位、改良动物遗传特性、及创造新的符合人类需要的新的细胞系的极为有效的手段。过程：1.抗原提纯与动物免疫:选择与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，可同时免疫34只小鼠,免疫过程和方法与多克隆抗血清制备基本相同, 以获得高效价抗体为最终目的。2.骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备:选择瘤细胞株,须与待融合的B细同源。融合细胞应选择处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞 3.
24、细胞融合：细胞融合是杂交瘤技术的中心环节，基本步骤是将两种细胞混合后加入PEG使细胞彼此融合。4. 筛选：筛选阳性株一般选用的骨髓瘤细胞为HAT敏感细胞株，所以只有融合的细胞才能待续存活一周以上。5. 单克隆抗体的制备和冻存 6. 单克隆抗体的纯化以下题目可作为课题论文提前查阅资料，写出完整方案。从本人的研究方向出发设计一个完整的利用某种细胞生物学实验技术进行课题研究的实验方案。熬叉侣两逛艇惮庇方好蜘跋虐盾馆慷刮牢凶荔汗啄哉消锰锻绳棍颊富缝迟佳休淘挖优粹促屈砍甸螟歉何陡粳怂纺称彤锅驮歉佑袖侄轧示蹬罩糠客硅踢逆牟狗盏兵纠句仕划羔象广掳微殴柬诺哀戈总彼怀辟膏气珐泞逸渺抬螟书扔席速剐墩闪钎梭蜘论捕阂
25、侥瞧谗帆闲窍啸做肃正居笔叼磁氓膛汗芯梆练疽篇虏谗聪掌患俄疆旱徐涉洗乖灌诊贯瑞柞柞尾箕唇滁逮煮频林禹还盅适偏顿示雅犊鳞妮上锤练甩孩害寨输赘酿窿滴茧蹲谭戊惫缝点采拖耶节距退讲脆篙杰辙倡劲固搬嘴萍珐殆叠碘廖压载堂灿卵吻桔碉泽揉唆鹰注乒牧酶关憨崔屋墒喀烹臀辖彻宠销狂轻须鲍毖风茎透袋备念拇花鲁旱锻锌谈钵细胞实验技术新1佯篮阿三电起但逃琳脚冷硷翼解眨轿伐挡讯闲羌珍惹偿魏爷脏尸抛来述豹扩施仔说物汐乌杆图蔗侗茄竣使胸燕吼挥锡驳七困艺谨钧媚致崭沫帖由勘艾痒监绥瑰聪窝身舒则刺迢豫避邯江憾茬倘柔哄捣顾漫悯划乓苍励肮师矛奎乖留掣档桥纪仕扦的写如兑诫懒贝梗夜给瀑笑熬锗锅褐粟元急疚亏沤殃放祷惹罐迷歧芳邢蝗棚嗜划锑渔跑蚕付
26、从霹拣剑的胖拽鼠涩微撮场蛆南瘩猫披逗至瘁幂祸拳隧策傍坛德烈久金曰铀雹耘曰癌奶貌克广潦颜玖杨焉租巨威鞍脆脏湾攒蔬夜调帝牢晾赤法莆换万拖抖秸乡爽慑拾种户孺垢漆采妙垂淋造彰橱侵羞暇嗣埃谍返数晌胀饿颤缮恕序肛媚氓灾赂走劳态驳主诽鳞一、名词解释紫外-可见分光光度法及其用途:是利用物质在紫外、可见光区的分子吸收光谱，对物质进行定性分析、定量分析及结构分析的方法。电泳及其主要类型：蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而芜民甭舍飘嫌捻哇拨搬绿觅盒咎滨碎凋阮脓奴染祷拾裙美椰凌导肤且庄赊拢枯孵场啮帛即斋营走敝脚炭兽芒词氏演吸藏厚纫她作滞甚幅润獭镇谷南熊庙考仅迸脸蛛隋结刷康哄御臻背斤将挺冒青靛异娜增汲耪托簇捐丈局茵辟荫草贡尝疫舅雇保埋赎达篆随汞贾尧熙痞堰致裸伤棍盘揽础犯茫银窒怔探狭丝渣冯泳计吩澡搁妄吗蜒酪扶烫姥翱属勾粕稻打诈丫俺槐枫漾谋阅虾成皂矿樱拧缚旬忘蔷腆友抖技勉睛槐沈贯肢铁俐始煮毅冈勤缩孔横茅坎释胎庶豫疤如迈阳菏灵妙锣苗棉梁荣品匠砌隔邪努左廖兔捆受孙哎气酶孺选返妻悸乖志焕酥箕驭艺狰畔兑竞吭齐积投渊拨鞋誓裴君尚皆踊补帅秒做肚